Name: easy and reproducible low-density primary culture using frozen stock of embryonic hippocampal neurons
Uploaded: 2023-01-27T14:15:00
Duration: 4 min 26 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Easy and Reproducible Low-Density Primary Culture using Frozen Stock of Embryonic Hippocampal Neurons at JoVE.com

Vi takker Kazumi Kamiyama og Manami Kawada for hjelp med eksperimenter. Dette arbeidet ble støttet av JSPS KAKENHI (Grant Number 19K08010 to N.K.) og Japan Agency for Medical Research and Development (AMED) (Grant Number JP19bk0104077 og JP22bm0804024 til T.S.).

1. Plate belegg
<ol><li>Belegg en 96-brønns mikroplate med poly-L-lysin (1 mg/ml, fortynnet i 0,1 M boratbuffer [pH: 8,5]; 100 μL/brønn) og inkuber over natten ved 37 °C. MERK: Belegg bare brønnene som skal brukes. I forsøkene som utføres her, brukes de midterste 60 brønnene. Boratbufferen fremstilles ved å blande 50 mM borsyre og 12 mM borat i sterilisert vann.</li>
	<li>Vask platen to ganger med sterilisert vann (250 μL/brønn).</li>
	<li>Vask tallerkenen én gang med friskt dyrkningsmedium uten tilskudd (250 μL/brønn).</li>
	<li>Tørk platen på en ren benk i 20 min.</li>
	<li>Pakk platen inn med aluminiumsfolie og oppbevar den ved 4 °C til bruk (gyldig i 1 måned).</li>
</ol>2. Celle såing
<ol><li>Tilsett 50 μL / brønn av kulturmediet til den belagte platen og hold den i en 37 ° C, 5% CO2 -inkubator i 30 minutter til 1 time. Fyll de perifere brønnene med sterilisert vann (200 μL / brønn). MERK: Kulturmediet fremstilles ved å tilsette 50x B-27, 400x Glutamax og 100 U / ml penicillin / streptomycin til det neurobasale mediet (se materialfortegnelsen for detaljer).</li>
	<li>Fjern nevronkryovialet fra tanken med flytende nitrogen. Nevronene som ble brukt her var DMSO-kryopreserverte nevroner11.</li>
	<li>Dypp kryovialet i en varmeblokk på 37 °C i opptil 3 minutter og tine innholdet delvis. Ikke varm opp cryovial for lenge. Overfør innholdet til et 50 ml rør så snart det er tint.</li>
	<li>Overfør sakte nevronkryovialinnholdet til et sterilt 50 ml rør dråpevis (50 μL/s) ved hjelp av en 1 ml pipette med en bred porespiss.</li>
	<li>Skyll den tomme kryovialen med 1 ml av kulturmediet (romtemperatur; RT). Overfør disse 1 ml av dyrkningsmediet fra kryovialet dråpevis (50 μL/s) til 50 ml røret som inneholder cellesuspensjonen.</li>
	<li>Tilsett 9 ml av kulturmediet (RT) til 50 ml røret dråpevis (0,5 ml / s) og utgjør volumet til 11 ml. Ikke gjenta pipetteringen, men bland cellesuspensjonen langsomt.</li>
	<li>Telle cellenummeret (bruk en celleteller eller et hemocytometer).</li>
	<li>Overfør all cellesuspensjonen til et reservoar og dispenser cellesuspensjonen til 96-brønnsplaten ved hjelp av en flerkanalspipett med brede porespisser (1,0 x 104 celler/brønn). For å redusere fordampningen av kulturmediet, fyll de perifere brønnene med sterilisert vann (trinn 2.1). MERK: Denne studien bekrefter at kulturmediumfordampningen er liten for en 3-ukers kultur uten middels utveksling. Reduksjonsraten for mediet er 3,6% (n = 120 brønner). Dermed vil osmolalitetsendringen ikke være drastisk i løpet av 3-ukers inkubasjonsperioden.</li>
	<li>Inkuber nevronene i 1-2 timer i en 37 ° C, 5% CO2 -inkubator.</li>
	<li>Bytt ut kulturmediet med 100 μL forvarmet kulturmedium (37 °C) per brønn og sett det tilbake i en 37 °C, 5% CO2 -inkubator (ingen middels endring er nødvendig under kultur).</li>
</ol>3. Ara-C behandling
<ol><li>Etter 4 dager in vitro (DIV), tilsett cytosin β-D-arabino-furanosid (Ara-C) til en endelig konsentrasjon på 0,2 μM per brønn for å redusere veksten av gliaceller.</li>
</ol>4. Narkotika behandlinger
<ol><li>På 21 dager in vitro, behandle cellene med stoffene av interesse.</li>
	<li>Hold temperaturen på platen på 37 °C under legemiddelbehandling.</li>
	<li>For en positiv kontroll, behandle cellene med 100 μM glutamat (per brønn for endelig konsentrasjon) i 10 minutter før fiksering.</li>
</ol>5. Fiksering
<ol><li>For fiksering, bruk 4% paraformaldehyd i 0,1 M fosfatbuffer (100 μL / brønn).</li>
	<li>Etter ~20 min fiksering, vask brønnene med fosfatbufret saltvann (PBS; 250 μL / brønn) 2x i 5 min hver.</li>
</ol>6. Immunocytokjemi
<ol><li>Vask cellene med PBS (250 μL / brønn) 1x i 5 minutter.</li>
	<li>Permeabiliser cellene med 0,1% Triton X-100 (100 μL/brønn) i PBS i 5 minutter.</li>
	<li>Vask cellene med PBS (250 μL / brønn) 3x i 5 min hver.</li>
	<li>For blokkering, bruk 3% bovint serumalbumin i PBS (PBSA; 100 μL / brønn) i 1 time ved RT.</li>
	<li>Inkuber cellene med anti-drebrin (1:1) og anti-Microtubule Associated Protein 2 (MAP2) (1:000) antistoffer (60 μL/brønn) ved 4 °C over natten.</li>
	<li>Vask cellene med PBS (250 μL / brønn) 4x i 5 min hver.</li>
	<li>Inkuber cellene med passende sekundære antistoffer og 4',6-diamidino-2-fenylindol, dihydroklorid (DAPI; 1:1000) i PBSA (60 μL / brønn) i 2 timer ved RT.</li>
	<li>Vask cellene med PBS (250 μL / brønn) 4x i 5 min hver.</li>
	<li>Oppbevar cellene i PBS inneholdende 0,1 % natriumazid (150 μL/brønn).</li>
</ol>7. Bildeinnsamling og analyse
<ol><li>For å skaffe bildene, bruk et passende mikroskop.</li>
	<li>For å identifisere cellekroppene til nevroner, bruk både MAP2-positive og DAPI-positive regioner.</li>
	<li>For å identifisere dendritter av nevroner, bruk MAP2-positive signaler uten cellelegemer.</li>
	<li>For å identifisere drebrin-klynger, bruk drebrin-positive signaler langs MAP2-positive dendritter.</li>
</ol>

