Name: easy and reproducible low-density primary culture using frozen stock of embryonic hippocampal neurons
Uploaded: 2023-01-27T14:15:00
Duration: 4 min 26 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Easy and Reproducible Low-Density Primary Culture using Frozen Stock of Embryonic Hippocampal Neurons at JoVE.com

Vi takker Kazumi Kamiyama og Manami Kawada for hjælp med eksperimenter. Dette arbejde blev støttet af JSPS KAKENHI (bevillingsnummer 19K08010 til N.K.) og Japan Agency for Medical Research and Development (AMED) (bevillingsnummer JP19bk0104077 og JP22bm0804024 til T.S.).

1. Pladebelægning
<ol><li>Overtræk en mikroplade med 96 huller med poly-L-lysin (1 mg/ml, fortyndet i 0,1 M boratbuffer [pH: 8,5]; 100 μL/brønd) og inkuber natten over ved 37 °C. BEMÆRK: Overtræk kun de brønde, der skal bruges. I de eksperimenter, der udføres her, anvendes de midterste 60 brønde. Boratbufferen fremstilles ved at blande 50 mM borsyre og 12 mM borat i steriliseret vand.</li>
	<li>Pladen vaskes to gange med steriliseret vand (250 μL/hul).</li>
	<li>Pladen vaskes én gang med frisk dyrkningsmedium uden tilskud (250 μL/hul).</li>
	<li>Tør pladen på en ren bænk i 20 min.</li>
	<li>Pak pladen ind med aluminiumsfolie og opbevar den ved 4 °C indtil brug (gyldig i 1 måned).</li>
</ol>2. Cellesåning
<ol><li>Der tilsættes 50 μL/hul af næringssubstratet til den coatede plade, og den opbevares i en 5 % CO2 -inkubator på 37 °C i 30-1 time. Fyld de perifere brønde med steriliseret vand (200 μL/brønd). BEMÆRK: Dyrkningsmediet fremstilles ved at tilsætte 50x B-27, 400x glutamax og 100 E / ml penicillin / streptomycin til neurobasalmediet (se materialetabellen for detaljer).</li>
	<li>Fjern neuronkryoialet fra væskenitrogentanken. De neuroner, der blev brugt her, var DMSO-kryopræserverede neuroner11.</li>
	<li>Kryovialen nedsænkes i en varmeblok på 37 °C i op til 3 min, og indholdet tøs delvist op. Opvarm ikke cryovial for længe. Overfør indholdet til et 50 ml rør, så snart det er optøet.</li>
	<li>Overfør langsomt neuronkryovialt indhold til et sterilt 50 ml rør dråbevis (50 μL/s) ved hjælp af en 1 ml pipette med en bred porespids.</li>
	<li>Den tomme kryovial skylles med 1 ml dyrkningssubstrat (stuetemperatur; RT). Denne 1 ml dyrkningsmedium overføres fra kryovvæsken dråbevis (50 μl/s) til 50 ml glasset indeholdende cellesuspensionen.</li>
	<li>Tilsæt 9 ml af dyrkningsmediet (RT) til 50 ml røret dråbevis (0,5 ml / s) og gør volumen op til 11 ml. Gentag ikke pipettering, men bland cellesuspensionen langsomt.</li>
	<li>Tæl cellenummeret (brug en celletæller eller et hæmocytometer).</li>
	<li>Al cellesuspensionen overføres til et reservoir, og cellesuspensionen hældes til 96-brøndpladen ved hjælp af en multikanalpipette med brede porespidser (1,0 x 104 celler/hul). For at reducere fordampningen af kulturmediet skal du fylde de perifere brønde med steriliseret vand (trin 2.1). BEMÆRK: Denne undersøgelse bekræfter, at fordampningen af kulturmediet er lille for en 3-ugers kultur uden medium udveksling. Reduktionshastigheden for mediet er 3,6% (n = 120 brønde). Osmolalitetsændringen vil således ikke være drastisk i løbet af 3-ugers inkubationsperioden.</li>
	<li>Inkuber neuronerne i 1-2 timer i en 37 ° C, 5% CO2 inkubator.</li>
	<li>Substratet udskiftes med 100 μL forvarmet dyrkningsmedium (37 °C) pr. hul, og det sættes tilbage i en 5 % CO2 -inkubator på 37 °C (der kræves ingen medieændring under dyrkning).</li>
</ol>3. Ara-C-behandling
<ol><li>Ved 4 dages in vitro (DIV) tilsættes cytosin β-D-arabino-furanosid (Ara-C) til en slutkoncentration på 0,2 μM pr. brønd for at reducere væksten af gliaceller.</li>
</ol>4. Lægemiddelbehandlinger
<ol><li>Ved 21 dage in vitro behandles cellerne med lægemidler af interesse.</li>
	<li>Opbevar pladens temperatur ved 37 °C under lægemiddelbehandling.</li>
	<li>For en positiv kontrol behandles cellerne med 100 μM glutamat (pr. hul til endelig koncentration) i 10 minutter før fiksering.</li>
</ol>5. Fastgørelse
<ol><li>Til fikseringen anvendes 4% paraformaldehyd i 0,1 M fosfatbuffer (100 μL/hul).</li>
	<li>Efter ~20 minutters fiksering vaskes hullerne med fosfatbufret saltvand (PBS; 250 μL/brønd) 2x i 5 minutter hver.</li>
</ol>6. Immuncytokemi
<ol><li>Cellerne vaskes med PBS (250 μL/hul) 1x i 5 min.</li>
	<li>Permeabiliser cellerne med 0,1% Triton X-100 (100 μL/brønd) i PBS i 5 min.</li>
	<li>Cellerne vaskes med PBS (250 μL/hul) 3x i 5 minutter hver.</li>
	<li>Til blokering anvendes 3 % bovint serumalbumin i PBS (PBSA; 100 μL/hul) i 1 time ved RT.</li>
	<li>Inkuber cellerne med anti-drebrin (1:1) og anti-Microtubule Associated Protein 2 (MAP2) (1:000) antistoffer (60 μL/brønd) ved 4 °C natten over.</li>
	<li>Cellerne vaskes med PBS (250 μL/hul) 4x i 5 minutter hver.</li>
	<li>Cellerne inkuberes med passende sekundære antistoffer og 4′,6-diamidino-2-phenylindol, dihydrochlorid (DAPI; 1:1000) i PBSA (60 μL/hul) i 2 timer ved RT.</li>
	<li>Cellerne vaskes med PBS (250 μL/hul) 4x i 5 minutter hver.</li>
	<li>Opbevar cellerne i PBS indeholdende 0,1 % natriumazid (150 μL/hul).</li>
</ol>7. Billedoptagelse og analyse
<ol><li>For at erhverve billederne skal du bruge et passende mikroskop.</li>
	<li>For at identificere neuronernes cellelegemer skal du bruge både MAP2-positive og DAPI-positive regioner.</li>
	<li>For at identificere neuronernes dendritter skal du bruge MAP2-positive signaler uden cellelegemer.</li>
	<li>For at identificere drebrin klynger skal du bruge drebrin-positive signaler langs MAP2 positive dendritter.</li>
</ol>

