Name: easy and reproducible low-density primary culture using frozen stock of embryonic hippocampal neurons
Uploaded: 2023-01-27T14:15:00
Duration: 4 min 26 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Easy and Reproducible Low-Density Primary Culture using Frozen Stock of Embryonic Hippocampal Neurons at JoVE.com

हम प्रयोगों के साथ सहायता के लिए कज़ुमी कामियामा और मनमी कवाडा को धन्यवाद देते हैं। इस कार्य को JSPS KAKENHI (अनुदान संख्या 19K08010 से N.K.) और जापान एजेंसी फॉर मेडिकल रिसर्च एंड डेवलपमेंट (AMED) (अनुदान संख्या JP19bk0104077 और JP22bm0804024 को T.S.) द्वारा समर्थित किया गया था।

1. प्लेट कोटिंग
<ol><li>पॉली-एल-लाइसिन (1 मिलीग्राम / एमएल, 0.1 एम बोरेट बफर [पीएच: 8.5]; 100 μL / कुएं) में पतला 96-अच्छी तरह से माइक्रोप्लेट को कोट करें और 37 डिग्री सेल्सियस पर रात भर इनक्यूबेट करें। नोट: केवल उन कुओं को कोट करें जिन्हें उपयोग करने की आवश्यकता है। यहां किए गए प्रयोगों में मध्य 60 कुओं का उपयोग किया जाता है। बोरेट बफर को स्टरलाइज़्ड पानी में 50 एमएम बोरिक एसिड और 12 एमएम बोरेट मिलाकर तैयार किया जाता है।</li>
	<li>प्लेट को दो बार स्टरलाइज़ किए गए पानी (250 μL / कुएं) से धोएं।</li>
	<li>पूरक के बिना ताजा संस्कृति माध्यम के साथ प्लेट को एक बार धो लें (250 μL /</li>
	<li>प्लेट को 20 मिनट के लिए एक साफ बेंच पर सुखाएं।</li>
	<li>एल्यूमीनियम पन्नी के साथ प्लेट लपेटें और उपयोग तक इसे 4 डिग्री सेल्सियस पर रखें (1 महीने के लिए मान्य)।</li>
</ol>2. सेल सीडिंग
<ol><li>लेपित प्लेट में कल्चर माध्यम के 50 μL / वेल जोड़ें और इसे 30 मिनट से 1 घंटे के लिए 37 डिग्री सेल्सियस, 5% सीओ2 इनक्यूबेटर में रखें। परिधीय कुओं को निष्फल पानी (200 μL / कुएं) से भरें। नोट: संस्कृति माध्यम न्यूरोबेसल माध्यम में 50x B-27, 400x ग्लूटामैक्स, और पेनिसिलिन / स्ट्रेप्टोमाइसिन के 100 U / mL जोड़कर तैयार किया जाता है (विवरण के लिए सामग्री की तालिका देखें)।</li>
	<li>तरल नाइट्रोजन टैंक से न्यूरॉन क्रायोवियल को हटा दें। यहां उपयोग किए जाने वाले न्यूरॉन्स डीएमएसओ-क्रायोप्रिजर्व्ड न्यूरॉन्स11 थे।</li>
	<li>क्रायोवियल को 37 डिग्री सेल्सियस के गर्मी ब्लॉक में 3 मिनट तक डुबोएं और सामग्री को आंशिक रूप से पिघलाएं। क्रायोवियल को बहुत लंबे समय तक गर्म न करें। जैसे ही यह पिघल जाता है, सामग्री को 50 एमएल ट्यूब में स्थानांतरित करें।</li>
	<li>धीरे-धीरे न्यूरॉन क्रायोवियल सामग्री को एक विस्तृत छिद्र युक्ति के साथ 1 एमएल पिपेट का उपयोग करके एक बाँझ 50 एमएल ट्यूब ड्रॉप-वाइज (50 μL / s) में स्थानांतरित करें।</li>
	<li>खाली क्रायोवियल को कल्चर माध्यम के 1 एमएल (कमरे का तापमान) के साथ कुल्ला करें; आरटी)। संस्कृति माध्यम के इस 1 एमएल को क्रायोवियल ड्रॉप-वाइज (50 μL / s) से सेल निलंबन युक्त 50 एमएल ट्यूब में स्थानांतरित करें।</li>
	<li>50 एमएल ट्यूब ड्रॉप-वाइज (0.5 एमएल / एस) में कल्चर माध्यम (आरटी) के 9 एमएल जोड़ें और वॉल्यूम को 11 एमएल तक बनाएं। पिपेटिंग को दोहराएं नहीं, लेकिन सेल निलंबन को धीरे-धीरे मिलाएं।</li>
	<li>सेल नंबर की गणना करें (सेल काउंटर या हेमोसाइटोमीटर का उपयोग करें)।</li>
	<li>सभी सेल निलंबन को एक जलाशय में स्थानांतरित करें और वाइड-पोर टिप्स (1.0 x 104 सेल / वेल) के साथ मल्टीचैनल पिपेट का उपयोग करके सेल निलंबन को 96-वेल प्लेट में वितरित करें। संस्कृति माध्यम वाष्पीकरण को कम करने के लिए, परिधीय कुओं को निष्फल पानी से भरें (चरण 2.1)। नोट: यह अध्ययन पुष्टि करता है कि मध्यम विनिमय के बिना 3 सप्ताह की संस्कृति के लिए संस्कृति माध्यम वाष्पीकरण छोटा है। माध्यम की कमी दर 3.6% (एन = 120 कुएं) है। इस प्रकार, 3 सप्ताह की इनक्यूबेशन अवधि के दौरान ऑस्मोलैलिटी परिवर्तन कठोर नहीं होगा।</li>
	<li>37 डिग्री सेल्सियस, 5% सीओ 2 इनक्यूबेटर में1-2 घंटे के लिए न्यूरॉन्स को इनक्यूबेट करें।</li>
	<li>संस्कृति माध्यम को 100 डिग्री सेल्सियस पूर्व गर्म संस्कृति माध्यम (37 डिग्री सेल्सियस) प्रति अच्छी तरह से बदलें और इसे 37 डिग्री सेल्सियस, 5% सीओ2 इनक्यूबेटर में वापस रखें (संस्कृति के दौरान कोई मध्यम परिवर्तन की आवश्यकता नहीं है)।</li>
</ol>3. आरा-सी उपचार
<ol><li>विट्रो (DIV) में 4 दिनों में, ग्लियल कोशिकाओं के विकास को कम करने के लिए साइटोसिन β-डी-अरबिनो-फुरानोसाइड (आरा-सी) को 0.2 μM प्रति अच्छी तरह से अंतिम एकाग्रता में जोड़ें।</li>
</ol>4. दवा उपचार
<ol><li>विट्रो में 21 दिनों में, रुचि की दवाओं के साथ कोशिकाओं का इलाज करें।</li>
	<li>दवा उपचार के दौरान प्लेट का तापमान 37 डिग्री सेल्सियस पर रखें।</li>
	<li>एक सकारात्मक नियंत्रण के लिए, निर्धारण से पहले 10 मिनट के लिए कोशिकाओं को 100 μM ग्लूटामेट (अंतिम एकाग्रता के लिए प्रति अच्छी तरह से) के साथ इलाज करें।</li>
</ol>5. निर्धारण
<ol><li>निर्धारण के लिए, 0.1 एम फॉस्फेट बफर (100 μL / वेल) में 4% पैराफॉर्मलडिहाइड का उपयोग करें।</li>
	<li>~ 20 मिनट के निर्धारण के बाद, कुओं को फॉस्फेट-बफर्ड खारा (पीबीएस; 250 μL / वेल) 2x के साथ 5 मिनट के लिए धो लें।</li>
</ol>6. इम्यूनोसाइटोकेमिस्ट्री
<ol><li>कोशिकाओं को पीबीएस (250 μL / वेल) 1x के साथ 5 मिनट के लिए धो लें।</li>
	<li>5 मिनट के लिए पीबीएस में 0.1% ट्राइटन एक्स -100 (100 μL / वेल) के साथ कोशिकाओं को परमेबिलाइज करें।</li>
	<li>कोशिकाओं को पीबीएस (250 μL / वेल) के साथ 5 मिनट के लिए 3x धोएं।</li>
	<li>ब्लॉक करने के लिए, आरटी पर 1 घंटे के लिए पीबीएस (पीबीएसए; 100 μL / वेल) में 3% गोजातीय सीरम एल्ब्यूमिन का उपयोग करें।</li>
	<li>कोशिकाओं को एंटी-ड्रेब्रिन (1: 1) और एंटी-माइक्रोट्यूबुल्स एसोसिएटेड प्रोटीन 2 (एमएपी 2) (1: 000) एंटीबॉडी (60 μL / वेल) के साथ रात भर 4 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट करें।</li>
	<li>कोशिकाओं को पीबीएस (250 μL / वेल) के साथ 5 मिनट के लिए 4x धोएं।</li>
	<li>आरटी में 2 घंटे के लिए पीबीएसए (60 μL / वेल) में उपयुक्त द्वितीयक एंटीबॉडी और 4', 6-डायमिडिनो-2-फेनिलइंडोल, डाइहाइड्रोक्लोराइड (DAPI; 1: 1000) के साथ कोशिकाओं को इनक्यूबेट करें।</li>
	<li>कोशिकाओं को पीबीएस (250 μL / वेल) के साथ 5 मिनट के लिए 4x धोएं।</li>
	<li>पीबीएस में 0.1% सोडियम एज़ाइड (150 μL / वेल) युक्त कोशिकाओं को स्टोर करें।</li>
</ol>7. छवि अधिग्रहण और विश्लेषण
<ol><li>छवियों को प्राप्त करने के लिए, एक उपयुक्त माइक्रोस्कोप का उपयोग करें।</li>
	<li>न्यूरॉन्स के सेल निकायों की पहचान करने के लिए, एमएपी 2-पॉजिटिव और डीएपीआई-पॉजिटिव दोनों क्षेत्रों का उपयोग करें।</li>
	<li>न्यूरॉन्स के डेंड्राइट की पहचान करने के लिए, सेल निकायों के बिना एमएपी 2-पॉजिटिव संकेतों का उपयोग करें।</li>
	<li>ड्रेब्रिन क्लस्टर की पहचान करने के लिए, एमएपी 2 पॉजिटिव डेंड्राइट के साथ ड्रेब्रिन-पॉजिटिव संकेतों का उपयोग करें।</li>
</ol>