<ol>
	<li>Banker, G. A., Cowan, W. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rat+hippocampal+neurons+in+dispersed+cell+culture.">Rat hippocampal neurons in dispersed cell culture.</a> Brain Research. 126 (3), 397-342 (1977).</li><li>Kaech, S., Banker, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Culturing+hippocampal+neurons.">Culturing hippocampal neurons.</a> Nature Protocols. 1 (5), 2406-2415 (2006).</li><li>Roppongi, R. T., Champagne-Jorgensen, K. P., Siddiqui, T. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Low-density+primary+hippocampal+neuron+culture.">Low-density primary hippocampal neuron culture.</a> Journal of Visualized Experiments. (122), e55000 (2017).</li><li>Mizui, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Drebrin+E+is+involved+in+the+regulation+of+axonal+growth+through+actin-myosin+interactions.">Drebrin E is involved in the regulation of axonal growth through actin-myosin interactions.</a> Journal of Neurochemistry. 109 (2), 611-622 (2009).</li><li>Mizui, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Myosin+II+ATPase+activity+mediates+the+long-term+potentiation-induced+exodus+of+stable+F-actin+bound+by+drebrin+A+from+dendritic+spines.">Myosin II ATPase activity mediates the long-term potentiation-induced exodus of stable F-actin bound by drebrin A from dendritic spines.</a> PLoS One. 9 (1), 85367 (2014).</li><li>Takahashi, H., Mizui, T., Shirao, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Down-regulation+of+drebrin+A+expression+suppresses+synaptic+targeting+of+NMDA+receptors+in+developing+hippocampal+neurons.">Down-regulation of drebrin A expression suppresses synaptic targeting of NMDA receptors in developing hippocampal neurons.</a> Journal of Neurochemistry. 97, 110-115 (2006).</li><li>Takahashi, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Drebrin-dependent+actin+clustering+in+dendritic+filopodia+governs+synaptic+targeting+of+postsynaptic+density-95+and+dendritic+spine+morphogenesis.">Drebrin-dependent actin clustering in dendritic filopodia governs synaptic targeting of postsynaptic density-95 and dendritic spine morphogenesis.</a> The Journal of Neuroscience. 23 (16), 6586-6595 (2003).</li><li>Yamazaki, H., Sasagawa, Y., Yamamoto, H., Bito, H., Shirao, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CaMKIIbeta+is+localized+in+dendritic+spines+as+both+drebrin-dependent+and+drebrin-independent+pools.">CaMKIIbeta is localized in dendritic spines as both drebrin-dependent and drebrin-independent pools.</a> Journal of Neurochemistry. 146 (2), 145-159 (2018).</li><li>Hanamura, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-content+imaging+analysis+for+detecting+the+loss+of+drebrin+clusters+along+dendrites+in+cultured+hippocampal+neurons.">High-content imaging analysis for detecting the loss of drebrin clusters along dendrites in cultured hippocampal neurons.</a> Journal of Pharmacological and Toxicological Methods. 99, 106607 (2019).</li><li>Mitsuoka, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Assessment+of+NMDA+receptor+inhibition+of+phencyclidine+analogues+using+a+high-throughput+drebrin+immunocytochemical+assay.">Assessment of NMDA receptor inhibition of phencyclidine analogues using a high-throughput drebrin immunocytochemical assay.</a> Journal of Pharmacological and Toxicological Methods. 99, 106583 (2019).</li><li>Ishizuka, Y., Bramham, C. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+simple+DMSO-based+method+for+cryopreservation+of+primary+hippocampal+and+cortical+neurons.">A simple DMSO-based method for cryopreservation of primary hippocampal and cortical neurons.</a> Journal of Neuroscience Methods. 333, 108578 (2020).</li><li>Pischedda, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cryopreservation+of+primary+mouse+neurons:+The+benefit+of+neurostore+cryoprotective+medium.">Cryopreservation of primary mouse neurons: The benefit of neurostore cryoprotective medium.</a> Frontiers in Cellular Neuroscience. 