Name: easy and reproducible low-density primary culture using frozen stock of embryonic hippocampal neurons
Uploaded: 2023-01-27T14:15:00
Duration: 4 min 26 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Easy and Reproducible Low-Density Primary Culture using Frozen Stock of Embryonic Hippocampal Neurons at JoVE.com

Vi tackar Kazumi Kamiyama och Manami Kawada för hjälp med experiment. Detta arbete stöddes av JSPS KAKENHI (bidragsnummer 19K08010 till N.K.) och Japan Agency for Medical Research and Development (AMED) (bidragsnummer JP19bk0104077 och JP22bm0804024 till T.S.).

1. Plattbeläggning
<ol><li>Belägg en mikroplatta med 96 brunnar med poly-L-lysin (1 mg/ml, utspädd i 0,1 M boratbuffert [pH: 8,5]; 100 μl/brunn) och inkubera över natten vid 37 °C. OBS: Belägg endast de brunnar som behöver användas. I de experiment som utförs här används de mellersta 60 brunnarna. Boratbufferten framställs genom att blanda 50 mM borsyra och 12 mM borat i steriliserat vatten.</li>
	<li>Tvätta plattan två gånger med steriliserat vatten (250 μl/brunn).</li>
	<li>Tvätta plattan en gång med färskt odlingsmedium utan tillskott (250 μl/brunn).</li>
	<li>Torka plattan på en ren bänk i 20 min.</li>
	<li>Linda in plattan med aluminiumfolie och håll den vid 4 °C tills den används (giltig i 1 månad).</li>
</ol>2. Cell sådd
<ol><li>Tillsätt 50 μl/brunn av odlingsmediet till den belagda plattan och förvara den i en 37 °C, 5 % CO2-inkubator i 30 minuter till 1 timme. Fyll de perifera brunnarna med steriliserat vatten (200 μl/brunn). OBS: Odlingsmediet framställs genom tillsats av 50x B-27, 400x Glutamax och 100 U / ml penicillin / streptomycin till det neurobasala mediet (se materialtabellen för detaljer).</li>
	<li>Ta bort neuronkryovialen från tanken med flytande kväve. De neuroner som användes här var DMSO-kryokonserverade neuroner11.</li>
	<li>Sänk ner kryovialen i ett 37 °C värmeblock i upp till 3 minuter och tina innehållet delvis. Värm inte upp kryovialen för länge. Överför innehållet till ett 50 ml rör så snart det tinas.</li>
	<li>Överför långsamt neuronkryovialinnehållet till ett sterilt 50 ml rör droppvis (50 μL / s) med en 1 ml pipett med en bredporspets.</li>
	<li>Skölj den tomma kryovialen med 1 ml odlingsmedium (rumstemperatur; RT). Överför dessa 1 ml av odlingsmediet från kryovialen droppvis (50 μl/s) till 50 ml röret innehållande cellsuspensionen.</li>
	<li>Tillsätt 9 ml av odlingsmediet (RT) till 50 ml röret droppvis (0,5 ml / s) och fyll volymen till 11 ml. Upprepa inte pipettering, men blanda cellsuspensionen långsamt.</li>
	<li>Räkna cellnumret (använd en cellräknare eller en hemocytometer).</li>
	<li>Överför all cellsuspension till en behållare och fördela cellsuspensionen till 96-brunnsplattan med en flerkanalig pipett med breda porspetsar (1,0 x 104 celler / brunn). För att minska avdunstningen av odlingsmediet, fyll de perifera brunnarna med steriliserat vatten (steg 2.1). OBS: Denna studie bekräftar att avdunstningen av odlingsmediet är liten för en 3-veckors kultur utan mediumutbyte. Reduktionshastigheten för mediet är 3,6% (n = 120 brunnar). Således kommer osmolalitetsförändringen inte att vara drastisk under 3-veckors inkubationsperioden.</li>
	<li>Inkubera neuronerna i 1-2 timmar i en 37 °C, 5% CO2-inkubator .</li>
	<li>Byt ut odlingsmediet mot 100 μl förvärmt odlingsmedium (37 °C) per brunn och sätt tillbaka det i en 37 °C, 5 % CO2-inkubator (ingen mediumförändring krävs under odlingen).</li>
</ol>3. Ara-C-behandling
<ol><li>Vid 4 dagar in vitro (DIV), tillsätt cytosin β-D-arabino-furanosid (Ara-C) till en slutlig koncentration av 0,2 μM per brunn för att minska tillväxten av gliaceller.</li>
</ol>4. Läkemedelsbehandlingar