<ol>
	<li>Banker, G. A., Cowan, W. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rat+hippocampal+neurons+in+dispersed+cell+culture.">Rat hippocampal neurons in dispersed cell culture.</a> Brain Research. 126 (3), 397-342 (1977).</li><li>Kaech, S., Banker, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Culturing+hippocampal+neurons.">Culturing hippocampal neurons.</a> Nature Protocols. 1 (5), 2406-2415 (2006).</li><li>Roppongi, R. T., Champagne-Jorgensen, K. P., Siddiqui, T. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Low-density+primary+hippocampal+neuron+culture.">Low-density primary hippocampal neuron culture.</a> Journal of Visualized Experiments. 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R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+simple+DMSO-based+method+for+cryopreservation+of+primary+hippocampal+and+cortical+neurons.">A simple DMSO-based method for cryopreservation of primary hippocampal and cortical neurons.</a> Journal of Neuroscience Methods. 333, 108578 (2020).</li><li>Pischedda, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cryopreservation+of+primary+mouse+neurons:+The+benefit+of+neurostore+cryoprotective+medium.">Cryopreservation of primary mouse neurons: The benefit of neurostore cryoprotective medium.</a> Frontiers in Cellular Neuroscience. 12, 81 (2018).</li><li>Kobayashi, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Impairment+of+ciliary+dynamics+in+an+APP+knock-in+mouse+model+of+Alzheimer's+disease.">Impairment of ciliary dynamics in an APP knock-in mouse model of Alzheimer's disease.</a> Biochemical and Biophysical Research Communications. 610, 85-91 (2022).</li><li>Kobayashi, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Properties+of+primary+cilia+in+melanin-concentrating+hormone+receptor+1-bearing+hippocampal+neurons+in+vivo+and+in+vitro.">Properties of primary cilia in melanin-concentrating hormone receptor 1-bearing hippocampal neurons in vivo and in vitro.</a> Neurochemistry International. 142, 104902 (2021).</li><li>Koganezawa, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=NMDA+receptor-dependent+and+-independent+effects+of+natural+compounds+and+crude+drugs+on+synaptic+states+as+revealed+by+drebrin+imaging+analysis.">NMDA receptor-dependent and -independent effects of natural compounds and crude drugs on synaptic states as revealed by drebrin imaging analysis.</a> The European Journal of Neuroscience. 53 (11), 3548-3560 (2021).</li><li>Mizui, T., Takahashi, H., Sekino, Y., Shirao, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Overexpression+of+drebrin+A+in+immature+neurons+induces+the+accumulation+of+F-actin+and+PSD-95+into+dendritic+filopodia,+and+the+formation+of+large+abnormal+protrusions.">Overexpression of drebrin A in immature neurons induces the accumulation of F-actin and PSD-95 into dendritic filopodia, and the formation of large abnormal protrusions.</a> Molecular and Cellular Neurosciences. 30 (1), 149-157 (2005).</li><li>Sekino, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Activation+of+N-methyl-D-aspartate+receptor+induces+a+shift+of+drebrin+distribution:+disappearance+from+dendritic+spines+and+appearance+in+dendritic+shafts.">Activation of N-methyl-D-aspartate receptor induces a shift of drebrin distribution: disappearance from dendritic spines and appearance in dendritic shafts.</a> Molecular and Cellular Neurosciences. 31 (3), 493-504 (2006).</li><li>Takahashi, H., Yamazaki, H., Hanamura, K., Sekino, Y., Shirao, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Activity+of+the+AMPA+receptor+regulates+drebrin+stabilization+in+dendritic+spine+morphogenesis.">Activity of the AMPA receptor regulates drebrin stabilization in dendritic spine morphogenesis.</a> Journal of Cell Science. 122, 1211-1219 (2009).</li><li>Aoki, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Drebrin+A+is+a+postsynaptic+protein+that+localizes+in+vivo+to+the+submembranous+surface+of+dendritic+sites+forming+excitatory+synapses.">Drebrin A is a postsynaptic protein that localizes in vivo to the submembranous surface of dendritic sites forming excitatory synapses.</a> The Journal of Comparative Neurology. 483 (4), 383-402 (2005).</li><li>Koganezawa, N., Hanamura, K., Sekino, Y., Shirao, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+role+of+drebrin+in+dendritic+spines.">The role of drebrin in dendritic spines.</a> Molecular and Cellular Neurosciences. 84, 85-92 (2017).</li><li>Shirao, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+role+of+drebrin+in+neurons.">The role of drebrin in neurons.</a> Journal of Neurochemistry. 141 (6), 819-834 (2017).</li><li>Sekino, Y., Koganezawa, N., Mizui, T., Shirao, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Role+of+drebrin+in+synaptic+plasticity.">Role of drebrin in synaptic plasticity.</a> Advances in Experimental Medicine and Biology. 1006, 183-201 (2017).</li><li>Togo, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Postsynaptic+structure+formation+of+human+iPS+cell-derived+neurons+takes+longer+than+presynaptic+formation+during+neural+differentiation+in+vitro.">Postsynaptic structure formation of human iPS cell-derived neurons takes longer than presynaptic formation during neural differentiation in vitro.</a> Molecular Brain. 14 (1), 149 (2021).</li></ol>