12, 81 (2018).</li><li>Kobayashi, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Impairment+of+ciliary+dynamics+in+an+APP+knock-in+mouse+model+of+Alzheimer's+disease.">Impairment of ciliary dynamics in an APP knock-in mouse model of Alzheimer's disease.</a> Biochemical and Biophysical Research Communications. 610, 85-91 (2022).</li><li>Kobayashi, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Properties+of+primary+cilia+in+melanin-concentrating+hormone+receptor+1-bearing+hippocampal+neurons+in+vivo+and+in+vitro.">Properties of primary cilia in melanin-concentrating hormone receptor 1-bearing hippocampal neurons in vivo and in vitro.</a> Neurochemistry International. 142, 104902 (2021).</li><li>Koganezawa, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=NMDA+receptor-dependent+and+-independent+effects+of+natural+compounds+and+crude+drugs+on+synaptic+states+as+revealed+by+drebrin+imaging+analysis.">NMDA receptor-dependent and -independent effects of natural compounds and crude drugs on synaptic states as revealed by drebrin imaging analysis.</a> The European Journal of Neuroscience. 53 (11), 3548-3560 (2021).</li><li>Mizui, T., Takahashi, H., Sekino, Y., Shirao, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Overexpression+of+drebrin+A+in+immature+neurons+induces+the+accumulation+of+F-actin+and+PSD-95+into+dendritic+filopodia,+and+the+formation+of+large+abnormal+protrusions.">Overexpression of drebrin A in immature neurons induces the accumulation of F-actin and PSD-95 into dendritic filopodia, and the formation of large abnormal protrusions.</a> Molecular and Cellular Neurosciences. 30 (1), 149-157 (2005).</li><li>Sekino, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Activation+of+N-methyl-D-aspartate+receptor+induces+a+shift+of+drebrin+distribution:+disappearance+from+dendritic+spines+and+appearance+in+dendritic+shafts.">Activation of N-methyl-D-aspartate receptor induces a shift of drebrin distribution: disappearance from dendritic spines and appearance in dendritic shafts.</a> Molecular and Cellular Neurosciences. 31 (3), 493-504 (2006).</li><li>Takahashi, H., Yamazaki, H., Hanamura, K., Sekino, Y., Shirao, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Activity+of+the+AMPA+receptor+regulates+drebrin+stabilization+in+dendritic+spine+morphogenesis.">Activity of the AMPA receptor regulates drebrin stabilization in dendritic spine morphogenesis.</a> Journal of Cell Science. 122, 1211-1219 (2009).</li><li>Aoki, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Drebrin+A+is+a+postsynaptic+protein+that+localizes+in+vivo+to+the+submembranous+surface+of+dendritic+sites+forming+excitatory+synapses.">Drebrin A is a postsynaptic protein that localizes in vivo to the submembranous surface of dendritic sites forming excitatory synapses.</a> The Journal of Comparative Neurology. 483 (4), 383-402 (2005).</li><li>Koganezawa, N., Hanamura, K., Sekino, Y., Shirao, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+role+of+drebrin+in+dendritic+spines.">The role of drebrin in dendritic spines.</a> Molecular and Cellular Neurosciences. 84, 85-92 (2017).</li><li>Shirao, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+role+of+drebrin+in+neurons.">The role of drebrin in neurons.</a> Journal of Neurochemistry. 141 (6), 819-834 (2017).</li><li>Sekino, Y., Koganezawa, N., Mizui, T., Shirao, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Role+of+drebrin+in+synaptic+plasticity.">Role of drebrin in synaptic plasticity.</a> Advances in Experimental Medicine and Biology. 1006, 183-201 (2017).</li><li>Togo, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Postsynaptic+structure+formation+of+human+iPS+cell-derived+neurons+takes+longer+than+presynaptic+formation+during+neural+differentiation+in+vitro.">Postsynaptic structure formation of human iPS cell-derived neurons takes longer than presynaptic formation during neural differentiation in vitro.</a> Molecular Brain. 14 (1), 149 (2021).</li></ol>

