Name: easy and reproducible low-density primary culture using frozen stock of embryonic hippocampal neurons
Uploaded: 2023-01-27T14:15:00
Duration: 4 min 26 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Easy and Reproducible Low-Density Primary Culture using Frozen Stock of Embryonic Hippocampal Neurons at JoVE.com

We bedanken Kazumi Kamiyama en Manami Kawada voor hun hulp bij experimenten. Dit werk werd ondersteund door JSPS KAKENHI (Grant Number 19K08010 to N.K.) en Japan Agency for Medical Research and Development (AMED) (Grant Number JP19bk0104077 en JP22bm0804024 to T.S.).

1. Plaatcoating
<ol><li>Bekleed een 96-well microplaat met poly-L-lysine (1 mg/ml, verdund in 0,1 M boraatbuffer [pH: 8,5]; 100 μL/put) en incubeer een nacht bij 37 °C. OPMERKING: Bedek alleen de putten die moeten worden gebruikt. In de experimenten die hier worden uitgevoerd, worden de middelste 60 putten gebruikt. De boraatbuffer wordt bereid door 50 mM boorzuur en 12 mM boraat in gesteriliseerd water te mengen.</li>
	<li>Was de plaat tweemaal met gesteriliseerd water (250 μL/put).</li>
	<li>Was het bord eenmaal met vers kweekmedium zonder supplementen (250 μL/put).</li>
	<li>Droog de plaat op een schone bank gedurende 20 min.</li>
	<li>Wikkel de plaat in met aluminiumfolie en houd deze tot gebruik op 4 °C (1 maand geldig).</li>
</ol>2. Celzaaien
<ol><li>Voeg 50 μL/putje van het kweekmedium toe aan de gecoate plaat en bewaar het in een 37 °C, 5% CO2 incubator gedurende 30 min tot 1 uur. Vul de perifere putten met gesteriliseerd water (200 μL/put). OPMERKING: Het kweekmedium wordt bereid door 50x B-27, 400x Glutamax en 100 U / ml penicilline / streptomycine toe te voegen aan het neurobasale medium (raadpleeg de tabel met materialen voor meer informatie).</li>
	<li>Verwijder het neuron cryoviaal uit de tank met vloeibare stikstof. De neuronen die hier werden gebruikt waren DMSO-gecryopreserveerde neuronen11.</li>
	<li>Dompel het cryoviaal gedurende maximaal 3 minuten onder in een warmteblok van 37 °C en ontdooi de inhoud gedeeltelijk. Warm het cryoviaal niet te lang op. Breng de inhoud over in een buis van 50 ml zodra deze is ontdooid.</li>
	<li>Breng de cryoviale inhoud van het neuron langzaam over naar een steriele buis van 50 ml druppelsgewijs (50 μL / s) met behulp van een pipet van 1 ml met een punt met brede poriën.</li>
	<li>Spoel het lege cryoviaal af met 1 ml van het kweekmedium (kamertemperatuur; RT). Breng deze 1 ml van het kweekmedium over van de cryoviale druppelsgewijze (50 μL/s) naar de buis van 50 ml die de celsuspensie bevat.</li>
	<li>Voeg 9 ml van het kweekmedium (RT) toe aan de buis van 50 ml druppelsgewijs (0,5 ml / s) en vul het volume aan tot 11 ml. Pipetteer niet, maar meng de celsuspensie langzaam.</li>
	<li>Tel het celnummer (gebruik een celteller of een hemocytometer).</li>
	<li>Breng alle celsuspensie over naar een reservoir en doseer de celsuspensie naar de 96-well plaat met behulp van een meerkanaals pipet met brede poriepunten (1,0 x 104 cellen / put). Om de verdamping van het kweekmedium te verminderen, vult u de perifere putten met gesteriliseerd water (stap 2.1). OPMERKING: Deze studie bevestigt dat de kweekmediumverdamping klein is voor een cultuur van 3 weken zonder medium uitwisseling. Het reductiepercentage van het medium is 3,6% (n = 120 putten). De osmolaliteitsverandering zal dus niet drastisch zijn tijdens de incubatietijd van 3 weken.</li>
	<li>Incubeer de neuronen gedurende 1-2 uur in een 37 °C, 5% CO2 incubator.</li>
	<li>Vervang het kweekmedium door 100 μL voorverwarmd kweekmedium (37 °C) per putje en plaats het terug in een 37 °C, 5% CO2-incubator (er is geen mediumverandering vereist tijdens de kweek).</li>
</ol>3. Ara-C behandeling
<ol><li>Voeg na 4 dagen in vitro (DIV) cytosine β-D-arabino-furanoside (Ara-C) toe aan een eindconcentratie van 0,2 μM per put om de groei van gliacellen te verminderen.</li>
</ol>4. Medicamenteuze behandelingen
<ol><li>Behandel na 21 dagen in vitro de cellen met de geneesmiddelen van belang.</li>
	<li>Houd de temperatuur van de plaat op 37 °C tijdens medicamenteuze behandelingen.</li>
	<li>Voor een positieve controle, behandel de cellen met 100 μM glutamaat (per put voor de uiteindelijke concentratie) gedurende 10 minuten vóór de fixatie.</li>
</ol>5. Fixatie
<ol><li>Gebruik voor de fixatie 4% paraformaldehyde in 0,1 M fosfaatbuffer (100 μL/put).</li>
	<li>Was na ~20 min fixatie de putjes met fosfaat gebufferde zoutoplossing (PBS; 250 μL/put) 2x gedurende 5 min elk.</li>
</ol>6. Immunocytochemie
<ol><li>Was de cellen met PBS (250 μL/put) 1x gedurende 5 min.</li>
	<li>Permeabiliseer de cellen met 0,1% Triton X-100 (100 μL/put) in PBS gedurende 5 min.</li>
	<li>Was de cellen met PBS (250 μL/putje) 3x gedurende 5 min elk.</li>
	<li>Gebruik voor blokkering 3% runderserumalbumine in PBS (PBSA; 100 μL/put) gedurende 1 uur bij RT.</li>
	<li>Incubeer de cellen met anti-drebrin (1:1) en anti-Microtubule Associated Protein 2 (MAP2) (1:000) antilichamen (60 μL/put) bij 4 °C 's nachts.</li>
	<li>Was de cellen met PBS (250 μL/put) 4x gedurende 5 minuten per stuk.</li>
	<li>Incubeer de cellen met geschikte secundaire antilichamen en 4′,6-diamidino-2-fenythoon, dihydrochloride (DAPI; 1:1000) in PBSA (60 μL/put) gedurende 2 uur bij RT.</li>
	<li>Was de cellen met PBS (250 μL/put) 4x gedurende 5 minuten per stuk.</li>
	<li>Bewaar de cellen in PBS met 0,1% natriumazide (150 μL/put).</li>
</ol>7. Beeldacquisitie en -analyse
<ol><li>Om de beelden te verkrijgen, gebruikt u een geschikte microscoop.</li>
	<li>Om de cellichamen van neuronen te identificeren, gebruikt u zowel MAP2-positieve als DAPI-positieve regio's.</li>
	<li>Om de dendrieten van neuronen te identificeren, gebruikt u MAP2-positieve signalen zonder cellichamen.</li>
	<li>Om drebrinclusters te identificeren, gebruikt u drebrin-positieve signalen langs MAP2-positieve dendrieten.</li>
</ol>