तोमोकी शिराव अल्ज़मेड, इंक के सीईओ हैं। अध्ययन को AlzMed, Inc. (500,000 JPY से NK को "सिनैप्टिक फ़ंक्शन के उच्च-थ्रूपुट विश्लेषण" नामक परियोजना के लिए वित्त पोषित किया गया था)।

इस विधि में एक महत्वपूर्ण कदम सेल निलंबन को पिघलाना है। बहुत गर्म होने से पहले सेल निलंबन का स्थानांतरण बहुत महत्वपूर्ण है। ऑस्मोलैलिटी के तेजी से परिवर्तन से बचने के लिए, हालांकि, सेल निलंबन को एक बार में माध्यम की एक बड़ी मात्रा में स्थानांतरित न करें। आसमाटिक दबाव में अचानक परिवर्तन से बचने के लिए संस्कृति माध्यम का ड्रॉप-वाइज जोड़ भी महत्वपूर्ण है।
न्यूरॉन्स को अन्य संस्कृति वाहिकाओं में सुसंस्कृत किया जा सकता है: 24-अच्छी प्लेटें, 8-वेल कक्ष, 60 मिमी व्यंजन, या एमईडी जांच। उन मामलों में, हालांकि, अंतिम एकाग्रता और आरा-सी को जोड़ने के समय को समायोजित करने की आवश्यकता है। इसके अलावा, न्यूरॉन्स के घनत्व को विभिन्न प्रकार के प्रयोगों में अनुकूलित करने की आवश्यकता है। उदाहरण के लिए, इलेक्ट्रोफिजियोलॉजिकल प्रयोगों के लिए उच्च घनत्व वाली संस्कृति की आवश्यकता होती है, और उस स्थिति में, सप्ताह में दो बार मीडिया विनिमय की आवश्यकता होती है (चित्रा 6)। इस प्रकार, कम घनत्व वाली संस्कृति को उच्च घनत्व वाली संस्कृति की तुलना में कम चरणों की आवश्यकता होती है।
कम घनत्व वाली न्यूरोनल संस्कृति को अक्सर अग्रिम तकनीकों की आवश्यकता होती है; हालांकि, रेडी-टू-यूज़ जमे हुए स्टॉक का उपयोग करने से यह समस्या हल हो जाती है। वर्णित विधि एक प्रयोगकर्ता के कौशल पर निर्भर नहीं करती है। जमे हुए स्टॉक की गुणवत्ता स्थिर है और जब तक वे तरल नाइट्रोजन में संग्रहीत होते हैं और 4 साल तक तापमान परिवर्तन से बचते हैं, तब तक स्थिर रूप से सुसंस्कृत किया जा सकता है।
मध्यम विनिमय के बिना 3 सप्ताह के लिए कोशिकाओं का संवर्धन करना यह सवाल उठाता है कि क्या महत्वपूर्ण ऑस्मोलैलिटी परिवर्तन या संस्कृति मीडिया वाष्पीकरण हैं। हालांकि, हमने पुष्टि की है कि संस्कृति मीडिया वाष्पीकरण छोटा है (3.6% की कमी दर)। सिनैप्टिक प्रोटीन का स्थानीयकरण और न्यूरॉन्स की आकृति विज्ञान 3 सप्ताह के बाद सामान्य दिखाई देते हैं। इसलिए, मीडिया विनिमय के बिना 3 सप्ताह की संस्कृति सुसंस्कृत न्यूरॉन्स की स्थितियों को प्रभावित करने वाले बड़े ऑस्मोलैलिटी परिवर्तनों का कारण नहीं बनती है। आरा-सी उपचार के बाद प्लेट को इनक्यूबेटर में रखना भी एक महत्वपूर्ण बिंदु है जो वाष्पीकरण को कम करता है।
जमे हुए स्टॉक न्यूरॉन्स के उपयोग के बारे में कोई सीमा नहीं है। हालांकि, कम घनत्व वाली संस्कृति विधि की कुछ सीमाएं हैं। हमने पुष्टि की कि कम घनत्व वाली संस्कृति को न्यूरॉन्स के रूपात्मक अवलोकन, सिनैप्टिक फ़ंक्शन के मूल्यांकन और जीएफपी अभिकर्मक के लिए लागू किया जा सकता है। हालांकि, हमने लाइव सेल इमेजिंग की जांच नहीं की है। इसके अलावा, जैसा कि ऊपर उल्लेख किया गया है, इलेक्ट्रोफिजियोलॉजी करने के लिए उच्च घनत्व संस्कृति की आवश्यकता होती है।
सिनैप्स परिपक्वता में आमतौर पर 3 सप्ताह7 लगते हैं, और हम यह पुष्टि नहीं कर सकते हैं कि सुसंस्कृत न्यूरॉन्स में अंत तक उचित सिनैप्स होते हैं। यदि 3 सप्ताह के बाद सिनैप्स परिपक्वता अच्छी नहीं है, तो हमें फिर से संस्कृति करनी होगी। प्रयोगशुरू करने से पहले न्यूरॉन्स की गुणवत्ता जानकर, हम इन 3 हफ्तों को बचा सकते हैं। इसलिए, प्रयोगों को कुशलतापूर्वक करने के लिए, पहले से न्यूरॉन्स की गुणवत्ता की जांच करना सबसे अच्छा है। जमे हुए स्टॉक पहले से न्यूरॉन्स की गुणवत्ता की जांच करना संभव बनाते हैं। जमे हुए स्टॉक का प्रत्येक बैच चूहों के एक कूड़े से उत्पन्न होता है, और हम गुणवत्ता की जांच के लिए प्रत्येक बैच से स्टॉक में से एक का उपयोग कर सकते हैं। ड्रेब्रिन न्यूरॉन्स की गुणवत्ता की जांच के लिए एक अच्छा मार्कर है। जैसा कि वर्णित है, ड्रेब्रिन परिपक्व न्यूरॉन्स में रीढ़ के सिर में जमा होता है, और यह सिनैप्टिक उत्तेजना पर प्रतिक्रिया करता है। इस प्रकार, हम मार्कर के रूप में ड्रेब्रिन का उपयोग करके जमे हुए स्टॉक में न्यूरॉन्स की गुणवत्ता की जांच कर सकते हैं।
इस विधि को सिनैप्टिक अवस्था पर दवाओं के प्रभाव का मूल्यांकन करने के लिए लागू किया जा सकता है। डेंड्राइटिक स्पाइन से ड्रेब्रिन पलायन सिनैप्टिक प्लास्टिसिटी22 के प्रारंभिक चरणों के दौरान होता है। इसलिए, दवा उपचार द्वारा प्राप्त ड्रेब्रिन क्लस्टर कमी का पता लगाने से पता चलता है कि दवा सिनैप्स को उत्तेजित करती है और सिनैप्टिक प्लास्टिसिटी का कारण बनती है। इसके अलावा, यह पहचानने के लिए कि क्या कमी एनएमडीएआर निर्भर है, 2-एमिनो-5-फॉस्फोनोवेलेरिक एसिड (एपीवी, एक एनएमडीएआर विरोधी) का उपयोग करके एक प्रयोग उपयोगी है। मार्कर के रूप में ड्रेब्रिन का उपयोग करते हुए, यहां तक कि एनएमडीएआर-निर्भरता स्पष्ट रूप से10,15 निर्धारित की जाती है। वर्णित विधि दवा स्क्रीनिंग, सुरक्षा औषधीय अध्ययन और सिनैप्टिक फ़ंक्शन के मूल्यांकन में उपयोगी है।