Tomoaki Shirao er administrerende direktør i AlzMed, Inc. Studien ble finansiert av AlzMed, Inc. (500 000 JPY til NK for prosjektet "High-throughput analysis of synaptic function").

Et kritisk skritt i denne metoden er å tine cellesuspensjonen. Overføring av cellesuspensjonen før den blir for varm er svært viktig. For å unngå rask endring av osmolalitet må du imidlertid ikke overføre cellesuspensjonen til et stort volum av mediet samtidig. Dråpevis tilsetning av kulturmediet er også avgjørende for å unngå plutselige endringer i osmotisk trykk.
Nevronene kan dyrkes i andre kulturkar: 24-brønnsplater, 8-brønnskamre, 60 mm retter eller MED-sonder. I slike tilfeller må imidlertid den endelige konsentrasjonen og tidspunktet for tilsetning av Ara-C justeres. I tillegg må tettheten av nevroner optimaliseres i forskjellige typer eksperimenter. For eksempel kreves kultur med høy tetthet for elektrofysiologiske eksperimenter, og i så fall er medieutvekslingen nødvendig to ganger i uken (figur 6). Dermed krever en kultur med lav tetthet færre trinn enn en kultur med høy tetthet.
Neuronkultur med lav tetthet krever ofte forhåndsteknikker; Bruk av bruksklar frossen lager løser imidlertid dette problemet. Den beskrevne metoden er ikke avhengig av en eksperimenters ferdighet. Kvaliteten på frossen bestand er stabil og kan dyrkes stabilt så lenge de lagres i flytende nitrogen og unngår temperaturendringer i opptil 4 år.
Dyrking av cellene i 3 uker uten middels utveksling reiser spørsmålet om det er signifikante osmolalitetsendringer eller kulturmediefordampning. Vi har imidlertid bekreftet at fordampningen av kulturmediet er liten (reduksjonsgrad på 3,6%). Lokaliseringen av synaptiske proteiner og nevronens morfologi virker normal etter 3 uker. Derfor forårsaker 3-ukers kultur uten medieutveksling ikke store osmolalitetsendringer som påvirker forholdene til de dyrkede nevronene. Å holde platen i en inkubator etter Ara-C-behandling er også et viktig punkt som minimerer fordampning.
Det er ingen begrensning med hensyn til bruken av de frosne stamnevronene. Det er imidlertid noen begrensninger ved kulturmetoden med lav tetthet. Vi bekreftet at lavdensitetskulturen kunne brukes til morfologisk observasjon av nevroner, evaluering av synaptisk funksjon og GFP-transfeksjon. Vi har imidlertid ikke undersøkt levende celleavbildning. I tillegg, som nevnt ovenfor, er det nødvendig med høy tetthetskultur for å utføre elektrofysiologi.
Synapsemodning tar vanligvis 3 uker7, og vi kan ikke bekrefte at de dyrkede nevronene har riktige synapser til slutten. Hvis synapsemodningen ikke er god etter 3 uker, må vi dyrke igjen. Ved å vite kvaliteten på nevronene før vi starter forsøkene, kan vi spare disse 3 ukene. Derfor, for å utføre eksperimenter effektivt, er det best å sjekke kvaliteten på nevronene på forhånd. Frosne lagre gjør det mulig å sjekke kvaliteten på nevronene på forhånd. Hvert parti med fryste bestander genereres fra ett kull rotter, og vi kan bruke en av bestandene fra hver batch til en kvalitetskontroll. Drebrin er en god markør for kvalitetskontroll av nevronene. Som beskrevet akkumuleres drebrin i ryggraden i modne nevroner, og det reagerer på synaptisk stimulering. Dermed kan vi sjekke kvaliteten på nevronene i frosne lagre ved å bruke drebrin som markør.
Denne metoden kan brukes til å evaluere effekten av legemidler på synaptisk tilstand. Drebrin exodus fra dendritiske pigger forekommer i begynnelsen av synaptisk plastisitet22. Derfor viser påvisning av drebrin-klyngereduksjon fremkalt ved medikamentell behandling at stoffet stimulerer synapsen og forårsaker synaptisk plastisitet. Videre, for å identifisere om reduksjonen er NMDAR-avhengig, er et eksperiment med 2-amino-5-fosfonovalersyre (APV, en NMDAR-antagonist) nyttig. Ved å bruke drebrin som markør, er selv en NMDAR-avhengighet klart bestemt10,15. Den beskrevne metoden er nyttig i legemiddelundersøkelser, sikkerhetsfarmakologiske studier og evaluering av synaptisk funksjon.