<ol>
	<li>Banker, G. A., Cowan, W. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rat+hippocampal+neurons+in+dispersed+cell+culture.">Rat hippocampal neurons in dispersed cell culture.</a> Brain Research. 126 (3), 397-342 (1977).</li><li>Kaech, S., Banker, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Culturing+hippocampal+neurons.">Culturing hippocampal neurons.</a> Nature Protocols. 1 (5), 2406-2415 (2006).</li><li>Roppongi, R. T., Champagne-Jorgensen, K. P., Siddiqui, T. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Low-density+primary+hippocampal+neuron+culture.">Low-density primary hippocampal neuron culture.</a> Journal of Visualized Experiments. (122), e55000 (2017).</li><li>Mizui, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Drebrin+E+is+involved+in+the+regulation+of+axonal+growth+through+actin-myosin+interactions.">Drebrin E is involved in the regulation of axonal growth through actin-myosin interactions.</a> Journal of Neurochemistry. 109 (2), 611-622 (2009).</li><li>Mizui, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Myosin+II+ATPase+activity+mediates+the+long-term+potentiation-induced+exodus+of+stable+F-actin+bound+by+drebrin+A+from+dendritic+spines.">Myosin II ATPase activity mediates the long-term potentiation-induced exodus of stable F-actin bound by drebrin A from dendritic spines.</a> PLoS One. 9 (1), 85367 (2014).</li><li>Takahashi, H., Mizui, T., Shirao, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Down-regulation+of+drebrin+A+expression+suppresses+synaptic+targeting+of+NMDA+receptors+in+developing+hippocampal+neurons.">Down-regulation of drebrin A expression suppresses synaptic targeting of NMDA receptors in developing hippocampal neurons.</a> Journal of Neurochemistry. 97, 110-115 (2006).</li><li>Takahashi, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Drebrin-dependent+actin+clustering+in+dendritic+filopodia+governs+synaptic+targeting+of+postsynaptic+density-95+and+dendritic+spine+morphogenesis.">Drebrin-dependent actin clustering in dendritic filopodia governs synaptic targeting of postsynaptic density-95 and dendritic spine morphogenesis.</a> The Journal of Neuroscience. 23 (16), 6586-6595 (2003).</li><li>Yamazaki, H., Sasagawa, Y., Yamamoto, H., Bito, H., Shirao, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CaMKIIbeta+is+localized+in+dendritic+spines+as+both+drebrin-dependent+and+drebrin-independent+pools.">CaMKIIbeta is localized in dendritic spines as both drebrin-dependent and drebrin-independent pools.</a> Journal of Neurochemistry. 146 (2), 145-159 (2018).</li><li>Hanamura, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-content+imaging+analysis+for+detecting+the+loss+of+drebrin+clusters+along+dendrites+in+cultured+hippocampal+neurons.">High-content imaging analysis for detecting the loss of drebrin clusters along dendrites in cultured hippocampal neurons.</a> Journal of Pharmacological and Toxicological Methods. 99, 106607 (2019).</li><li>Mitsuoka, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Assessment+of+NMDA+receptor+inhibition+of+phencyclidine+analogues+using+a+high-throughput+drebrin+immunocytochemical+assay.">Assessment of NMDA receptor inhibition of phencyclidine analogues using a high-throughput drebrin immunocytochemical assay.</a> Journal of Pharmacological and Toxicological Methods. 99, 106583 (2019).</li><li>Ishizuka, Y., Bramham, C. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+simple+DMSO-based+method+for+cryopreservation+of+primary+hippocampal+and+cortical+neurons.">A simple DMSO-based method for cryopreservation of primary hippocampal and cortical neurons.</a> Journal of Neuroscience Methods. 333, 108578 (2020).</li><li>Pischedda, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cryopreservation+of+primary+mouse+neurons:+The+benefit+of+neurostore+cryoprotective+medium.">Cryopreservation of primary mouse neurons: The benefit of neurostore cryoprotective medium.</a> Frontiers in Cellular Neuroscience. 