<ol>
	<li>Banker, G. A., Cowan, W. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rat+hippocampal+neurons+in+dispersed+cell+culture.">Rat hippocampal neurons in dispersed cell culture.</a> Brain Research. 126 (3), 397-342 (1977).</li><li>Kaech, S., Banker, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Culturing+hippocampal+neurons.">Culturing hippocampal neurons.</a> Nature Protocols. 1 (5), 2406-2415 (2006).</li><li>Roppongi, R. T., Champagne-Jorgensen, K. P., Siddiqui, T. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Low-density+primary+hippocampal+neuron+culture.">Low-density primary hippocampal neuron culture.</a> Journal of Visualized Experiments. (122), e55000 (2017).</li><li>Mizui, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Drebrin+E+is+involved+in+the+regulation+of+axonal+growth+through+actin-myosin+interactions.">Drebrin E is involved in the regulation of axonal growth through actin-myosin interactions.</a> Journal of Neurochemistry. 109 (2), 611-622 (2009).</li><li>Mizui, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Myosin+II+ATPase+activity+mediates+the+long-term+potentiation-induced+exodus+of+stable+F-actin+bound+by+drebrin+A+from+dendritic+spines.">Myosin II ATPase activity mediates the long-term potentiation-induced exodus of stable F-actin bound by drebrin A from dendritic spines.</a> PLoS One. 9 (1), 85367 (2014).</li><li>Takahashi, H., Mizui, T., Shirao, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Down-regulation+of+drebrin+A+expression+suppresses+synaptic+targeting+of+NMDA+receptors+in+developing+hippocampal+neurons.">Down-regulation of drebrin A expression suppresses synaptic targeting of NMDA receptors in developing hippocampal neurons.</a> Journal of Neurochemistry. 97, 110-115 (2006).</li><li>Takahashi, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Drebrin-dependent+actin+clustering+in+dendritic+filopodia+governs+synaptic+targeting+of+postsynaptic+density-95+and+dendritic+spine+morphogenesis.">Drebrin-dependent actin clustering in dendritic filopodia governs synaptic targeting of postsynaptic density-95 and dendritic spine morphogenesis.</a> The Journal of Neuroscience. 23 (16), 6586-6595 (2003).</li><li>Yamazaki, H., Sasagawa, Y., Yamamoto, H., Bito, H., Shirao, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CaMKIIbeta+is+localized+in+dendritic+spines+as+both+drebrin-dependent+and+drebrin-independent+pools.">CaMKIIbeta is localized in dendritic spines as both drebrin-dependent and drebrin-independent pools.</a> Journal of Neurochemistry. 146 (2), 145-159 (2018).</li><li>Hanamura, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-content+imaging+analysis+for+detecting+the+loss+of+drebrin+clusters+along+dendrites+in+cultured+hippocampal+neurons.">High-content imaging analysis for detecting the loss of drebrin clusters along dendrites in cultured hippocampal neurons.</a> Journal of Pharmacological and Toxicological Methods. 99, 106607 (2019).</li><li>Mitsuoka, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Assessment+of+NMDA+receptor+inhibition+of+phencyclidine+analogues+using+a+high-throughput+drebrin+immunocytochemical+assay.">Assessment of NMDA receptor inhibition of phencyclidine analogues using a high-throughput drebrin immunocytochemical assay.</a> Journal of Pharmacological and Toxicological Methods. 99, 106583 (2019).</li><li>Ishizuka, Y., Bramham, C. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+simple+DMSO-based+method+for+cryopreservation+of+primary+hippocampal+and+cortical+neurons.">A simple DMSO-based method for cryopreservation of primary hippocampal and cortical neurons.</a> Journal of Neuroscience Methods. 333, 108578 (2020).</li><li>Pischedda, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cryopreservation+of+primary+mouse+neurons:+The+benefit+of+neurostore+cryoprotective+medium.">Cryopreservation of primary mouse neurons: The benefit of neurostore cryoprotective medium.</a> Frontiers in Cellular Neuroscience. 