Utviklingen av et in vitro eksperimentelt system som kan vurdere synaptiske funksjoner involvert i læring og hukommelse er viktig. Neuronal kultur er et verdifullt system for evaluering av synaptiske funksjoner in vitro. Den neuronale kulturteknikken ble først brukt på 1980-tallet, og på 1990-tallet ble lavdensitetskultur av primære hippocampus-nevroner utviklet 1,2,3 for studiet av individuelle nevroner når det gjelder subcellulær lokalisering av proteinkomponenter, proteinhandel, nevronpolaritet, ryggradsmorfologi, synapseutvikling og plastisitet 4,5,6,7,8 . Imidlertid er det mange trinn involvert i denne teknikken: parring av dyr, dissekering av embryoer, forberedelse av kulturbeholdere og dyrking av celler i 3 uker med medieendringer en gang i uken. I tillegg krever det forhåndsteknikker3.
Vi har utviklet frosne bestander av dissosierte hippocampus-nevroner fra rotteembryoer 9,10. De frosne lagrene av nevroner er klare til bruk, og det kreves ingen forhåndsteknikker for å dyrke cellene11,12. Med andre ord, dyrking av nevronene fra frosne bestander er ikke avhengig av teknikken til en eksperimentator. Det eliminerer behovet for dyreforsøk (f.eks. tillatelse til dyreforsøk, arrangering av tidsbestemte drektige dyr og dissekering av rotteembryoer), og reduserer dermed antall dyr som brukes. Nylig har frosne lagre av nevroner av høy kvalitet blitt kommersielt tilgjengelige. Her brukte vi kommersielt tilgjengelige frosne bestander fra embryonale dag (E) 18 rotte hippocampus13,14,15. Dyrking av nevronene fra en frossen bestand krever ikke gliabetingede medier eller samkultur med gliaceller. Vanlige primærkulturmedier uten ekstra serum kan brukes til å dyrke cellene; Derfor kan vi skaffe reproduserbare data. Videre er det ikke behov for medieutveksling i 3 uker etter cellesåingen, da veksten av gliaceller er redusert (figur 1).
Dendritiske pigger er det postsynaptiske rommet til de fleste eksitatoriske synapser. De inneholder reseptorproteiner, postsynaptiske stillasproteiner og aktincytoskeletale proteiner. Vi fokuserte på et aktinbindende protein drebrin 5,6,7,16,17,18. Drebrin akkumuleres ved ryggradshodet i modne nevroner19, og vi rapporterte drebrin som markør for synaptisk tilstand 15,17,20,21,22,23. Ved å gjennomføre en analyse med høyt innhold ved bruk av drebrin som avlesning, har vi nylig rapportert de hemmende effektene av fensyklidinanaloger på N-metyl-D-asparaginsyre-type glutamatreseptorer (NMDARs)10 og de NMDAR-avhengige effektene av naturlige forbindelser og rå stoffer på synaptiske tilstander15.
Her beskriver vi hvordan man dyrker frosne bestander av nevroner ved lav tetthet. I tillegg viser vi en drebrin imaging-basert evaluering av synaptisk tilstand ved hjelp av 96-brønnplater.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>96 well plate</td>
			<td>Zeon Corporation</td>
			<td></td>
			<td>Gifted</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96 well plate</td>
			<td>greiner</td>
			<td>655986</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-drebrin antibody (M2F6)</td>
			<td>MBL</td>
			<td>D029-3</td>
			<td>Mouse monoclonal (dilution 1:1)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-MAP2 antibody</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>AB5622</td>
			<td>Rabbit&#160; (dilution 1:1000)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-mouse Alexa Fluor 568</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>A11031</td>
			<td>Dilution 1: 500</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-rabbit Alexa Fluor&#160;</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>A11008</td>
			<td>Dilution 1: 500</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>B-27</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>17504-044</td>
			<td>2 v/v% for MEA plates; 50x for normal plates</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Borax</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>B-9876</td>
			<td>Final concentration 12 mM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Boric acid</td>
			<td>WAKO</td>
			<td>021-02195</td>
			<td>Final concentration 50 mM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine serum albumin</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>12659-100G</td>
			<td>Final concentration: 3% in PBS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Confocal quantitative image cytometer 
			CellVoyager CQ1</td>
			<td>YOKOGAWA</td>
			<td></td>
			<td>Phase contrast images</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cytosine &#946;-D-arabino-furanoside (Ara-C)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>C-6645</td>
			<td>Diluted in dH2O (final concentration: 0.2 &#181;M)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DAPI</td>
			<td>FUJIFILM</td>
			<td>340-07971</td>
			<td>Dilution 1:1000</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GlutaMAX</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>35050-061</td>
			<td>&#160;2.5 mM for MEA plates; 400x for normal plates</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>In Cell Analyzer 2200</td>
			<td>Cytiva</td>
			<td></td>
			<td>Fluorescence images</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Laminin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>114956-81-9</td>
			<td>Final concentration: 20 &#181;g/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Maestro</td>
			<td>Axion Biosystems</td>
			<td></td>
			<td>MEA recordings</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MEA plate</td>
			<td>Axion Biosystems</td>
			<td>M768-tMEA-48W</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Neurobasal</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>21103-049</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde</td>
			<td>nacalai tesque</td>
			<td>26126-25</td>
			<td>Final concentration: 4% in PBS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin/Streptomycin</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15140-122</td>
			<td>&#160;100 U/mL for normal plates</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin/Streptomycin</td>
			<td>nacalai tesque</td>
			<td>26253-84</td>
			<td>100 &#181;g/mL for MEA plates</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>polyethyleimine</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>9002-98-6</td>
			<td>Final concentration: 0.1%</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Poly-L-lysine</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P2636</td>
			<td>Diluted in the borate buffer (final concentration: 1 mg/mL)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SKY Neuron</td>
			<td>AlzMed , Inc.</td>
			<td>ARH001</td>
			<td>1.0 x 106 cells/tube</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium azide</td>
			<td>FUJIFILM</td>
			<td>195-11092</td>
			<td>0.1%</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SodiumL(+)-Glutamate monohydrate</td>
			<td>WAKO</td>
			<td>194-02032</td>
			<td>Diluted in dH2O (final concentrations: 1 &#181;M, 3 &#181;M, 10 &#181;M, 30 &#181;M, 100 &#181;M)</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