12, 81 (2018).</li><li>Kobayashi, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Impairment+of+ciliary+dynamics+in+an+APP+knock-in+mouse+model+of+Alzheimer's+disease.">Impairment of ciliary dynamics in an APP knock-in mouse model of Alzheimer's disease.</a> Biochemical and Biophysical Research Communications. 610, 85-91 (2022).</li><li>Kobayashi, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Properties+of+primary+cilia+in+melanin-concentrating+hormone+receptor+1-bearing+hippocampal+neurons+in+vivo+and+in+vitro.">Properties of primary cilia in melanin-concentrating hormone receptor 1-bearing hippocampal neurons in vivo and in vitro.</a> Neurochemistry International. 142, 104902 (2021).</li><li>Koganezawa, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=NMDA+receptor-dependent+and+-independent+effects+of+natural+compounds+and+crude+drugs+on+synaptic+states+as+revealed+by+drebrin+imaging+analysis.">NMDA receptor-dependent and -independent effects of natural compounds and crude drugs on synaptic states as revealed by drebrin imaging analysis.</a> The European Journal of Neuroscience. 53 (11), 3548-3560 (2021).</li><li>Mizui, T., Takahashi, H., Sekino, Y., Shirao, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Overexpression+of+drebrin+A+in+immature+neurons+induces+the+accumulation+of+F-actin+and+PSD-95+into+dendritic+filopodia,+and+the+formation+of+large+abnormal+protrusions.">Overexpression of drebrin A in immature neurons induces the accumulation of F-actin and PSD-95 into dendritic filopodia, and the formation of large abnormal protrusions.</a> Molecular and Cellular Neurosciences. 30 (1), 149-157 (2005).</li><li>Sekino, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Activation+of+N-methyl-D-aspartate+receptor+induces+a+shift+of+drebrin+distribution:+disappearance+from+dendritic+spines+and+appearance+in+dendritic+shafts.">Activation of N-methyl-D-aspartate receptor induces a shift of drebrin distribution: disappearance from dendritic spines and appearance in dendritic shafts.</a> Molecular and Cellular Neurosciences. 31 (3), 493-504 (2006).</li><li>Takahashi, H., Yamazaki, H., Hanamura, K., Sekino, Y., Shirao, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Activity+of+the+AMPA+receptor+regulates+drebrin+stabilization+in+dendritic+spine+morphogenesis.">Activity of the AMPA receptor regulates drebrin stabilization in dendritic spine morphogenesis.</a> Journal of Cell Science. 122, 1211-1219 (2009).</li><li>Aoki, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Drebrin+A+is+a+postsynaptic+protein+that+localizes+in+vivo+to+the+submembranous+surface+of+dendritic+sites+forming+excitatory+synapses.">Drebrin A is a postsynaptic protein that localizes in vivo to the submembranous surface of dendritic sites forming excitatory synapses.</a> The Journal of Comparative Neurology. 483 (4), 383-402 (2005).</li><li>Koganezawa, N., Hanamura, K., Sekino, Y., Shirao, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+role+of+drebrin+in+dendritic+spines.">The role of drebrin in dendritic spines.</a> Molecular and Cellular Neurosciences. 84, 85-92 (2017).</li><li>Shirao, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+role+of+drebrin+in+neurons.">The role of drebrin in neurons.</a> Journal of Neurochemistry. 141 (6), 819-834 (2017).</li><li>Sekino, Y., Koganezawa, N., Mizui, T., Shirao, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Role+of+drebrin+in+synaptic+plasticity.">Role of drebrin in synaptic plasticity.</a> Advances in Experimental Medicine and Biology. 1006, 183-201 (2017).</li><li>Togo, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Postsynaptic+structure+formation+of+human+iPS+cell-derived+neurons+takes+longer+than+presynaptic+formation+during+neural+differentiation+in+vitro.">Postsynaptic structure formation of human iPS cell-derived neurons takes longer than presynaptic formation during neural differentiation in vitro.</a> Molecular Brain. 14 (1), 149 (2021).</li></ol>