एक इन विट्रो प्रयोगात्मक प्रणाली का विकास जो सीखने और स्मृति में शामिल सिनैप्टिक कार्यों का आकलन कर सकता है, महत्वपूर्ण है। न्यूरोनल संस्कृति विट्रो में सिनैप्टिक कार्यों का मूल्यांकन करने के लिए एक मूल्यवान प्रणाली है। न्यूरोनल कल्चर तकनीक का पहली बार 1980 के दशक में उपयोग किया गया था, और 1990 के दशक में, प्रोटीन घटकों, प्रोटीन तस्करी, न्यूरोनल ध्रुवीयता, रीढ़ की आकृति विज्ञान, सिनैप्स विकास और प्लास्टिसिटी 4,5,6,7,8 के उपकोशिकीय स्थानीयकरण के संदर्भ में व्यक्तिगत न्यूरॉन्स के अध्ययन के लिए प्राथमिक हिप्पोकैम्पल न्यूरॉन्स की कम घनत्व वालीसंस्कृति विकसित की गई थी। . हालांकि, इस तकनीक में कई कदम शामिल हैं: जानवरों का संभोग करना, भ्रूण का विच्छेदन करना, संस्कृति वाहिकाओं को तैयार करना और सप्ताह में एक बार मीडिया परिवर्तन के साथ 3 सप्ताह के लिए कोशिकाओं की खेती करना। इसके अलावा, इसके लिए अग्रिमतकनीकों की आवश्यकता होती है।
हमने चूहे के भ्रूण 9,10 से अलग हिप्पोकैम्पल न्यूरॉन्स के जमे हुए स्टॉक विकसित किए हैं। न्यूरॉन्स के जमे हुए स्टॉक उपयोग के लिए तैयार हैं, और कोशिकाओं11,12 की खेती के लिए कोई अग्रिम तकनीक की आवश्यकता नहीं है। दूसरे शब्दों में, जमे हुए स्टॉक से न्यूरॉन्स की खेती एक प्रयोगकर्ता की तकनीक पर निर्भर नहीं करती है। यह पशु प्रयोगों की आवश्यकता को समाप्त करता है (उदाहरण के लिए, पशु प्रयोगों के लिए अनुमति, समयबद्ध गर्भवती जानवरों की व्यवस्था करना, और चूहे के भ्रूण का विच्छेदन), जिससे उपयोग किए जाने वाले जानवरों की संख्या कम हो जाती है। हाल ही में, न्यूरॉन्स के उच्च गुणवत्ता वाले, उपयोग के लिए तैयार जमे हुए स्टॉक व्यावसायिक रूप से उपलब्ध हो गए हैं। यहां, हमने भ्रूण दिवस (ई) 18 चूहे हिप्पोकैम्पस 13,14,15 से व्यावसायिक रूप से उपलब्ध जमे हुए स्टॉक का उपयोग किया। जमे हुए स्टॉक से न्यूरॉन्स की खेती करने के लिए ग्लिया-वातानुकूलित मीडिया या ग्लियल कोशिकाओं के साथ सह-संस्कृति की आवश्यकता नहीं होती है। अतिरिक्त सीरम के बिना साधारण प्राथमिक संस्कृति मीडिया का उपयोग कोशिकाओं को संस्कृति करने के लिए किया जा सकता है; इसलिए हम प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य डेटा प्राप्त कर सकते हैं। इसके अलावा, सेल सीडिंग के बाद 3 सप्ताह तक मीडिया विनिमय की कोई आवश्यकता नहीं है क्योंकि ग्लियल कोशिकाओं की वृद्धि कम हो जाती है (चित्रा 1)।
डेंड्राइटिक स्पाइन अधिकांश उत्तेजक सिनैप्स के पोस्टसिनेप्टिक कम्पार्टमेंट हैं। उनमें रिसेप्टर प्रोटीन, पोस्टसिनेप्टिक पाड़ प्रोटीन और एक्टिन साइटोस्केलेटल प्रोटीन होते हैं। हमने एक एक्टिन-बाइंडिंग प्रोटीन ड्रेब्रिन 5,6,7,16,17,18 पर ध्यान केंद्रित किया। ड्रेब्रिन परिपक्व न्यूरॉन्स 19 में रीढ़ के सिर पर जमा होता है, और हमने सिनैप्टिक अवस्था 15,17,20,21,22,23 के लिए एक मार्कर के रूप में ड्रेब्रिन की सूचना दी। रीडआउट के रूप में ड्रेब्रिन का उपयोग करके एक उच्च-सामग्री विश्लेषण करके, हमने हाल ही में एन-मिथाइल-डी-एस्पार्टिक एसिड-टाइप ग्लूटामेट रिसेप्टर्स (एनएमडीएआर) 10 पर फेनसाइक्लिडीन एनालॉग्स के निरोधात्मक प्रभावों और सिनैप्टिक राज्यों15 पर प्राकृतिक यौगिकों और कच्चे दवाओं के एनएमडीएआर-निर्भर प्रभावों की सूचना दी है।
यहां, हम विस्तार से बताते हैं कि कम घनत्व पर न्यूरॉन्स के जमे हुए स्टॉक को कैसे कल्चर किया जाए। इसके अलावा, हम 96-वेल प्लेटों का उपयोग करके सिनैप्टिक स्थिति का एक ड्रेब्रिन इमेजिंग-आधारित मूल्यांकन दिखाते हैं।