12, 81 (2018).</li><li>Kobayashi, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Impairment+of+ciliary+dynamics+in+an+APP+knock-in+mouse+model+of+Alzheimer's+disease.">Impairment of ciliary dynamics in an APP knock-in mouse model of Alzheimer's disease.</a> Biochemical and Biophysical Research Communications. 610, 85-91 (2022).</li><li>Kobayashi, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Properties+of+primary+cilia+in+melanin-concentrating+hormone+receptor+1-bearing+hippocampal+neurons+in+vivo+and+in+vitro.">Properties of primary cilia in melanin-concentrating hormone receptor 1-bearing hippocampal neurons in vivo and in vitro.</a> Neurochemistry International. 142, 104902 (2021).</li><li>Koganezawa, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=NMDA+receptor-dependent+and+-independent+effects+of+natural+compounds+and+crude+drugs+on+synaptic+states+as+revealed+by+drebrin+imaging+analysis.">NMDA receptor-dependent and -independent effects of natural compounds and crude drugs on synaptic states as revealed by drebrin imaging analysis.</a> The European Journal of Neuroscience. 53 (11), 3548-3560 (2021).</li><li>Mizui, T., Takahashi, H., Sekino, Y., Shirao, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Overexpression+of+drebrin+A+in+immature+neurons+induces+the+accumulation+of+F-actin+and+PSD-95+into+dendritic+filopodia,+and+the+formation+of+large+abnormal+protrusions.">Overexpression of drebrin A in immature neurons induces the accumulation of F-actin and PSD-95 into dendritic filopodia, and the formation of large abnormal protrusions.</a> Molecular and Cellular Neurosciences. 30 (1), 149-157 (2005).</li><li>Sekino, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Activation+of+N-methyl-D-aspartate+receptor+induces+a+shift+of+drebrin+distribution:+disappearance+from+dendritic+spines+and+appearance+in+dendritic+shafts.">Activation of N-methyl-D-aspartate receptor induces a shift of drebrin distribution: disappearance from dendritic spines and appearance in dendritic shafts.</a> Molecular and Cellular Neurosciences. 31 (3), 493-504 (2006).</li><li>Takahashi, H., Yamazaki, H., Hanamura, K., Sekino, Y., Shirao, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Activity+of+the+AMPA+receptor+regulates+drebrin+stabilization+in+dendritic+spine+morphogenesis.">Activity of the AMPA receptor regulates drebrin stabilization in dendritic spine morphogenesis.</a> Journal of Cell Science. 122, 1211-1219 (2009).</li><li>Aoki, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Drebrin+A+is+a+postsynaptic+protein+that+localizes+in+vivo+to+the+submembranous+surface+of+dendritic+sites+forming+excitatory+synapses.">Drebrin A is a postsynaptic protein that localizes in vivo to the submembranous surface of dendritic sites forming excitatory synapses.</a> The Journal of Comparative Neurology. 483 (4), 383-402 (2005).</li><li>Koganezawa, N., Hanamura, K., Sekino, Y., Shirao, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+role+of+drebrin+in+dendritic+spines.">The role of drebrin in dendritic spines.</a> Molecular and Cellular Neurosciences. 84, 85-92 (2017).</li><li>Shirao, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+role+of+drebrin+in+neurons.">The role of drebrin in neurons.</a> Journal of Neurochemistry. 141 (6), 819-834 (2017).</li><li>Sekino, Y., Koganezawa, N., Mizui, T., Shirao, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Role+of+drebrin+in+synaptic+plasticity.">Role of drebrin in synaptic plasticity.</a> Advances in Experimental Medicine and Biology. 1006, 183-201 (2017).</li><li>Togo, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Postsynaptic+structure+formation+of+human+iPS+cell-derived+neurons+takes+longer+than+presynaptic+formation+during+neural+differentiation+in+vitro.">Postsynaptic structure formation of human iPS cell-derived neurons takes longer than presynaptic formation during neural differentiation in vitro.</a> Molecular Brain. 14 (1), 149 (2021).</li></ol>