Tomoaki Shirao is de CEO van AlzMed, Inc. De studie werd gefinancierd door AlzMed, Inc. (500.000 JPY aan NK voor het project getiteld "High-throughput analysis of synaptic function").

Een cruciale stap in deze methode is het ontdooien van de celsuspensie. Overdracht van de celsuspensie voordat deze te warm wordt, is erg belangrijk. Om de snelle verandering van osmolaliteit te voorkomen, moet u de celsuspensie echter niet in één keer overbrengen naar een groot volume van het medium. Druppelsgewijze toevoeging van het kweekmedium is ook cruciaal om plotselinge veranderingen in osmotische druk te voorkomen.
De neuronen kunnen worden gekweekt in andere kweekvaten: 24-well platen, 8-well kamers, 60 mm schotels of MED-sondes. In die gevallen moeten echter de uiteindelijke concentratie en het tijdstip van de toevoeging van Ara-C worden aangepast. Bovendien moet de dichtheid van neuronen worden geoptimaliseerd in verschillende soorten experimenten. Voor elektrofysiologische experimenten is bijvoorbeeld een cultuur met hoge dichtheid vereist en in dat geval is de media-uitwisseling twee keer per week nodig (figuur 6). Een cultuur met een lage dichtheid vereist dus minder stappen dan een cultuur met een hoge dichtheid.
Neuronale cultuur met lage dichtheid vereist vaak geavanceerde technieken; het gebruik van kant-en-klare bevroren voorraad lost dit probleem echter op. De beschreven methode is niet afhankelijk van de vaardigheid van een experimentator. De kwaliteit van bevroren voorraad is stabiel en kan stabiel worden gekweekt zolang ze worden opgeslagen in vloeibare stikstof en temperatuurveranderingen tot 4 jaar vermijden.
Het kweken van de cellen gedurende 3 weken zonder medium uitwisseling roept de vraag op of er significante osmolaliteitsveranderingen of cultuurmediaverdamping zijn. We hebben echter bevestigd dat de verdamping van de cultuurmedia klein is (reductiepercentage van 3,6%). De lokalisatie van synaptische eiwitten en de morfologie van de neuronen lijken na 3 weken normaal. Daarom veroorzaakt een cultuur van 3 weken zonder media-uitwisseling geen grote osmolaliteitsveranderingen die de omstandigheden van de gekweekte neuronen beïnvloeden. Het bewaren van de plaat in een couveuse na ara-c behandeling is ook een belangrijk punt dat verdamping minimaliseert.
Er is geen beperking met betrekking tot het gebruik van de bevroren voorraadneuronen. Er zijn echter enkele beperkingen van de cultuurmethode met lage dichtheid. We bevestigden dat de lage-dichtheidscultuur kon worden toegepast voor morfologische observatie van neuronen, evaluatie van synaptische functie en GFP-transfectie. We hebben echter geen live cell imaging onderzocht. Bovendien is, zoals hierboven vermeld, cultuur met hoge dichtheid vereist om elektrofysiologie uit te voeren.
Synapsrijping duurt meestal 3 weken7, en we kunnen niet bevestigen dat de gekweekte neuronen tot het einde de juiste synapsen hebben. Als de synapsrijping na 3 weken niet goed is, zouden we opnieuw moeten kweken. Door de kwaliteit van de neuronen te kennen voordat we met de experimenten beginnen, kunnen we deze 3 weken besparen. Daarom, om experimenten efficiënt uit te voeren, is het het beste om de kwaliteit van de neuronen van tevoren te controleren. Bevroren voorraden maken het mogelijk om vooraf de kwaliteit van de neuronen te controleren. Elke partij bevroren voorraden wordt gegenereerd uit één nest ratten en we kunnen een van de voorraden van elke batch gebruiken voor een kwaliteitscontrole. Drebrin is een goede marker voor de kwaliteitscontrole van de neuronen. Zoals beschreven, hoopt drebrine zich op in het hoofd van de wervelkolom in volwassen neuronen en reageert het op synaptische stimulatie. Zo kunnen we de kwaliteit van de neuronen in bevroren voorraden controleren door drebrin als marker te gebruiken.
Deze methode kan worden toegepast om het effect van geneesmiddelen op de synaptische toestand te evalueren. De uittocht van drebrin uit dendritische stekels vindt plaats tijdens de beginfase van synaptische plasticiteit22. Daarom toont de detectie van drebrineclusterreductie veroorzaakt door medicamenteuze behandeling aan dat het medicijn de synaps stimuleert en synaptische plasticiteit veroorzaakt. Om te bepalen of de reductie NMDAR-afhankelijk is, is bovendien een experiment met 2-amino-5-fosfonovalerzuur (APV, een NMDAR-antagonist) nuttig. Met drebrin als marker wordt zelfs een NMDAR-afhankelijkheid duidelijk bepaald10,15. De beschreven methode is nuttig bij geneesmiddelenscreenings, veiligheidsfarmacologische studies en evaluatie van de synaptische functie.