<ol><li>Vid 21 dagar in vitro, behandla cellerna med läkemedlen av intresse.</li>
	<li>Håll plattans temperatur vid 37 °C under läkemedelsbehandlingar.</li>
	<li>För en positiv kontroll, behandla cellerna med 100 μM glutamat (per brunn för slutlig koncentration) i 10 minuter före fixering.</li>
</ol>5. Fixering
<ol><li>För fixeringen, använd 4% paraformaldehyd i 0,1 M fosfatbuffert (100 μL / brunn).</li>
	<li>Efter ~ 20 minuters fixering, tvätta brunnarna med fosfatbuffrad saltlösning (PBS; 250 μL / brunn) 2x i 5 min vardera.</li>
</ol>6. Immunocytokemi
<ol><li>Tvätta cellerna med PBS (250 μL/brunn) 1x i 5 min.</li>
	<li>Permeabilisera cellerna med 0,1% Triton X-100 (100 μL/brunn) i PBS i 5 min.</li>
	<li>Tvätta cellerna med PBS (250 μL/brunn) 3x i 5 min vardera.</li>
	<li>För blockering, använd 3% bovint serumalbumin i PBS (PBSA; 100 μL/brunn) i 1 timme vid RT.</li>
	<li>Inkubera cellerna med anti-drebrin (1:1) och anti-mikrotubuliassocierat protein 2 (MAP2) (1:000) antikroppar (60 μl/brunn) vid 4 °C över natten.</li>
	<li>Tvätta cellerna med PBS (250 μL/brunn) 4x i 5 min vardera.</li>
	<li>Inkubera cellerna med lämpliga sekundära antikroppar och 4′,6-diamidino-2-fenylindol, dihydroklorid (DAPI; 1:1000) i PBSA (60 μl/brunn) i 2 timmar vid rumstemperatur.</li>
	<li>Tvätta cellerna med PBS (250 μL/brunn) 4x i 5 min vardera.</li>
	<li>Förvara cellerna i PBS innehållande 0,1% natriumazid (150 μl/brunn).</li>
</ol>7. Bildinsamling och analys
<ol><li>För att hämta bilderna, använd ett lämpligt mikroskop.</li>
	<li>För att identifiera cellkropparna i neuroner, använd både MAP2-positiva och DAPI-positiva regioner.</li>
	<li>För att identifiera dendriter av nervceller, använd MAP2-positiva signaler utan cellkroppar.</li>
	<li>För att identifiera drebrinkluster, använd drebrin-positiva signaler längs MAP2-positiva dendriter.</li>
</ol>

<ol>
	<li>Banker, G. A., Cowan, W. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rat+hippocampal+neurons+in+dispersed+cell+culture.">Rat hippocampal neurons in dispersed cell culture.</a> Brain Research. 126 (3), 397-342 (1977).</li><li>Kaech, S., Banker, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Culturing+hippocampal+neurons.">Culturing hippocampal neurons.</a> Nature Protocols. 1 (5), 2406-2415 (2006).</li><li>Roppongi, R. T., Champagne-Jorgensen, K. P., Siddiqui, T. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Low-density+primary+hippocampal+neuron+culture.">Low-density primary hippocampal neuron culture.</a> Journal of Visualized Experiments. (122), e55000 (2017).</li><li>Mizui, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Drebrin+E+is+involved+in+the+regulation+of+axonal+growth+through+actin-myosin+interactions.">Drebrin E is involved in the regulation of axonal growth through actin-myosin interactions.</a> Journal of Neurochemistry. 109 (2), 611-622 (2009).</li><li>Mizui, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Myosin+II+ATPase+activity+mediates+the+long-term+potentiation-induced+exodus+of+stable+F-actin+bound+by+drebrin+A+from+dendritic+spines.">Myosin II ATPase activity mediates the long-term potentiation-induced exodus of stable F-actin bound by drebrin A from dendritic spines.</a> PLoS One. 9 (1), 85367 (2014).</li><li>Takahashi, H., Mizui, T., Shirao, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Down-regulation+of+drebrin+A+expression+suppresses+synaptic+targeting+of+NMDA+receptors+in+developing+hippocampal+neurons.">Down-regulation of drebrin A expression suppresses synaptic targeting of NMDA receptors in developing hippocampal neurons.</a> Journal of Neurochemistry. 97, 110-115 (2006).