easy and reproducible low-density primary culture using frozen stock of embryonic hippocampal neurons

Neuronal kultur er et verdifullt system for evaluering av synaptiske funksjoner og legemiddelundersøkelser. Spesielt tillater en lavtetthetskultur av primære hippocampus-nevroner studiet av individuelle nevroner eller subcellulære komponenter. Vi har vist subcellulær proteinlokalisering i et nevron ved immunocytokjemi, nevronpolaritet, synaptisk morfologi og dens utviklingsendring ved bruk av en primær hippocampuskultur med lav tetthet. Nylig har klare frosne lagre av nevroner blitt kommersielt tilgjengelige. Disse frosne bestandene av nevroner reduserer tiden som trengs for å forberede dyreforsøk og bidrar også til reduksjon av antall dyr som brukes. Her introduserer vi en reproduserbar primærkulturmetode med lav tetthet ved bruk av en 96-brønnsplate. Vi brukte en kommersielt tilgjengelig frossen bestand av nevroner fra rotteembryonale hippocampus. Nevronene kan dyrkes stabilt på lang sikt uten medieendringer ved å redusere veksten av gliaceller på bestemte tidspunkter. Denne analysen med høy gjennomstrømning ved bruk av kultur med lav tetthet tillater reproduserbare bildebaserte evalueringer av synaptisk plastisitet.

Etter protokollen ble nevronene dyrket i en 96-brønns plate i 21 dager, og deretter behandlet med glutamat (figur 1). Nevronene utviklet seg normalt uten bytte av dyrkningsmedium i 3 uker (figur 2). Vi behandlet cellene med flere konsentrasjoner av glutamat (1 μM, 3 μM, 10 μM, 30 μM og 100 μM fortynnet i sterilisert vann) i 10 minutter og fikserte dem. Immuncytokjemi ble utført, og fluorescensbilder av drebrin og MAP2 ble tatt med automatisert fluorescensmikroskop med sCMOS-kamera. Som vist i figur 3 observeres drebrinpositive dendrittiske pigger tydelig langs MAP2-positive dendritter. Det er vist at glutamatstimulering fremkaller Ca2+ tilstrømning gjennom NMDAR, noe som forårsaker drebrin exodus fra dendritiske pigger som resulterer i en reduksjon av drebrin cluster tettheter 5,17. Følgelig observerte vi den doseavhengige reduksjonen av drebrinklasetettheter mot glutamatstimulering10 (figur 4). Som vist i figur 5 er denne metoden sterkt reproduserbar hvis drebrin brukes som markør for synaptiske tilstander.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64872/64872fig01.jpg"> Figur 1: Skjema for metoden. Nevronene ble dyrket i en 96-brønns plate i 21 dager, og deretter behandlet med glutamat. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64872/64872fig01large.jpg" target="_blank">Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64872/64872fig02.jpg"> Figur 2: Lysfeltbilder av dyrkede nevroner ved hjelp av en 96-brønnsplate. Fasekontrastbilder ble tatt fra hvert utviklingsstadium (DIV 1, 7, 14, 21) ved bruk av et konfokalt kvantitativt bildecytometer. Skala bar: 50 μm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64872/64872fig02large.jpg" target="_blank">Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64872/64872fig03.jpg"> Figur 3: Representative bilder av immunfargede dyrkede nevroner. (Venstre) Sammenslåtte fluorescensbilder av drebrin (grønn) og MAP2 (rød). Hvert fluorescensbilde av drebrin og MAP2 viste i henholdsvis midtre og høyre panel. Hvite rektangler viser området forstørret nedenfor. Skala barer; Øvre paneler: 50 μm, nedre paneler: 20 μm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64872/64872fig03large.jpg" target="_blank">Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64872/64872fig04.jpg"> Figur 4: Glutamatavhengige dose-respons endringer i normalisert drebrin cluster density. (A) Representative fluorescensbilder immunfarget med drebrin (grønn) og MAP2 (rød) fra brønnen som behandles med 0 μM, 10 μM og 100 μM glutamat (fra venstre mot høyre). Skala bar: 50 μm. (B) Drebrin cluster tetthet ble normalisert ved gjennomsnittet av kontroll (0 μM). 0 μM, N = 58 brønner; 1 μM, N = 46; 3 μM, N = 54; 10 μM, N = 45; 30 μM, N = 54; 100 μM, N = 55, fra 13 eksperimenter med forskjellige partier. ** P < 0,01 versus kontroll (0 μM) av Dunnetts multiple sammenligningstest etter ANOVA. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64872/64872fig04large.jpg" target="_blank">Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64872/64872fig05.jpg"> Figur 5: Glutamatavhengige dose-respons endringer i drebrin cluster density. Rådataene fra seks eksperimenter med forskjellige partier. N = 4 brønner for hver konsentrasjon (0 μM, 3 μM, 10 μM, 30 μM og 100 μM). Verdier uttrykkes som gjennomsnitt ± SEM. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64872/64872fig05large.jpg" target="_blank">Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.</a>
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64872/64872fig06.jpg"> Figur 6: Anvendelse av de frosne bestandene av nevroner til elektrofysiologiske eksperimenter. (A) En protokoll for elektrofysiologiske eksperimenter ved bruk av mikroelektrode-array (MEA) plater. Belegg: En dag før plating av cellene ble hver 48-brønns MEA-plate forhåndsbelagt med en polyetylenimin (PEI: 0,1%) løsning og inkubert i 1 time ved 37 ° C. MEA-platen ble deretter vasket 3x med sterilisert vann og tørket i 1 time. Deretter ble MEA-platen holdt på 4 °C over natten. Høy tetthetskultur: 50.000 celler / brønn av nevronene ble belagt på 48-brønns MEA-plater. Cellesåingstrinnet ble utført som beskrevet i avsnitt 2 i den ovenfor beskrevne protokollen. Laminin (20 μg/ml) tilsatt kulturmedium (tilsett 2 v/v% B-27, 2,5 mM glutamax og 100 μg/ml penicillin/streptomycin til det nevrobasale medium) ble brukt til å plate nevronene. Deretter ble nevronene dyrket ved 37 °C, 5% CO2 i kulturmediet. Mediene ble utvekslet fullt ut på DIV 1 med kulturmediet frem til DIV 3. Ara-C ble tilsatt ved DIV 4 (endelig 0,2 μM). Fra DIV 5 og utover og 2 ganger i uken ble 50% av mediene endret med kulturmediet. Aktiviteten til nevronene på hver brønn på MEA-platen ble registrert med et MEA-system. (B) Spontan nevronaktivitet ble oppnådd ved 37 °C under en 5 % CO2 atmosfære ved bruk av et MEA-system med en samplingsfrekvens på 12,5 kHz/kanal ved DIV 21. Opptak fra 4 kanaler av de 16 kanalene i en brønn vises. For alle opptakene ble det brukt et Butterworth-båndpassfilter (200-3000 Hz). Pilspisser viser tidspunktet for synkronisert utløsing. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64872/64872fig06large.jpg" target="_blank">Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Easy and Reproducible Low-Density Primary Culture using Frozen Stock of Embryonic Hippocampal Neurons at JoVE.com