De ontwikkeling van een in vitro experimenteel systeem dat synaptische functies kan beoordelen die betrokken zijn bij leren en geheugen is belangrijk. Neuronale cultuur is een waardevol systeem voor het evalueren van synaptische functies in vitro. De neuronale kweektechniek werd voor het eerst gebruikt in de jaren 1980 en in de jaren 1990 werd een cultuur met lage dichtheid van primaire hippocampusneuronen ontwikkeld 1,2,3 voor de studie van individuele neuronen in termen van subcellulaire lokalisatie van eiwitcomponenten, eiwithandel, neuronale polariteit, morfologie van de wervelkolom, synapsontwikkeling en plasticiteit 4,5,6,7,8 . Er zijn echter veel stappen betrokken bij deze techniek: het paren van dieren, het ontleden van embryo's, het voorbereiden van kweekvaten en het kweken van cellen gedurende 3 weken met mediaveranderingen eenmaal per week. Bovendien vereist het geavanceerde technieken3.
We hebben bevroren voorraden van gedissocieerde hippocampusneuronen ontwikkeld van rattenembryo's 9,10. De bevroren voorraden neuronen zijn klaar voor gebruik en er zijn geen geavanceerde technieken nodig voor het kweken van de cellen11,12. Met andere woorden, het kweken van de neuronen uit bevroren voorraden is niet afhankelijk van de techniek van een experimentator. Het elimineert de noodzaak van dierproeven (bijvoorbeeld toestemming voor dierproeven, het regelen van getimede drachtige dieren en het ontleden van rattenembryo's), waardoor het aantal gebruikte dieren wordt verminderd. Onlangs zijn hoogwaardige, kant-en-klare bevroren voorraden neuronen commercieel beschikbaar geworden. Hier gebruikten we commercieel verkrijgbare diepvriesvoorraden vanaf de embryonale dag (E) 18 rat hippocampus 13,14,15. Het kweken van de neuronen uit een bevroren voorraad vereist geen glia-geconditioneerde media of co-kweek met gliacellen. Gewone primaire kweekmedia zonder extra serum kunnen worden gebruikt om de cellen te kweken; zo kunnen we reproduceerbare gegevens verkrijgen. Bovendien is er gedurende 3 weken na het zaaien van de cel geen behoefte aan media-uitwisseling, omdat de groei van gliacellen wordt verminderd (figuur 1).
Dendritische stekels zijn het postsynaptische compartiment van de meeste exciterende synapsen. Ze bevatten receptoreiwitten, postsynaptische steigereiwitten en actinecytoskeletale eiwitten. We concentreerden ons op een actinebindend eiwit drebrin 5,6,7,16,17,18. Drebrin hoopt zich op aan het hoofd van de wervelkolom in volwassen neuronen19, en we rapporteerden drebrin als een marker voor de synaptische toestand 15,17,20,21,22,23. Door een analyse met een hoog gehalte uit te voeren met drebrin als uitlezing, hebben we onlangs de remmende effecten van fencyclidine-analogen op N-methyl-D-asparaginezuur-type glutamaatreceptoren (NMDARs)10 en de NMDAR-afhankelijke effecten van natuurlijke verbindingen en ruwe geneesmiddelen op synaptische toestandengemeld 15.
Hier beschrijven we hoe bevroren voorraden neuronen met een lage dichtheid kunnen worden gekweekt. Daarnaast tonen we een op drebrin imaging gebaseerde evaluatie van de synaptische toestand met behulp van 96-well platen.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>96 well plate</td>
			<td>Zeon Corporation</td>
			<td></td>
			<td>Gifted</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96 well plate</td>
			<td>greiner</td>
			<td>655986</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-drebrin antibody (M2F6)</td>
			<td>MBL</td>
			<td>D029-3</td>
			<td>Mouse monoclonal (dilution 1:1)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-MAP2 antibody</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>AB5622</td>
			<td>Rabbit&#160; (dilution 1:1000)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-mouse Alexa Fluor 568</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>A11031</td>
			<td>Dilution 1: 500</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-rabbit Alexa Fluor&#160;</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>A11008</td>
			<td>Dilution 1: 500</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>B-27</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>17504-044</td>
			<td>2 v/v% for MEA plates; 50x for normal plates</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Borax</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>B-9876</td>
			<td>Final concentration 12 mM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Boric acid</td>
			<td>WAKO</td>
			<td>021-02195</td>
			<td>Final concentration 50 mM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine serum albumin</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>12659-100G</td>
			<td>Final concentration: 3% in PBS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Confocal quantitative image cytometer 
			CellVoyager CQ1</td>
			<td>YOKOGAWA</td>
			<td></td>
			<td>Phase contrast images</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cytosine &#946;-D-arabino-furanoside (Ara-C)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>C-6645</td>
			<td>Diluted in dH2O (final concentration: 0.2 &#181;M)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DAPI</td>
			<td>FUJIFILM</td>
			<td>340-07971</td>
			<td>Dilution 1:1000</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GlutaMAX</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>35050-061</td>
			<td>&#160;2.5 mM for MEA plates; 400x for normal plates</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>In Cell Analyzer 2200</td>
			<td>Cytiva</td>
			<td></td>
			<td>Fluorescence images</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Laminin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>114956-81-9</td>
			<td>Final concentration: 20 &#181;g/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Maestro</td>
			<td>Axion Biosystems</td>
			<td></td>
			<td>MEA recordings</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MEA plate</td>
			<td>Axion Biosystems</td>
			<td>M768-tMEA-48W</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Neurobasal</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>21103-049</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde</td>
			<td>nacalai tesque</td>
			<td>26126-25</td>
			<td>Final concentration: 4% in PBS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin/Streptomycin</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15140-122</td>
			<td>&#160;100 U/mL for normal plates</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin/Streptomycin</td>
			<td>nacalai tesque</td>
			<td>26253-84</td>
			<td>100 &#181;g/mL for MEA plates</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>polyethyleimine</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>9002-98-6</td>
			<td>Final concentration: 0.1%</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Poly-L-lysine</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P2636</td>
			<td>Diluted in the borate buffer (final concentration: 1 mg/mL)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SKY Neuron</td>
			<td>AlzMed , Inc.</td>
			<td>ARH001</td>
			<td>1.0 x 106 cells/tube</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium azide</td>
			<td>FUJIFILM</td>
			<td>195-11092</td>
			<td>0.1%</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SodiumL(+)-Glutamate monohydrate</td>
			<td>WAKO</td>
			<td>194-02032</td>
			<td>Diluted in dH2O (final concentrations: 1 &#181;M, 3 &#181;M, 10 &#181;M, 30 &#181;M, 100 &#181;M)</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

easy and reproducible low-density primary culture using frozen stock of embryonic hippocampal neurons