</li><li>Takahashi, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Drebrin-dependent+actin+clustering+in+dendritic+filopodia+governs+synaptic+targeting+of+postsynaptic+density-95+and+dendritic+spine+morphogenesis.">Drebrin-dependent actin clustering in dendritic filopodia governs synaptic targeting of postsynaptic density-95 and dendritic spine morphogenesis.</a> The Journal of Neuroscience. 23 (16), 6586-6595 (2003).</li><li>Yamazaki, H., Sasagawa, Y., Yamamoto, H., Bito, H., Shirao, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CaMKIIbeta+is+localized+in+dendritic+spines+as+both+drebrin-dependent+and+drebrin-independent+pools.">CaMKIIbeta is localized in dendritic spines as both drebrin-dependent and drebrin-independent pools.</a> Journal of Neurochemistry. 146 (2), 145-159 (2018).</li><li>Hanamura, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-content+imaging+analysis+for+detecting+the+loss+of+drebrin+clusters+along+dendrites+in+cultured+hippocampal+neurons.">High-content imaging analysis for detecting the loss of drebrin clusters along dendrites in cultured hippocampal neurons.</a> Journal of Pharmacological and Toxicological Methods. 99, 106607 (2019).</li><li>Mitsuoka, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Assessment+of+NMDA+receptor+inhibition+of+phencyclidine+analogues+using+a+high-throughput+drebrin+immunocytochemical+assay.">Assessment of NMDA receptor inhibition of phencyclidine analogues using a high-throughput drebrin immunocytochemical assay.</a> Journal of Pharmacological and Toxicological Methods. 99, 106583 (2019).</li><li>Ishizuka, Y., Bramham, C. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+simple+DMSO-based+method+for+cryopreservation+of+primary+hippocampal+and+cortical+neurons.">A simple DMSO-based method for cryopreservation of primary hippocampal and cortical neurons.</a> Journal of Neuroscience Methods. 333, 108578 (2020).</li><li>Pischedda, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cryopreservation+of+primary+mouse+neurons:+The+benefit+of+neurostore+cryoprotective+medium.">Cryopreservation of primary mouse neurons: The benefit of neurostore cryoprotective medium.</a> Frontiers in Cellular Neuroscience. 12, 81 (2018).</li><li>Kobayashi, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Impairment+of+ciliary+dynamics+in+an+APP+knock-in+mouse+model+of+Alzheimer's+disease.">Impairment of ciliary dynamics in an APP knock-in mouse model of Alzheimer's disease.</a> Biochemical and Biophysical Research Communications. 610, 85-91 (2022).</li><li>Kobayashi, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Properties+of+primary+cilia+in+melanin-concentrating+hormone+receptor+1-bearing+hippocampal+neurons+in+vivo+and+in+vitro.">Properties of primary cilia in melanin-concentrating hormone receptor 1-bearing hippocampal neurons in vivo and in vitro.</a> Neurochemistry International. 142, 104902 (2021).</li><li>Koganezawa, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=NMDA+receptor-dependent+and+-independent+effects+of+natural+compounds+and+crude+drugs+on+synaptic+states+as+revealed+by+drebrin+imaging+analysis.">NMDA receptor-dependent and -independent effects of natural compounds and crude drugs on synaptic states as revealed by drebrin imaging analysis.</a> The European Journal of Neuroscience. 53 (11), 3548-3560 (2021).</li><li>Mizui, T., Takahashi, H., Sekino, Y., Shirao, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Overexpression+of+drebrin+A+in+immature+neurons+induces+the+accumulation+of+F-actin+and+PSD-95+into+dendritic+filopodia,+and+the+formation+of+large+abnormal+protrusions.">Overexpression of drebrin A in immature neurons induces the accumulation of F-actin and PSD-95 into dendritic filopodia, and the formation of large abnormal protrusions.