Tomoaki Shirao er administrerende direktør for AlzMed, Inc. Undersøgelsen blev finansieret af AlzMed, Inc. (500.000 JPY til NK for projektet med titlen "High-throughput analysis of synaptic function").

Et kritisk trin i denne metode er at optø cellesuspensionen. Overførsel af cellesuspensionen, før den bliver for varm, er meget vigtig. For at undgå hurtig ændring af osmolalitet må du dog ikke overføre cellesuspensionen til et stort volumen af mediet på én gang. Dråbevis tilsætning af dyrkningsmediet er også afgørende for at undgå pludselige ændringer i osmotisk tryk.
Neuronerne kan dyrkes i andre kulturbeholdere: 24-brøndplader, 8-brøndkamre, 60 mm skåle eller MED-sonder. I disse tilfælde er det dog nødvendigt at justere den endelige koncentration og tidspunktet for tilsætning af Ara-C. Derudover skal tætheden af neuroner optimeres i forskellige typer eksperimenter. For eksempel kræves kultur med høj densitet til elektrofysiologiske eksperimenter, og i så fald er medieudvekslingen nødvendig to gange om ugen (figur 6). Således kræver en kultur med lav densitet færre trin end en kultur med høj densitet.
Neuronal kultur med lav densitet kræver ofte avancerede teknikker; Brug af klar til brug frosset lager løser imidlertid dette problem. Den beskrevne metode afhænger ikke af en eksperimentators dygtighed. Kvaliteten af frossen bestand er stabil og kan dyrkes stabilt, så længe de opbevares i flydende nitrogen og undgår temperaturændringer i op til 4 år.
Dyrkning af cellerne i 3 uger uden medium udveksling rejser spørgsmålet om, hvorvidt der er betydelige osmolalitetsændringer eller kulturmediefordampning. Vi har dog bekræftet, at fordampningen af kulturmedier er lille (reduktionsrate på 3,6%). Lokaliseringen af synaptiske proteiner og neuronernes morfologi forekommer normal efter 3 uger. Derfor forårsager 3-ugers kultur uden medieudveksling ikke store osmolalitetsændringer, der påvirker betingelserne for de dyrkede neuroner. At holde pladen i en inkubator efter Ara-C-behandling er også et vigtigt punkt, der minimerer fordampning.
Der er ingen begrænsning med hensyn til brugen af de frosne lagerneuroner. Der er dog nogle begrænsninger ved kulturmetoden med lav densitet. Vi bekræftede, at lavdensitetskulturen kunne anvendes til morfologisk observation af neuroner, evaluering af synaptisk funktion og GFP-transfektion. Vi har dog ikke undersøgt levende cellebilleddannelse. Derudover kræves der som nævnt ovenfor højdensitetskultur for at udføre elektrofysiologi.
Synapsemodning tager typisk 3 uger7, og vi kan ikke bekræfte, at de dyrkede neuroner har ordentlige synapser indtil slutningen. Hvis synapsemodningen ikke er god efter 3 uger, bliver vi nødt til at dyrke igen. Ved at kende kvaliteten af neuronerne, inden vi starter eksperimenterne, kan vi redde disse 3 uger. For at udføre eksperimenter effektivt er det derfor bedst at kontrollere kvaliteten af neuronerne på forhånd. Frosne lagre gør det muligt at kontrollere kvaliteten af neuronerne på forhånd. Hvert parti frosne lagre genereres fra et kuld rotter, og vi kan bruge en af lagrene fra hvert parti til en kvalitetskontrol. Drebrin er en god markør for kvalitetskontrol af neuronerne. Som beskrevet akkumuleres drebrin i rygsøjlehovedet i modne neuroner, og det reagerer på synaptisk stimulering. Således kan vi kontrollere kvaliteten af neuronerne i frosne lagre ved at bruge drebrin som markør.
Denne metode kan anvendes til at evaluere virkningen af lægemidler på den synaptiske tilstand. Drebrin exodus fra dendritiske rygsøjler forekommer i de indledende faser af synaptisk plasticitet22. Derfor viser påvisningen af reduktion af drebrinklynge fremkaldt ved lægemiddelbehandling, at lægemidlet stimulerer synapsen og forårsager synaptisk plasticitet. For at identificere, om reduktionen er NMDAR-afhængig, er et eksperiment med 2-amino-5-phosphonovalersyre (APV, en NMDAR-antagonist) nyttigt. Ved hjælp af drebrin som markør bestemmes selv en NMDAR-afhængighed klart10,15. Den beskrevne metode er nyttig i lægemiddelscreeninger, sikkerhedsfarmakologiske undersøgelser og evaluering af synaptisk funktion.