Neuronale cultuur is een waardevol systeem voor het evalueren van synaptische functies en medicijnscreenings. In het bijzonder maakt een cultuur met lage dichtheid van primaire hippocampale neuronen de studie van individuele neuronen of subcellulaire componenten mogelijk. We hebben subcellulaire eiwitlokalisatie binnen een neuron aangetoond door immunocytochemie, neuronale polariteit, synaptische morfologie en de ontwikkelingsverandering ervan met behulp van een primaire hippocampuscultuur met lage dichtheid. Onlangs zijn kant-en-klare bevroren voorraden neuronen commercieel beschikbaar geworden. Deze bevroren voorraden neuronen verminderen de tijd die nodig is om dierproeven voor te bereiden en dragen ook bij aan de vermindering van het aantal gebruikte dieren. Hier introduceren we een reproduceerbare primaire kweekmethode met lage dichtheid met behulp van een 96-well plaat. We gebruikten een in de handel verkrijgbare bevroren voorraad neuronen van de rat embryonale hippocampus. De neuronen kunnen op lange termijn stabiel worden gekweekt zonder mediaveranderingen door de groei van gliacellen op bepaalde tijdstippen te verminderen. Deze high-throughput assay met behulp van low-density cultuur maakt reproduceerbare imaging-gebaseerde evaluaties van synaptische plasticiteit mogelijk.

Volgens het protocol werden de neuronen gedurende 21 dagen gekweekt in een 96-well plaat en vervolgens behandeld met glutamaat (figuur 1). De neuronen ontwikkelden zich normaal zonder een uitwisseling van het kweekmedium gedurende 3 weken (figuur 2). We behandelden de cellen met verschillende concentraties glutamaat (1 μM, 3 μM, 10 μM, 30 μM en 100 μM verdund in gesteriliseerd water) gedurende 10 minuten en fixeerden ze. Immunocytochemie werd uitgevoerd en fluorescentiebeelden van drebrin en MAP2 werden verkregen met behulp van een geautomatiseerde fluorescentiemicroscoop met een sCMOS-camera. Zoals te zien is in figuur 3, worden drebrine-positieve dendritische stekels duidelijk waargenomen langs MAP2-positieve dendrieten. Het is aangetoond dat glutamaatstimulatie Ca2+ instroom veroorzaakt via NMDAR, wat drebrin-uittocht uit dendritische stekels veroorzaakt, wat resulteert in een vermindering van de drebrinclusterdichtheden 5,17. Dienovereenkomstig observeerden we de dosisafhankelijke vermindering van drebrineclusterdichtheden tegen glutamaatstimulatie10 (figuur 4). Zoals te zien is in figuur 5, is deze methode zeer reproduceerbaar als drebrin wordt gebruikt als marker voor synaptische toestanden.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64872/64872fig01.jpg"> Figuur 1: Schema van de methode. De neuronen werden gedurende 21 dagen gekweekt in een 96-well plaat en vervolgens behandeld met glutamaat. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64872/64872fig01large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64872/64872fig02.jpg"> Figuur 2: Bright-field beelden van gekweekte neuronen met behulp van een 96-well plaat. Fasecontrastbeelden werden verkregen uit elke ontwikkelingsfase (DIV 1, 7, 14, 21) met behulp van een confocale kwantitatieve beeldcytometer. Schaalbalk: 50 μm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64872/64872fig02large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64872/64872fig03.jpg"> Figuur 3: Representatieve beelden van immunogekleurde gekweekte neuronen. (Links) Samengevoegde fluorescentiebeelden van drebrine (groen) en MAP2 (rood). Elke fluorescentieafbeelding van drebrin en MAP2 werd respectievelijk in het middelste en rechterpaneel getoond. Witte rechthoeken tonen het gebied dat hieronder is vergroot. Schaalbalken; bovenste panelen: 50 μm, onderste panelen: 20 μm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64872/64872fig03large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64872/64872fig04.jpg"> Figuur 4: Glutamaatafhankelijke dosisresponsveranderingen in genormaliseerde drebrinclusterdichtheid. (A) Representatieve fluorescentiebeelden immunostained met drebrin (groen) en MAP2 (rood) uit de put die wordt behandeld met 0 μM, 10 μM en 100 μM glutamaat (van links naar rechts). Schaalbalk: 50 μm. (B) De clusterdichtheid van Drebrin werd genormaliseerd door het gemiddelde van de controle (0 μM). 0 μM, N = 58 putten; 1 μM, N = 46; 3 μM, N = 54; 10 μM, N = 45; 30 μM, N = 54; 100 μM, N = 55, uit 13 experimenten met verschillende partijen. ** P < 0,01 versus controle (0 μM) door dunnett's meervoudige vergelijkingstest na ANOVA. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64872/64872fig04large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64872/64872fig05.jpg"> Figuur 5: Glutamaatafhankelijke dosis-responsveranderingen in de clusterdichtheid van drebrin. De ruwe gegevens van zes experimenten met verschillende partijen. N = 4 putten voor elke concentratie (0 μM, 3 μM, 10 μM, 30 μM en 100 μM). Waarden worden uitgedrukt als gemiddelde ± SEM. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64872/64872fig05large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.</a>
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64872/64872fig06.jpg"> Figuur 6: Toepassing van de bevroren voorraden neuronen op elektrofysiologische experimenten. (A) Een protocol voor elektrofysiologische experimenten met behulp van micro-elektrorode array (MEA) platen. Coating: Een dag voor het plateren van de cellen werd elke 48-well MEA-plaat voorgecoat met een polyethyleenimine (PEI: 0,1%) oplossing en gedurende 1 uur bij 37 °C geïncubeerd. De MEA-plaat werd vervolgens 3x gewassen met gesteriliseerd water en 1 uur gedroogd. Vervolgens werd de MEA-plaat 's nachts op 4 °C gehouden. Cultuur met hoge dichtheid: 50.000 cellen /put van de neuronen werden op 48-well MEA-platen geplateerd. De celzaaistap werd uitgevoerd zoals beschreven in sectie 2 van het hierboven beschreven protocol. Laminine (20 μg/ml) toegevoegd kweekmedium (voeg 2 v/v% B-27, 2,5 mM Glutamax en 100 μg/ml penicilline/streptomycine toe aan het neurobasale medium) werd gebruikt om de neuronen te vergulden. Daarna werden de neuronen gekweekt bij 37 °C, 5% CO2 in het kweekmedium. De media werden volledig uitgewisseld op DIV 1 met het cultuurmedium tot DIV 3. Ara-C werd toegevoegd bij DIV 4 (laatste 0,2 μM). Vanaf DIV 5 en 2 keer per week werd 50% van de media veranderd met het cultuurmedium. De activiteit van de neuronen op elke put van de MEA-plaat werd geregistreerd met een MEA-systeem. (B) Spontane neuronale activiteit werd verkregen bij 37 °C onder een 5% CO2-atmosfeer met behulp van een MEA-systeem met een bemonsteringsfrequentie van 12,5 kHz/kanaal bij DIV 21. Opnames van 4 kanalen van de 16 kanalen binnen een put worden getoond. Voor alle opnames werd een Butterworth band-pass filter (200-3.000 Hz) toegepast. Pijlpunten tonen de timing van gesynchroniseerde burst-vuren. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64872/64872fig06large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Easy and Reproducible Low-Density Primary Culture using Frozen Stock of Embryonic Hippocampal Neurons at JoVE.com