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>96 well plate</td>
			<td>Zeon Corporation</td>
			<td></td>
			<td>Gifted</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96 well plate</td>
			<td>greiner</td>
			<td>655986</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-drebrin antibody (M2F6)</td>
			<td>MBL</td>
			<td>D029-3</td>
			<td>Mouse monoclonal (dilution 1:1)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-MAP2 antibody</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>AB5622</td>
			<td>Rabbit&#160; (dilution 1:1000)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-mouse Alexa Fluor 568</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>A11031</td>
			<td>Dilution 1: 500</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-rabbit Alexa Fluor&#160;</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>A11008</td>
			<td>Dilution 1: 500</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>B-27</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>17504-044</td>
			<td>2 v/v% for MEA plates; 50x for normal plates</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Borax</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>B-9876</td>
			<td>Final concentration 12 mM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Boric acid</td>
			<td>WAKO</td>
			<td>021-02195</td>
			<td>Final concentration 50 mM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine serum albumin</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>12659-100G</td>
			<td>Final concentration: 3% in PBS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Confocal quantitative image cytometer 
			CellVoyager CQ1</td>
			<td>YOKOGAWA</td>
			<td></td>
			<td>Phase contrast images</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cytosine &#946;-D-arabino-furanoside (Ara-C)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>C-6645</td>
			<td>Diluted in dH2O (final concentration: 0.2 &#181;M)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DAPI</td>
			<td>FUJIFILM</td>
			<td>340-07971</td>
			<td>Dilution 1:1000</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GlutaMAX</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>35050-061</td>
			<td>&#160;2.5 mM for MEA plates; 400x for normal plates</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>In Cell Analyzer 2200</td>
			<td>Cytiva</td>
			<td></td>
			<td>Fluorescence images</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Laminin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>114956-81-9</td>
			<td>Final concentration: 20 &#181;g/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Maestro</td>
			<td>Axion Biosystems</td>
			<td></td>
			<td>MEA recordings</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MEA plate</td>
			<td>Axion Biosystems</td>
			<td>M768-tMEA-48W</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Neurobasal</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>21103-049</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde</td>
			<td>nacalai tesque</td>
			<td>26126-25</td>
			<td>Final concentration: 4% in PBS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin/Streptomycin</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15140-122</td>
			<td>&#160;100 U/mL for normal plates</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin/Streptomycin</td>
			<td>nacalai tesque</td>
			<td>26253-84</td>
			<td>100 &#181;g/mL for MEA plates</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>polyethyleimine</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>9002-98-6</td>
			<td>Final concentration: 0.1%</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Poly-L-lysine</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P2636</td>
			<td>Diluted in the borate buffer (final concentration: 1 mg/mL)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SKY Neuron</td>
			<td>AlzMed , Inc.</td>
			<td>ARH001</td>
			<td>1.0 x 106 cells/tube</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium azide</td>
			<td>FUJIFILM</td>
			<td>195-11092</td>
			<td>0.1%</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SodiumL(+)-Glutamate monohydrate</td>
			<td>WAKO</td>
			<td>194-02032</td>
			<td>Diluted in dH2O (final concentrations: 1 &#181;M, 3 &#181;M, 10 &#181;M, 30 &#181;M, 100 &#181;M)</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

easy and reproducible low-density primary culture using frozen stock of embryonic hippocampal neurons

न्यूरोनल संस्कृति सिनैप्टिक कार्यों और दवा स्क्रीनिंग के मूल्यांकन के लिए एक मूल्यवान प्रणाली है। विशेष रूप से, प्राथमिक हिप्पोकैम्पल न्यूरॉन्स की कम घनत्व वाली संस्कृति व्यक्तिगत न्यूरॉन्स या उपकोशिकीय घटकों के अध्ययन की अनुमति देती है। हमने इम्यूनोसाइटोकेमिस्ट्री, न्यूरोनल पोलैरिटी, सिनैप्टिक आकृति विज्ञान और कम घनत्व वाले प्राथमिक हिप्पोकैम्पल संस्कृति का उपयोग करके इसके विकासात्मक परिवर्तन द्वारा एक न्यूरॉन के भीतर उपकोशिकीय प्रोटीन स्थानीयकरण दिखाया है। हाल ही में, न्यूरॉन्स के रेडी-टू-यूज़ जमे हुए स्टॉक व्यावसायिक रूप से उपलब्ध हो गए हैं। न्यूरॉन्स के ये जमे हुए स्टॉक पशु प्रयोगों को तैयार करने के लिए आवश्यक समय को कम करते हैं और उपयोग किए जाने वाले जानवरों की संख्या को कम करने में भी योगदान करते हैं। यहां, हम 96-वेल प्लेट का उपयोग करके एक प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य कम घनत्व वाली प्राथमिक संस्कृति विधि पेश करते हैं। हमने चूहे के भ्रूण हिप्पोकैम्पस से न्यूरॉन्स के व्यावसायिक रूप से उपलब्ध जमे हुए स्टॉक का उपयोग किया। न्यूरॉन्स को विशेष समय बिंदुओं पर ग्लियल कोशिकाओं के विकास को कम करके मीडिया परिवर्तन के बिना दीर्घकालिक रूप से सुसंस्कृत किया जा सकता है। कम घनत्व वाली संस्कृति का उपयोग करके यह उच्च-थ्रूपुट परख सिनैप्टिक प्लास्टिसिटी के प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य इमेजिंग-आधारित मूल्यांकन की अनुमति देता है।