Udviklingen af et in vitro eksperimentelt system, der kan vurdere synaptiske funktioner involveret i læring og hukommelse, er vigtig. Neuronal kultur er et værdifuldt system til evaluering af synaptiske funktioner in vitro. Den neuronale kulturteknik blev først brugt i 1980'erne, og i 1990'erne blev lavdensitetskultur af primære hippocampale neuroner udviklet 1,2,3 til undersøgelse af individuelle neuroner med hensyn til subcellulær lokalisering af proteinkomponenter, proteinhandel, neuronal polaritet, rygsøjlemorfologi, synapseudvikling og plasticitet 4,5,6,7,8 . Der er dog mange trin involveret i denne teknik: parring af dyr, dissekering af embryoner, forberedelse af dyrkningsbeholdere og dyrkning af celler i 3 uger med medieændringer en gang om ugen. Derudover kræver det avancerede teknikker3.
Vi har udviklet frosne bestande af dissocierede hippocampale neuroner fra rotteembryoner 9,10. De frosne lagre af neuroner er klar til brug, og der kræves ingen avancerede teknikker til dyrkning af cellerne11,12. Med andre ord afhænger dyrkning af neuronerne fra frosne lagre ikke af en eksperimentators teknik. Det eliminerer behovet for dyreforsøg (f.eks. tilladelse til dyreforsøg, arrangering af tidsbestemte drægtige dyr og dissekering af rotteembryoner) og reducerer dermed antallet af anvendte dyr. For nylig er højkvalitets, klar til brug frosne lagre af neuroner blevet kommercielt tilgængelige. Her brugte vi kommercielt tilgængelige frosne lagre fra fosterdagen (E) 18 rottehippocampus13,14,15. Dyrkning af neuronerne fra en frossen bestand kræver ikke glia-konditionerede medier eller co-kultur med gliaceller. Almindelige primære kulturmedier uden yderligere serum kan bruges til at dyrke cellerne; derfor kan vi erhverve reproducerbare data. Desuden er der ikke behov for medieudveksling i 3 uger efter cellesåningen, da væksten af gliaceller reduceres (figur 1).
Dendritiske rygsøjler er det postsynaptiske rum i de fleste excitatoriske synapser. De indeholder receptorproteiner, postsynaptiske stilladsproteiner og actin cytoskeletale proteiner. Vi fokuserede på et actinbindende protein drebrin 5,6,7,16,17,18. Drebrin akkumuleres ved rygsøjlehovedet i modne neuroner19, og vi rapporterede drebrin som markør for den synaptiske tilstand 15,17,20,21,22,23. Ved at udføre en analyse med højt indhold ved hjælp af drebrin som udlæsning har vi for nylig rapporteret de hæmmende virkninger af phencyclidinanaloger på N-methyl-D-asparaginsyre-glutamatreceptorer (NMDAR'er)10 og de NMDAR-afhængige virkninger af naturlige forbindelser og rå lægemidler på synaptiske tilstande15.
Her beskriver vi, hvordan man dyrker frosne lagre af neuroner ved lav densitet. Derudover viser vi en drebrin billeddannelsesbaseret evaluering af den synaptiske tilstand ved hjælp af 96-brøndplader.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>96 well plate</td>
			<td>Zeon Corporation</td>
			<td></td>
			<td>Gifted</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96 well plate</td>
			<td>greiner</td>
			<td>655986</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-drebrin antibody (M2F6)</td>
			<td>MBL</td>
			<td>D029-3</td>
			<td>Mouse monoclonal (dilution 1:1)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-MAP2 antibody</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>AB5622</td>
			<td>Rabbit&#160; (dilution 1:1000)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-mouse Alexa Fluor 568</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>A11031</td>
			<td>Dilution 1: 500</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-rabbit Alexa Fluor&#160;</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>A11008</td>
			<td>Dilution 1: 500</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>B-27</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>17504-044</td>
			<td>2 v/v% for MEA plates; 50x for normal plates</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Borax</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>B-9876</td>
			<td>Final concentration 12 mM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Boric acid</td>
			<td>WAKO</td>
			<td>021-02195</td>
			<td>Final concentration 50 mM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine serum albumin</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>12659-100G</td>
			<td>Final concentration: 3% in PBS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Confocal quantitative image cytometer 
			CellVoyager CQ1</td>
			<td>YOKOGAWA</td>
			<td></td>
			<td>Phase contrast images</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cytosine &#946;-D-arabino-furanoside (Ara-C)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>C-6645</td>
			<td>Diluted in dH2O (final concentration: 0.2 &#181;M)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DAPI</td>
			<td>FUJIFILM</td>
			<td>340-07971</td>
			<td>Dilution 1:1000</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GlutaMAX</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>35050-061</td>
			<td>&#160;2.5 mM for MEA plates; 400x for normal plates</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>In Cell Analyzer 2200</td>
			<td>Cytiva</td>
			<td></td>
			<td>Fluorescence images</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Laminin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>114956-81-9</td>
			<td>Final concentration: 20 &#181;g/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Maestro</td>
			<td>Axion Biosystems</td>
			<td></td>
			<td>MEA recordings</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MEA plate</td>
			<td>Axion Biosystems</td>
			<td>M768-tMEA-48W</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Neurobasal</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>21103-049</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde</td>
			<td>nacalai tesque</td>
			<td>26126-25</td>
			<td>Final concentration: 4% in PBS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin/Streptomycin</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15140-122</td>
			<td>&#160;100 U/mL for normal plates</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin/Streptomycin</td>
			<td>nacalai tesque</td>
			<td>26253-84</td>
			<td>100 &#181;g/mL for MEA plates</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>polyethyleimine</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>9002-98-6</td>
			<td>Final concentration: 0.1%</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Poly-L-lysine</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P2636</td>
			<td>Diluted in the borate buffer (final concentration: 1 mg/mL)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SKY Neuron</td>
			<td>AlzMed , Inc.</td>
			<td>ARH001</td>
			<td>1.0 x 106 cells/tube</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium azide</td>
			<td>FUJIFILM</td>
			<td>195-11092</td>
			<td>0.1%</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SodiumL(+)-Glutamate monohydrate</td>
			<td>WAKO</td>
			<td>194-02032</td>
			<td>Diluted in dH2O (final concentrations: 1 &#181;M, 3 &#181;M, 10 &#181;M, 30 &#181;M, 100 &#181;M)</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

easy and reproducible low-density primary culture using frozen stock of embryonic hippocampal neurons