Easy and Reproducible Low-Density Primary Culture using Frozen Stock of Embryonic Hippocampal Neurons

Een kant-en-klare bevroren voorraad neuronen is een krachtig hulpmiddel voor het evalueren van synaptische functies. Hier introduceren we een eenvoudige primaire cultuur met lage dichtheid uit bevroren voorraad met behulp van een 96-well plaat.

Eenvoudige en reproduceerbare primaire cultuur met lage dichtheid met behulp van bevroren voorraad embryonale hippocampusneuronen

Neuronal culture is a valuable system for evaluating synaptic functions and drug screenings. In particular, a low-density culture of primary hippocampal ...

De bevroren voorraden embryonale neuronen van ratten zijn klaar voor gebruik en er zijn geen geavanceerde technieken nodig voor het kweken van de cellen. Deze techniek is heel eenvoudig en je hebt geen toestemming nodig voor dierproeven, het regelen van getimede drachtige dieren of het ontleden van embryo's. De neuronen kunnen worden gekweekt in andere kweekvaten en worden toegepast voor andere soorten experimenten.Bijvoorbeeld micro-elektrode arrayplaten voor elektrofysiologische experimenten. Begin met het coaten van een 96-well microplaat met 100 microliter poly-L-lysine per put. Incubeer vervolgens de borden een nacht bij 37 graden Celsius.Verwijder aan het einde van de incubatie de poly-L-lysine-oplossing. Was de borden twee keer met gesteriliseerd water en één keer met een supplementvrij, vers kweekmedium. Leg de borden te drogen.Droge platen kunnen worden ingepakt en tot een maand worden bewaard bij vier graden Celsius. Om te beginnen met het zaaien van cellen, voegt u 50 microliter van het kweekmedium toe aan elke put in de gecoate platen. Vul de perifere putten met 200 microliter gesteriliseerd water en incubeer de plaat gedurende een uur bij 37 graden Celsius met 5% koolstofdioxide.Verwijder de neuron cryo injectieflacon uit de vloeibare stikstoftank en plaats deze in een hitteblok van 37 graden Celsius om de inhoud gedeeltelijk te ontdooien. Gebruik een pipet van één milliliter met een punt met brede boring en breng de inhoud van de injectieflacons druppelsgewijs langzaam over naar een steriele buis van 50 milliliter. Spoel de lege cryoflacon af met één milliliter kweekmedium op kamertemperatuur.Breng de spoeloplossing over in de buis van 50 milliliter die de celsuspensie bevat. Voeg vervolgens negen milliliter van het kamertemperatuurcultuurmedium druppelsgewijs toe aan de buis van 50 milliliter, waardoor het volume 11 milliliter bedraagt. Nadat u de cellen hebt geteld met behulp van een hemocytometer, brengt u de celsuspensie over in een reservoir.Geef nu met behulp van een meerkanaals pipet met brede boringspunten de celsuspensie met een eindtelling van 1,0 keer 10 aan de vier cellen per put in de gecoate 96-well plaat. Incubeer de neuronen gedurende één tot twee uur bij 37 graden Celsius onder 5% koolstofdioxide. Vervang vervolgens het kweekmedium door 100 microliter voorverwarmd kweekmedium en incubeer opnieuw onder dezelfde omstandigheden.Voeg na vier dagen in vitro cytosine bèta-D-arabinofuranoside toe in de uiteindelijke concentratie van 0,2 micromolair per put om de groei van gliacellen te verminderen. Plaats het bord terug in de couveuse. Behandel na 21 dagen in vitro de cellen met de geneesmiddelen van belang.Om een positieve controle te behouden, behandelt u cellen met 100 micromolair glutamaat per put gedurende 10 minuten bij 37 graden Celsius voordat u fixeert. Voordat immunocytochemische studies worden uitgevoerd, fixeert u de cellen gedurende 20 minuten door de kweekoplossing te vervangen door 100 microliter paraformaldehyde in elke put. Was de putjes na fixatie twee keer met 250 microliter fosfaatgebufferde zoutoplossing per put gedurende vijf minuten elk.In de huidige studie werden de neuronen normaal ontwikkeld zonder het kweekmedium gedurende drie weken uit te wisselen. Immunohistochemie onthulde drebrine-positieve dendritische stekels langs de MAP2-positieve dendrieten. De dosisafhankelijke verlaging van de drebrineclusterdichtheden tegen glutamaatstimulatie werd waargenomen.De transplantatie van de celsuspensie voordat deze te warm wordt, is erg belangrijk. De druppelsgewijze toevoeging van kweekmedium is ook cruciaal om plotselinge verandering in osmolariteit te voorkomen.