प्रोटोकॉल के बाद, न्यूरॉन्स को 21 दिनों के लिए 96-वेल प्लेट में सुसंस्कृत किया गया था, और फिर ग्लूटामेट (चित्रा 1) के साथ इलाज किया गया था। न्यूरॉन्स 3 सप्ताह के लिए संस्कृति माध्यम के आदान-प्रदान के बिना सामान्य रूप से विकसित हुए (चित्रा 2)। हमने 10 मिनट के लिए ग्लूटामेट की कई सांद्रता (1 μM, 3 μM, 10 μM, 30 μM, और 100 μM को निष्फल पानी में पतला) के साथ कोशिकाओं का इलाज किया और उन्हें तय किया। इम्यूनोसाइटोकेमिस्ट्री का प्रदर्शन किया गया था, और ड्रेब्रिन और एमएपी 2 की प्रतिदीप्ति छवियों को एक एससीएमओएस कैमरे के साथ एक स्वचालित फ्लोरेसेंस माइक्रोस्कोप का उपयोग करके अधिग्रहित किया गया था। जैसा कि चित्रा 3 में दिखाया गया है, एमएपी 2-पॉजिटिव डेंड्राइट के साथ ड्रेब्रिन-पॉजिटिव डेंड्राइटिक स्पाइन स्पष्ट रूप से देखे जाते हैं। यह दिखाया गया है कि ग्लूटामेट उत्तेजना एनएमडीएआर के माध्यम से सीए2 + प्रवाह प्राप्त करती है, जो डेंड्राइटिक स्पाइन से ड्रेब्रिन पलायन का कारण बनती है जिसके परिणामस्वरूप ड्रेब्रिन क्लस्टर घनत्व 5,17 में कमी आती है। तदनुसार, हमने ग्लूटामेट उत्तेजना10 (चित्रा 4) के खिलाफ ड्रेब्रिन क्लस्टर घनत्व की खुराक-निर्भर कमी देखी। जैसा कि चित्रा 5 में दिखाया गया है, यह विधि अत्यधिक प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य है यदि ड्रेब्रिन का उपयोग सिनैप्टिक राज्यों के लिए मार्कर के रूप में किया जाता है।
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64872/64872fig01.jpg"> चित्र 1: विधि की योजना। न्यूरॉन्स को 21 दिनों के लिए 96-वेल प्लेट में सुसंस्कृत किया गया था, और फिर ग्लूटामेट के साथ इलाज किया गया था। <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64872/64872fig01large.jpg" target="_blank">कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64872/64872fig02.jpg"> चित्रा 2: 96-वेल प्लेट का उपयोग करके सुसंस्कृत न्यूरॉन्स की उज्ज्वल-क्षेत्र छवियां। चरण कंट्रास्ट छवियों को प्रत्येक विकास चरण (डीआईवी 1, 7, 14, 21) से एक कॉन्फोकल मात्रात्मक छवि साइटोमीटर का उपयोग करके प्राप्त किया गया था। स्केल पट्टी: 50 μm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64872/64872fig02large.jpg" target="_blank">कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64872/64872fig03.jpg"> चित्रा 3: इम्यूनोस्टेन्ड सुसंस्कृत न्यूरॉन्स की प्रतिनिधि छवियां। (बाएं) ड्रेब्रिन (हरा) और एमएपी 2 (लाल) की प्रतिदीप्ति छवियों का विलय। ड्रेब्रिन और एमएपी 2 की प्रत्येक प्रतिदीप्ति छवि क्रमशः मध्य और दाएं पैनलों में दिखाई दी। सफेद आयताकार नीचे दिए गए क्षेत्र को दिखाते हैं। स्केल बार; ऊपरी पैनल: 50 μm, निचले पैनल: 20 μm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64872/64872fig03large.jpg" target="_blank">कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64872/64872fig04.jpg"> चित्र 4: सामान्यीकृत ड्रेब्रिन क्लस्टर घनत्व में ग्लूटामेट-निर्भर खुराक-प्रतिक्रिया परिवर्तन। (A) प्रतिनिधि फ्लोरेसेंस छवियां कुएं से ड्रेब्रिन (हरा) और एमएपी 2 (लाल) का उपयोग करके इम्यूनोस्टेन्ड होती हैं, जिसका इलाज 0 μM, 10 μM, और 100 μM ग्लूटामेट (बाएं से दाएं) के साथ किया जाता है। स्केल बार: 50 μm. (B) ड्रेब्रिन क्लस्टर घनत्व को नियंत्रण के औसत (0 μM) द्वारा सामान्यीकृत किया गया था। 0 μM, N = 58 कुएं; 1 μM, N = 46; 3 μM, N = 54; 10 μM, N = 45; 30 μM, N = 54; 100 μM, N = 55, विभिन्न लॉट का उपयोग करके 13 प्रयोगों से। ** एनोवा के बाद डनेट के कई तुलना परीक्षण द्वारा पी < 0.01 बनाम नियंत्रण (0 μM)। <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64872/64872fig04large.jpg" target="_blank">कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64872/64872fig05.jpg"> चित्रा 5: ड्रेब्रिन क्लस्टर घनत्व में ग्लूटामेट-निर्भर खुराक-प्रतिक्रिया परिवर्तन। विभिन्न लॉट का उपयोग करके छह प्रयोगों से कच्चा डेटा। प्रत्येक सांद्रता के लिए N = 4 कुएं (0 μM, 3 μM, 10 μM, 30 μM, और 100 μM)। मान SEM ± माध्य के रूप में व्यक्त किए <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64872/64872fig05large.jpg" target="_blank">जाते हैं. कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.</a>
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64872/64872fig06.jpg"> चित्रा 6: इलेक्ट्रोफिजियोलॉजिकल प्रयोगों के लिए न्यूरॉन्स के जमे हुए स्टॉक का अनुप्रयोग। (ए) माइक्रोइलेक्ट्रोड सरणी (एमईए) प्लेटों का उपयोग करके इलेक्ट्रोफिजियोलॉजिकल प्रयोगों के लिए एक प्रोटोकॉल। कोटिंग: कोशिकाओं को चढ़ाने से एक दिन पहले, प्रत्येक 48-वेल एमईए प्लेट को पॉलीथीनिमाइन (पीईआई: 0.1%) समाधान के साथ पूर्व-लेपित किया गया था और 37 डिग्री सेल्सियस पर 1 घंटे के लिए इनक्यूबेट किया गया था। एमईए प्लेट को तब निष्फल पानी के साथ 3 गुना धोया गया और 1 घंटे के लिए सुखाया गया। फिर, एमईए प्लेट को रात भर 4 डिग्री सेल्सियस पर रखा गया था। उच्च घनत्व संस्कृति: न्यूरॉन्स के 50,000 कोशिकाओं / अच्छी तरह से 48-अच्छी एमईए प्लेटों पर चढ़ाया गया था। सेल सीडिंग चरण ऊपर वर्णित प्रोटोकॉल के खंड 2 में वर्णित के रूप में किया गया था। न्यूरॉन्स को प्लेट करने के लिए लैमिनिन (20 μg / mL) ने संस्कृति माध्यम जोड़ा (2 v / v% B-27, 2.5 mM ग्लूटामैक्स, और 100 μg / mL पेनिसिलिन / स्ट्रेप्टोमाइसिन के 100 μg / mL को न्यूरोबेसल माध्यम में जोड़ें)। इसके बाद, न्यूरॉन्स को संस्कृति माध्यम में 37 डिग्री सेल्सियस, 5% सीओ2 पर सुसंस्कृत किया गया था। DIV 1 पर DIV 3 तक संस्कृति माध्यम के साथ मीडिया का पूरी तरह से आदान-प्रदान किया गया था। आरा-सी को DIV 4 (अंतिम 0.2 μM) में जोड़ा गया था। DIV 5 से और सप्ताह में 2 बार, 50% मीडिया को संस्कृति माध्यम के साथ बदल दिया गया था। एमईए प्लेट के प्रत्येक कुएं पर न्यूरॉन्स की गतिविधि को एमईए प्रणाली के साथ दर्ज किया गया था। (बी) डीआईवी21 पर 12.5 kHz/चैनल की नमूना दर पर एमईए प्रणाली का उपयोग करके 5% CO2 वातावरण के तहत 37 °C पर सहज न्यूरोनल गतिविधि का अधिग्रहण किया गया था। एक कुएं के भीतर 16 चैनलों में से 4 चैनलों की रिकॉर्डिंग दिखाई जाती है। सभी रिकॉर्डिंग के लिए, एक बटरवर्थ बैंड-पास फ़िल्टर (200-3,000 हर्ट्ज) लागू किया गया था। एरोहेड सिंक्रनाइज़ बर्स्ट फायरिंग के समय को दिखाते हैं। <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64872/64872fig06large.jpg" target="_blank">कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।</a>