Neuronal kultur er et værdifuldt system til evaluering af synaptiske funktioner og lægemiddelscreeninger. Især tillader en lavdensitetskultur af primære hippocampale neuroner undersøgelsen af individuelle neuroner eller subcellulære komponenter. Vi har vist subcellulær proteinlokalisering i en neuron ved immunocytokemi, neuronal polaritet, synaptisk morfologi og dens udviklingsændring ved hjælp af en primær hippocampus kultur med lav densitet. For nylig er færdige frosne lagre af neuroner blevet kommercielt tilgængelige. Disse frosne lagre af neuroner reducerer den tid, der er nødvendig for at forberede dyreforsøg og bidrager også til reduktionen af antallet af anvendte dyr. Her introducerer vi en reproducerbar primærkulturmetode med lav densitet ved hjælp af en 96-brøndplade. Vi brugte en kommercielt tilgængelig frossen bestand af neuroner fra rottens embryonale hippocampus. Neuronerne kan dyrkes stabilt på lang sigt uden medieændringer ved at reducere væksten af gliaceller på bestemte tidspunkter. Denne analyse med høj kapacitet ved hjælp af kultur med lav densitet muliggør reproducerbare billeddannelsesbaserede evalueringer af synaptisk plasticitet.

Efter protokollen blev neuronerne dyrket i en 96-brøndplade i 21 dage og derefter behandlet med glutamat (figur 1). Neuronerne udviklede sig normalt uden udveksling af kulturmediet i 3 uger (figur 2). Vi behandlede cellerne med flere koncentrationer af glutamat (1 μM, 3 μM, 10 μM, 30 μM og 100 μM fortyndet i steriliseret vand) i 10 minutter og fikserede dem. Immuncytokemi blev udført, og fluorescensbilleder af drebrin og MAP2 blev erhvervet ved hjælp af et automatiseret fluorescensmikroskop med et sCMOS-kamera. Som vist i figur 3 observeres drebrin-positive dendritiske rygsøjler tydeligt langs MAP2-positive dendritter. Det har vist sig, at glutamatstimulering fremkalder Ca2+ tilstrømning gennem NMDAR, hvilket forårsager drebrin exodus fra dendritiske rygsøjler, hvilket resulterer i en reduktion af drebrin klyngetætheder 5,17. Følgelig observerede vi den dosisafhængige reduktion af drebrin clusterdensiteter mod glutamatstimulering10 (figur 4). Som vist i figur 5 er denne metode meget reproducerbar, hvis drebrin anvendes som markør for synaptiske tilstande.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64872/64872fig01.jpg"> Figur 1: Skema af metoden. Neuronerne blev dyrket i en 96-brøndplade i 21 dage og derefter behandlet med glutamat. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64872/64872fig01large.jpg" target="_blank">Klik her for at se en større version af denne figur.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64872/64872fig02.jpg"> Figur 2: Bright-field billeder af dyrkede neuroner ved hjælp af en 96-brønd plade. Fasekontrastbilleder blev opnået fra hvert udviklingstrin (DIV 1, 7, 14, 21) under anvendelse af et konfokal kvantitativt billedcytometer. Skalabjælke: 50 μm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64872/64872fig02large.jpg" target="_blank">Klik her for at se en større version af dette tal.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64872/64872fig03.jpg"> Figur 3: Repræsentative billeder af immunfarvede dyrkede neuroner. (Venstre) Flettede fluorescensbilleder af drebrin (grøn) og MAP2 (rød). Hvert fluorescensbillede af drebrin og MAP2 viste i henholdsvis midterste og højre panel. Hvide rektangler viser området forstørret nedenfor. Skala søjler; Øvre paneler: 50 μm, nederste paneler: 20 μm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64872/64872fig03large.jpg" target="_blank">Klik her for at se en større version af denne figur.