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Dissection and Culture of Commissural Neurons from Embryonic Spinal Cord

Dissectie en Cultuur van Commissural neuronen van het ruggenmerg Embryonic

Commissural neurons have been widely used to investigate the mechanisms underlying axon guidance during embryonic spinal cord development. The cell bodies ...

Nucleofection and Primary Culture of Embryonic Mouse Hippocampal and Cortical Neurons

Nucleofection en Primaire Cultuur van de embryonale Mouse hippocampus en de corticale neuronen

Hippocampal and cortical neurons have been used extensively to study central nervous system (CNS) neuronal polarization, axon/dendrite outgrowth, and ...

Bilaminar Co-culture of Primary Rat Cortical Neurons and Glia

Bilaminar Co-cultuur van primaire Rat corticale neuronen en Glia

This video will guide you through the process of culturing rat cortical neurons in the presence of a glial feeder layer, a system known as a bilaminar or ...

Isolation and Culture of Hippocampal Neurons from Prenatal Mice

Isolatie en Cultuur van hippocampale neuronen van Prenatal Muizen

Primary cultures of rat and murine hippocampal neurons are widely used to reveal cellular mechanisms in neurobiology. By isolating and growing individual ...

Assaying DNA Damage in Hippocampal Neurons Using the Comet Assay

Analyseren DNA schade in hippocampale neuronen Met behulp van de Comet Assay

A number of drugs target the DNA repair pathways and induce cell kill by creating DNA damage. Thus, processes to directly measure DNA damage have been ...

Preparation of Primary Neurons for Visualizing Neurites in a Frozen-hydrated State Using Cryo-Electron Tomography

Voorbereiding van de primaire neuronen voor het visualiseren neurites in een bevroren gehydrateerd Staat Met behulp van Cryo-electron tomography

Neurites, both dendrites and axons, are neuronal cellular processes that enable the conduction of electrical impulses between neurons. Defining the ...

Calcium Phosphate Transfection of Primary Hippocampal Neurons

Calciumfosfaattransfectie van Primary hippocampus neuronen

Calcium phosphate precipitation is a convenient and economical method for transfection of cultured cells. With optimization, it is possible to use this ...

Imaging Dendritic Spines of Rat Primary Hippocampal Neurons using Structured Illumination Microscopy

Beeldvorming Dendritische stekels van Rat Primaire hippocampus neuronen met behulp van Structured Illumination Microscopie

Dendritic spines are protrusions emerging from the dendrite of a neuron and represent the primary postsynaptic targets of excitatory inputs in the brain. ...

Primary Culture of Mouse Dopaminergic Neurons

Primaire Cultuur van de Muis dopaminerge neuronen

Dopaminergic neurons represent less than 1% of the total number of neurons in the brain. This low amount of neurons regulates important brain functions ...

Isolation, Culture and Long-Term Maintenance of Primary Mesencephalic Dopaminergic Neurons From Embryonic Rodent Brains

Isolatie, Cultuur en onderhoud op lange termijn van de Primary mesencefale dopaminerge neuronen uit embryonale knaagdieren Brains

Degeneration of mesencephalic dopaminergic (mesDA) neurons is the pathological hallmark of Parkinson&#8217;s diseae. Study of the biological processes ...