Easy and Reproducible Low-Density Primary Culture using Frozen Stock of Embryonic Hippocampal Neurons

En klar til bruk frossen bestand av nevroner er et kraftig verktøy for å evaluere synaptiske funksjoner. Her introduserer vi en enkel primærkultur med lav tetthet fra frossen bestand ved hjelp av en 96-brønnsplate.

Enkel og reproduserbar primærkultur med lav tetthet ved bruk av frossen bestand av embryonale hippocampus-nevroner

Neuronal culture is a valuable system for evaluating synaptic functions and drug screenings. In particular, a low-density culture of primary hippocampal ...

De frosne lagrene av rotteembryonale nevroner er klare til bruk, og ingen avanserte teknikker er nødvendige for å dyrke cellene. Denne teknikken er veldig enkel, og du trenger ingen tillatelse til dyreforsøk, arrangere tidsbestemte gravide dyr eller dissekere embryoer. Nevronene kan dyrkes i andre kulturkar og brukes til andre typer eksperimenter.For eksempel mikroelektrodeplater for elektrofysiologiske eksperimenter. Begynn med å belegge en 96-brønns mikroplate med 100 mikroliter poly-L-lysin per brønn. Deretter ruger du platene over natten ved 37 grader Celsius.På slutten av inkubasjonen, fjern poly-L-lysinoppløsningen. Vask platene to ganger med sterilisert vann og en gang med supplementfritt, friskt kulturmedium. Legg platene ut for å tørke.Tørre plater kan pakkes inn og lagres i opptil en måned ved fire grader Celsius. For å starte cellesåing, tilsett 50 mikroliter av kulturmediet til hver brønn i de belagte platene. Fyll de perifere brønnene med 200 mikroliter sterilisert vann og inkuber platen i en time ved 37 grader Celsius med 5% karbondioksid.Fjern neuron cryo-hetteglasset fra tanken med flytende nitrogen og legg det i en 37 graders varmeblokk for delvis å tine innholdet. Bruk en milliliter pipette med en bred borespiss, og overfør sakte innholdet i hetteglassene dråpevis til et sterilt 50 milliliter rør. Skyll det tomme kryohetteglasset med en milliliter romtemperert kulturmedium.Overfør skylleoppløsningen til 50 milliliters røret som inneholder cellesuspensjonen. Deretter tilsettes ni milliliter av romtemperaturkulturmediet dråpevis inn i 50 milliliters røret, og utgjør volumet til 11 milliliter. Etter å ha talt cellene ved hjelp av et hemocytometer, overfør cellesuspensjonen til et reservoar.Nå, ved hjelp av en flerkanals pipette med brede borespisser, dispenserer cellesuspensjonen med en endelig telling på 1,0 ganger 10 til de fire cellene per brønn inn i den belagte 96-brønnplaten. Inkuber nevronene i en til to timer ved 37 grader Celsius under 5% karbondioksid. Deretter erstattes kulturmediet med 100 mikroliter forvarmet kulturmedium og inkuberes igjen under de samme forholdene.Etter fire dager in vitro, tilsett cytosin beta-D-arabinofuranosid i den endelige konsentrasjonen på 0,2 mikromolar per brønn for å redusere veksten av gliaceller. Plasser platen tilbake i inkubatoren. Etter 21 dager in vitro, behandle cellene med stoffene av interesse.For å opprettholde en positiv kontroll, behandle celler med 100 mikromolar glutamat per brønn i 10 minutter ved 37 grader Celsius før fiksering. Før du utfører immunocytokjemiske studier, fikser cellene i 20 minutter ved å erstatte kulturløsningen med 100 mikroliter paraformaldehyd i hver brønn. Etter fiksering, vask brønnene to ganger med 250 mikroliter fosfatbufret saltvann per brønn i fem minutter hver.I denne studien ble nevronene utviklet normalt uten å bytte kulturmediet i tre uker. Immunhistokjemi viste drebrinpositive dendrittiske pigger langs de MAP2-positive dendrittene. Den doseavhengige reduksjonen av drebrinklasetettheter mot glutamatstimulering ble observert.Transplantasjonen av cellesuspensjonen før den blir for varm er svært viktig. Den dråpevise tilsetningen av kulturmedium er også avgjørende for å unngå plutselig endring i osmolaritet.