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64872/64872fig04.jpg"> Figur 4: Glutamatafhængige dosis-respons-ændringer i normaliseret drebrin cluster density. (A) Repræsentative fluorescensbilleder immunfarvet ved hjælp af drebrin (grøn) og MAP2 (rød) fra brønden, der behandles med 0 μM, 10 μM og 100 μM glutamat (fra venstre mod højre). Skalabjælke: 50 μm. (B) Drebrin klyngetæthed blev normaliseret med gennemsnittet af kontrol (0 μM). 0 μM, N = 58 brønde; 1 μM, N = 46; 3 μM, N = 54; 10 μM, N = 45; 30 μM, N = 54; 100 μM, N = 55, fra 13 eksperimenter med forskellige partier. ** P < 0,01 versus kontrol (0 μM) ved Dunnetts multiple sammenligningstest efter ANOVA. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64872/64872fig04large.jpg" target="_blank">Klik her for at se en større version af denne figur.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64872/64872fig05.jpg"> Figur 5: Glutamatafhængige dosis-respons ændringer i drebrin cluster density. De rå data fra seks eksperimenter ved hjælp af forskellige partier. N = 4 huller for hver koncentration (0 μM, 3 μM, 10 μM, 30 μM og 100 μM). Værdier udtrykkes som middelværdi ± SEM. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64872/64872fig05large.jpg" target="_blank">Klik her for at se en større version af dette tal.</a>
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64872/64872fig06.jpg"> Figur 6: Anvendelse af de frosne lagre af neuroner til elektrofysiologiske eksperimenter. (A) En protokol for elektrofysiologiske eksperimenter med MEA-plader (microelectrode array). Belægning: En dag før plettering af cellerne blev hver 48-brønds MEA-plade forbelagt med en polyethyleneimin (PEI: 0,1%) opløsning og inkuberet i 1 time ved 37 ° C. MEA-pladen blev derefter vasket 3x med steriliseret vand og tørret i 1 time. Derefter blev MEA-pladen opbevaret ved 4 °C natten over. Højdensitetskultur: 50.000 celler / brønd af neuronerne blev belagt på 48-brønds MEA-plader. Cellesåningstrinnet blev udført som beskrevet i afsnit 2 i den ovenfor beskrevne protokol. Laminin (20 μg/ml) tilsat dyrkningsmedium (tilsæt 2 v/v% B-27, 2,5 mM glutamax og 100 μg/ml penicillin/streptomycin til det neurobasale medium) blev anvendt til at belægge neuronerne. Derefter blev neuronerne dyrket ved 37 ° C, 5% CO2 i dyrkningsmediet. Medierne blev udvekslet fuldt ud på DIV 1 med kulturmediet op til DIV 3. Ara-C blev tilføjet ved DIV 4 (endelig 0,2 μM). Fra DIV 5 og frem og 2 gange om ugen blev 50% af medierne skiftet med kulturmediet. Neuronernes aktivitet på hver brønd i MEA-pladen blev registreret med et MEA-system. (B) Spontan neuronal aktivitet blev opnået ved 37 °C under en 5% CO2 atmosfære ved anvendelse af et MEA-system med en samplinghastighed på 12,5 kHz / kanal ved DIV 21. Optagelser fra 4 kanaler ud af de 16 kanaler i en brønd vises. For alle optagelserne blev der anvendt et Butterworth båndpasfilter (200-3.000 Hz). Pilespidser viser tidspunktet for synkroniseret burst-affyring. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64872/64872fig06large.jpg" target="_blank">Klik her for at se en større version af denne figur.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Easy and Reproducible Low-Density Primary Culture using Frozen Stock of Embryonic Hippocampal Neurons at JoVE.com