Watch this Scientific Journal Video about Easy and Reproducible Low-Density Primary Culture using Frozen Stock of Embryonic Hippocampal Neurons at JoVE.com

Easy and Reproducible Low-Density Primary Culture using Frozen Stock of Embryonic Hippocampal Neurons

न्यूरॉन्स का एक रेडी-टू-यूज़ जमे हुए स्टॉक सिनैप्टिक कार्यों के मूल्यांकन के लिए एक शक्तिशाली उपकरण है। यहां, हम 96-वेल प्लेट का उपयोग करके जमे हुए स्टॉक से एक आसान कम घनत्व वाली प्राथमिक संस्कृति पेश करते हैं।

भ्रूण हिप्पोकैम्पल न्यूरॉन्स के जमे हुए स्टॉक का उपयोग करके आसान और प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य कम घनत्व वाली प्राथमिक संस्कृति

Neuronal culture is a valuable system for evaluating synaptic functions and drug screenings. In particular, a low-density culture of primary hippocampal ...

चूहे भ्रूण न्यूरॉन्स के जमे हुए स्टॉक उपयोग करने के लिए तैयार हैं, और कोशिकाओं के संवर्धन के लिए कोई उन्नत तकनीक की आवश्यकता नहीं है। यह तकनीक बहुत आसान है और आपको पशु प्रयोग, समयबद्ध गर्भवती जानवरों की व्यवस्था करने या भ्रूण विच्छेदन के लिए किसी भी अनुमति की आवश्यकता नहीं है। न्यूरॉन्स को अन्य संस्कृति वाहिकाओं में सुसंस्कृत किया जा सकता है और अन्य प्रकार के प्रयोगों के लिए लागू किया जा सकता है।उदाहरण के लिए, इलेक्ट्रोफिजियोलॉजिकल प्रयोगों के लिए माइक्रोइलेक्ट्रोड सरणी प्लेटें। प्रति कुएं 100 माइक्रोलीटर पॉली-एल-लाइसिन के साथ 96-वेल माइक्रोप्लेट को कोटिंग करके शुरू करें। इसके बाद, प्लेटों को रात भर 37 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट करें।इनक्यूबेशन के अंत में, पॉली-एल-लाइसिन समाधान को हटा दें। प्लेटों को दो बार निष्फल पानी से धोएं और एक बार पूरक-मुक्त, ताजा संस्कृति माध्यम से धोएं। प्लेटों को सूखने के लिए बाहर रखें।सूखी प्लेटों को लपेटा जा सकता है और चार डिग्री सेल्सियस पर एक महीने तक संग्रहीत किया जा सकता है। सेल सीडिंग शुरू करने के लिए, लेपित प्लेटों में प्रत्येक अच्छी तरह से कल्चर माध्यम के 50 माइक्रोलीटर जोड़ें। परिधीय कुओं को 200 माइक्रोलीटर निष्फल पानी से भरें और प्लेट को 5% कार्बन डाइऑक्साइड के साथ 37 डिग्री सेल्सियस पर एक घंटे के लिए इनक्यूबेट करें।तरल नाइट्रोजन टैंक से न्यूरॉन क्रायो शीशी को निकालें और इसकी सामग्री को आंशिक रूप से पिघलाने के लिए इसे 37 डिग्री सेल्सियस हीट ब्लॉक में रखें। एक चौड़े बोर टिप के साथ एक मिलीलीटर पिपेट का उपयोग करके, धीरे-धीरे शीशियों की सामग्री को एक बाँझ, 50-मिलीलीटर ट्यूब में स्थानांतरित करें। खाली क्रायो शीशी को कमरे के तापमान संवर्धन माध्यम के एक मिलीलीटर के साथ धोएं।कुल्ला घोल को सेल सस्पेंशन युक्त 50-मिलीलीटर ट्यूब में स्थानांतरित करें। इसके बाद, 50-मिलीलीटर ट्यूब में कमरे के तापमान संस्कृति के नौ मिलीलीटर को मध्यम ड्रॉपवाइज जोड़ें, जिससे मात्रा 11 मिलीलीटर हो जाए। हेमोसाइटोमीटर का उपयोग करके कोशिकाओं की गणना करने के बाद, सेल निलंबन को एक जलाशय में स्थानांतरित करें।अब, चौड़े बोर टिप्स के साथ एक मल्टी-चैनल पिपेट का उपयोग करके, लेपित 96-वेल प्लेट में प्रति अच्छी तरह से चार कोशिकाओं को 1.0 गुना 10 की अंतिम गिनती के साथ सेल निलंबन वितरित करें। 5% कार्बन डाइऑक्साइड के तहत 37 डिग्री सेल्सियस पर एक से दो घंटे के लिए न्यूरॉन्स को इनक्यूबेट करें। फिर, संस्कृति माध्यम को 100 माइक्रोलीटर के साथ प्रतिस्थापित करें और उसी स्थिति में फिर से इनक्यूबेट करें।विट्रो में चार दिनों के बाद, ग्लियल कोशिकाओं के विकास को कम करने के लिए 0.2 माइक्रोमोलर प्रति अच्छी तरह से अंतिम सांद्रता पर साइटोसिन बीटा-डी-अरबिनोफ्यूरानोसाइड जोड़ें। प्लेट को इनक्यूबेटर में वापस रखें। विट्रो में 21 दिनों के बाद, रुचि की दवाओं के साथ कोशिकाओं का इलाज करें।एक सकारात्मक नियंत्रण बनाए रखने के लिए, निर्धारण से पहले 37 डिग्री सेल्सियस पर 10 मिनट के लिए प्रति अच्छी तरह से 100 माइक्रोमोलर ग्लूटामेट के साथ कोशिकाओं का इलाज करें। इम्यूनोसाइटोकेमिकल अध्ययन करने से पहले, प्रत्येक कुएं में पैराफॉर्मलडिहाइड के 100 माइक्रोलीटर के साथ संस्कृति समाधान को बदलकर कोशिकाओं को 20 मिनट के लिए ठीक करें। निर्धारण के बाद, कुओं को पांच मिनट के लिए प्रति कुएं के 250 माइक्रोलीटर फॉस्फेट-बफर्ड खारा के साथ दो बार धोएं।वर्तमान अध्ययन में, न्यूरॉन्स को तीन सप्ताह के लिए संस्कृति माध्यम का आदान-प्रदान किए बिना सामान्य रूप से विकसित किया गया था। इम्यूनोहिस्टोकेमिस्ट्री ने एमएपी 2-पॉजिटिव डेंड्राइट के साथ ड्रेब्रिन-पॉजिटिव डेंड्राइटिक स्पाइन का खुलासा किया। ग्लूटामेट उत्तेजना के खिलाफ ड्रेब्रिन क्लस्टर घनत्व की खुराक-निर्भर कमी देखी गई।बहुत गर्म होने से पहले सेल निलंबन का प्रत्यारोपण बहुत महत्वपूर्ण है। ऑस्मोलरिटी में अचानक बदलाव से बचने के लिए संस्कृति माध्यम का ड्रॉपवाइज जोड़ भी महत्वपूर्ण है।