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Dissection and Culture of Commissural Neurons from Embryonic Spinal Cord

Commissural neurons have been widely used to investigate the mechanisms underlying axon guidance during embryonic spinal cord development. The cell bodies ...

Nucleofection and Primary Culture of Embryonic Mouse Hippocampal and Cortical Neurons

Hippocampal and cortical neurons have been used extensively to study central nervous system (CNS) neuronal polarization, axon/dendrite outgrowth, and ...

Bilaminar Co-culture of Primary Rat Cortical Neurons and Glia

Bilaminar Co-kultur Primary Rat kortikale nevroner og gliaceller

This video will guide you through the process of culturing rat cortical neurons in the presence of a glial feeder layer, a system known as a bilaminar or ...

Isolation and Culture of Hippocampal Neurons from Prenatal Mice

Isolering og kultur hippocampus Nerveceller fra Prenatal Mus

Primary cultures of rat and murine hippocampal neurons are widely used to reveal cellular mechanisms in neurobiology. By isolating and growing individual ...

Assaying DNA Damage in Hippocampal Neurons Using the Comet Assay

Analysere DNA-skader i hippocampus Neurons kometsystemet

A number of drugs target the DNA repair pathways and induce cell kill by creating DNA damage. Thus, processes to directly measure DNA damage have been ...

Preparation of Primary Neurons for Visualizing Neurites in a Frozen-hydrated State Using Cryo-Electron Tomography

Utarbeidelse av Primary nevroner for å visualisere neurites i en Frozen hydrert tilstand ved hjelp av Cryo-Electron Tomography

Neurites, both dendrites and axons, are neuronal cellular processes that enable the conduction of electrical impulses between neurons. Defining the ...

Calcium Phosphate Transfection of Primary Hippocampal Neurons

Kalsium Fosfat Transfection of Primary hippocampus nevroner

Calcium phosphate precipitation is a convenient and economical method for transfection of cultured cells. With optimization, it is possible to use this ...

Imaging Dendritic Spines of Rat Primary Hippocampal Neurons using Structured Illumination Microscopy

Imaging dendrittutløperne av Rat Primary hippocampus nevroner bruker Strukturert Illumination Mikros

Dendritic spines are protrusions emerging from the dendrite of a neuron and represent the primary postsynaptic targets of excitatory inputs in the brain. ...

Primary Culture of Mouse Dopaminergic Neurons

Primær Culture of Mouse dopaminerge nevroner

Dopaminergic neurons represent less than 1% of the total number of neurons in the brain. This low amount of neurons regulates important brain functions ...

Isolation, Culture and Long-Term Maintenance of Primary Mesencephalic Dopaminergic Neurons From Embryonic Rodent Brains

Isolasjon, Kultur og langsiktig vedlikehold av Primary mesencefalisk dopaminerge nevroner Fra Embryonic Gnagere Brains

Degeneration of mesencephalic dopaminergic (mesDA) neurons is the pathological hallmark of Parkinson&#8217;s diseae. Study of the biological processes ...