Easy and Reproducible Low-Density Primary Culture using Frozen Stock of Embryonic Hippocampal Neurons

En klar til brug frosset bestand af neuroner er et kraftfuldt værktøj til evaluering af synaptiske funktioner. Her introducerer vi en let primærkultur med lav densitet fra frosset lager ved hjælp af en 96-brøndplade.

Nem og reproducerbar primærkultur med lav densitet ved hjælp af frossen bestand af embryonale hippocampale neuroner

Neuronal culture is a valuable system for evaluating synaptic functions and drug screenings. In particular, a low-density culture of primary hippocampal ...

De frosne bestande af rotteembryonale neuroner er klar til brug, og der kræves ingen avancerede teknikker til dyrkning af cellerne. Denne teknik er meget let, og du behøver ingen tilladelse til dyreforsøg, arrangere tidsbestemte gravide dyr eller dissekere embryoner. Neuronerne kan dyrkes i andre dyrkningskar og anvendes til andre typer eksperimenter.For eksempel mikroelektrode arrayplader til elektrofysiologiske eksperimenter. Begynd med at belægge en 96-brønds mikroplade med 100 mikroliter poly-L-lysin pr. Brønd. Derefter inkuberes pladerne natten over ved 37 grader Celsius.Ved afslutningen af inkubationen fjernes poly-L-lysinopløsningen. Vask pladerne to gange med steriliseret vand og en gang med tilskudsfrit, frisk dyrkningsmedium. Læg pladerne til tørre.Tørre plader kan pakkes ind og opbevares i op til en måned ved fire grader Celsius. For at starte cellesåning tilsættes 50 mikroliter af kulturmediet til hver brønd i de belagte plader. Fyld de perifere brønde med 200 mikroliter steriliseret vand og inkuber pladen i en time ved 37 grader Celsius med 5% kuldioxid.Fjern hætteglasset med neuron cryo fra beholderen med flydende nitrogen, og anbring det i en varmeblok på 37 grader Celsius for delvist at tø indholdet op. Brug en milliliter pipette med en bred borespids til langsomt at overføre hætteglassets indhold dråbevis til et sterilt 50 ml rør. Skyl det tomme hætteglas med en milliliter stuetemperaturkulturmedium.Overfør skylleopløsningen til 50 ml røret indeholdende cellesuspensionen. Derefter tilsættes ni ml af stuetemperaturkulturmediet dråbevis i 50 ml røret, hvilket udgør volumenet til 11 ml. Efter at have talt cellerne ved hjælp af et hæmocytometer, overføres cellesuspensionen til et reservoir.Brug nu en flerkanalspipette med brede borespidser til at dispensere cellesuspensionen med et sluttal på 1,0 gange 10 til de fire celler pr. brønd i den belagte plade med 96 brønde. Inkuber neuronerne i en til to timer ved 37 grader Celsius under 5% kuldioxid. Udskift derefter kulturmediet med 100 mikroliter forvarmet kulturmedium og inkuber igen på de samme betingelser.Efter fire dage in vitro tilsættes cytosin beta-D-arabinofuranosid i den endelige koncentration på 0,2 mikromolær pr. brønd for at reducere væksten af gliaceller. Placer pladen tilbage i inkubatoren. Efter 21 dage in vitro skal du behandle cellerne med de interessante lægemidler.For at opretholde en positiv kontrol skal du behandle celler med 100 mikromolært glutamat pr. Brønd i 10 minutter ved 37 grader Celsius før fiksering. Før du udfører immunocytokemiske undersøgelser, skal du fastgøre cellerne i 20 minutter ved at erstatte kulturopløsningen med 100 mikroliter paraformaldehyd i hver brønd. Efter fiksering vaskes brøndene to gange med 250 mikroliter fosfatbufret saltvand pr. Brønd i fem minutter hver.I denne undersøgelse blev neuronerne udviklet normalt uden at udveksle kulturmediet i tre uger. Immunhistokemi afslørede drebrin-positive dendritiske rygsøjler langs de MAP2-positive dendritter. Den dosisafhængige reduktion af drebrin cluster densiteter mod glutamatstimulering blev observeret.Transplantationen af cellesuspensionen, før den bliver for varm, er meget vigtig. Den dråbevise tilsætning af kulturmedium er også afgørende for at undgå pludselige ændringer i osmolaritet.

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Dissection and Culture of Commissural Neurons from Embryonic Spinal Cord

Commissural neurons have been widely used to investigate the mechanisms underlying axon guidance during embryonic spinal cord development. The cell bodies ...

Nucleofection and Primary Culture of Embryonic Mouse Hippocampal and Cortical Neurons

Hippocampal and cortical neurons have been used extensively to study central nervous system (CNS) neuronal polarization, axon/dendrite outgrowth, and ...

Bilaminar Co-culture of Primary Rat Cortical Neurons and Glia

Bilaminar Co-kultur Primary Rat Kortikal neuroner og glia

This video will guide you through the process of culturing rat cortical neurons in the presence of a glial feeder layer, a system known as a bilaminar or ...

Isolation and Culture of Hippocampal Neurons from Prenatal Mice

Isolering og dyrkning af hippocampus neuroner fra Prænatal Mus

Primary cultures of rat and murine hippocampal neurons are widely used to reveal cellular mechanisms in neurobiology. By isolating and growing individual ...

Assaying DNA Damage in Hippocampal Neurons Using the Comet Assay

Undersøqelse DNA-skader i hippocampus neuroner Brug af Comet Assay

A number of drugs target the DNA repair pathways and induce cell kill by creating DNA damage. Thus, processes to directly measure DNA damage have been ...

Preparation of Primary Neurons for Visualizing Neurites in a Frozen-hydrated State Using Cryo-Electron Tomography

Udarbejdelse af Primary neuroner til visualisering neurites i frossen hydreret tilstand vha. Cryo-Electron Tomography

Neurites, both dendrites and axons, are neuronal cellular processes that enable the conduction of electrical impulses between neurons. Defining the ...

Calcium Phosphate Transfection of Primary Hippocampal Neurons

Calciumphosphat Transfektion af primær hippocampusneuroner

Calcium phosphate precipitation is a convenient and economical method for transfection of cultured cells. With optimization, it is possible to use this ...

Imaging Dendritic Spines of Rat Primary Hippocampal Neurons using Structured Illumination Microscopy

Imaging dendritiske udløbere af Rat Primær hippocampusneuroner hjælp Structured Illumination Mikroskopi

Dendritic spines are protrusions emerging from the dendrite of a neuron and represent the primary postsynaptic targets of excitatory inputs in the brain. ...

Primary Culture of Mouse Dopaminergic Neurons

Primær Kultur Mouse dopaminerge neuroner

Dopaminergic neurons represent less than 1% of the total number of neurons in the brain. This low amount of neurons regulates important brain functions ...

Isolation, Culture and Long-Term Maintenance of Primary Mesencephalic Dopaminergic Neurons From Embryonic Rodent Brains

Isolation, Kultur og opretholdelse på lang sigt af Primary mesencephaliske dopaminerge neuroner af embryonale Gnavere Brains

Degeneration of mesencephalic dopaminergic (mesDA) neurons is the pathological hallmark of Parkinson&#8217;s diseae. Study of the biological processes ...