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Dissection and Culture of Commissural Neurons from Embryonic Spinal Cord

विच्छेदन और भ्रूणीय स्पाइनल कॉर्ड से Commissural न्यूरॉन्स की संस्कृति

Commissural neurons have been widely used to investigate the mechanisms underlying axon guidance during embryonic spinal cord development. The cell bodies ...

Nucleofection and Primary Culture of Embryonic Mouse Hippocampal and Cortical Neurons

Nucleofection और भ्रूण माउस hippocampal और cortical न्यूरॉन्स के प्राथमिक संस्कृति

Hippocampal and cortical neurons have been used extensively to study central nervous system (CNS) neuronal polarization, axon/dendrite outgrowth, and ...

Bilaminar Co-culture of Primary Rat Cortical Neurons and Glia

प्राथमिक चूहा cortical न्यूरॉन्स और Glia Bilaminar सह संस्कृति

This video will guide you through the process of culturing rat cortical neurons in the presence of a glial feeder layer, a system known as a bilaminar or ...

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अलगाव और जन्म के पूर्व चूहे से hippocampal न्यूरॉन्स की संस्कृति

Primary cultures of rat and murine hippocampal neurons are widely used to reveal cellular mechanisms in neurobiology. By isolating and growing individual ...

Assaying DNA Damage in Hippocampal Neurons Using the Comet Assay

Hippocampal न्यूरॉन्स में डीएनए की क्षति परख धूमकेतु परख का उपयोग

A number of drugs target the DNA repair pathways and induce cell kill by creating DNA damage. Thus, processes to directly measure DNA damage have been ...

Preparation of Primary Neurons for Visualizing Neurites in a Frozen-hydrated State Using Cryo-Electron Tomography

क्रायो इलेक्ट्रॉन टोमोग्राफी का प्रयोग एक जमे हुए हाइड्रेटेड राज्य में neurites दृश्यमान करने के लिए प्राथमिक न्यूरॉन्स की तैयारी

Neurites, both dendrites and axons, are neuronal cellular processes that enable the conduction of electrical impulses between neurons. Defining the ...

Calcium Phosphate Transfection of Primary Hippocampal Neurons

प्राथमिक hippocampal न्यूरॉन्स की कैल्शियम फॉस्फेट अभिकर्मक

Calcium phosphate precipitation is a convenient and economical method for transfection of cultured cells. With optimization, it is possible to use this ...

Imaging Dendritic Spines of Rat Primary Hippocampal Neurons using Structured Illumination Microscopy

संरचित रोशनी माइक्रोस्कोपी का उपयोग चूहा प्राथमिक hippocampal न्यूरॉन्स के वृक्ष के समान spines इमेजिंग

Dendritic spines are protrusions emerging from the dendrite of a neuron and represent the primary postsynaptic targets of excitatory inputs in the brain. ...

Primary Culture of Mouse Dopaminergic Neurons

माउस डोपामिनर्जिक न्यूरॉन्स के प्राथमिक संस्कृति

Dopaminergic neurons represent less than 1% of the total number of neurons in the brain. This low amount of neurons regulates important brain functions ...

Isolation, Culture and Long-Term Maintenance of Primary Mesencephalic Dopaminergic Neurons From Embryonic Rodent Brains

भ्रूण कृंतक दिमाग से प्राथमिक Mesencephalic डोपामिनर्जिक न्यूरॉन्स के अलगाव, संस्कृति और लंबी अवधि के रखरखाव

Degeneration of mesencephalic dopaminergic (mesDA) neurons is the pathological hallmark of Parkinson&#8217;s diseae. Study of the biological processes ...