</a> Molecular and Cellular Neurosciences. 30 (1), 149-157 (2005).</li><li>Sekino, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Activation+of+N-methyl-D-aspartate+receptor+induces+a+shift+of+drebrin+distribution:+disappearance+from+dendritic+spines+and+appearance+in+dendritic+shafts.">Activation of N-methyl-D-aspartate receptor induces a shift of drebrin distribution: disappearance from dendritic spines and appearance in dendritic shafts.</a> Molecular and Cellular Neurosciences. 31 (3), 493-504 (2006).</li><li>Takahashi, H., Yamazaki, H., Hanamura, K., Sekino, Y., Shirao, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Activity+of+the+AMPA+receptor+regulates+drebrin+stabilization+in+dendritic+spine+morphogenesis.">Activity of the AMPA receptor regulates drebrin stabilization in dendritic spine morphogenesis.</a> Journal of Cell Science. 122, 1211-1219 (2009).</li><li>Aoki, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Drebrin+A+is+a+postsynaptic+protein+that+localizes+in+vivo+to+the+submembranous+surface+of+dendritic+sites+forming+excitatory+synapses.">Drebrin A is a postsynaptic protein that localizes in vivo to the submembranous surface of dendritic sites forming excitatory synapses.</a> The Journal of Comparative Neurology. 483 (4), 383-402 (2005).</li><li>Koganezawa, N., Hanamura, K., Sekino, Y., Shirao, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+role+of+drebrin+in+dendritic+spines.">The role of drebrin in dendritic spines.</a> Molecular and Cellular Neurosciences. 84, 85-92 (2017).</li><li>Shirao, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+role+of+drebrin+in+neurons.">The role of drebrin in neurons.</a> Journal of Neurochemistry. 141 (6), 819-834 (2017).</li><li>Sekino, Y., Koganezawa, N., Mizui, T., Shirao, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Role+of+drebrin+in+synaptic+plasticity.">Role of drebrin in synaptic plasticity.</a> Advances in Experimental Medicine and Biology. 1006, 183-201 (2017).</li><li>Togo, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Postsynaptic+structure+formation+of+human+iPS+cell-derived+neurons+takes+longer+than+presynaptic+formation+during+neural+differentiation+in+vitro.">Postsynaptic structure formation of human iPS cell-derived neurons takes longer than presynaptic formation during neural differentiation in vitro.</a> Molecular Brain. 14 (1), 149 (2021).</li></ol>

Tomoaki Shirao är VD för AlzMed, Inc. Studien finansierades av AlzMed, Inc. (500 000 JPY till NK för projektet "High-throughput analysis of synaptic function").

Ett kritiskt steg i denna metod är att tina cellsuspensionen. Överföring av cellsuspensionen innan den blir för varm är mycket viktig. För att undvika snabb förändring av osmolalitet överför emellertid inte cellsuspensionen till en stor volym av mediet på en gång. Droppvis tillsats av odlingsmediet är också avgörande för att undvika plötsliga förändringar i osmotiskt tryck.
Neuronerna kan odlas i andra odlingskärl: 24-brunnsplattor, 8-brunnskammare, 60 mm skålar eller MED-sonder. I dessa fall måste dock den slutliga koncentrationen och tidpunkten för tillsatsen av Ara-C justeras. Dessutom måste neurons densitet optimeras i olika typer av experiment. Till exempel krävs högdensitetskultur för elektrofysiologiska experiment, och i så fall behövs medieutbytet två gånger i veckan (figur 6). Således kräver en lågdensitetskultur färre steg än en högdensitetskultur.
Neuronal kultur med låg densitet kräver ofta avancerade tekniker; Att använda fryst lager som är färdigt att använda löser dock detta problem. Den beskrivna metoden beror inte på en experimenters skicklighet. Kvaliteten på fryst lager är stabil och kan odlas stabilt så länge de lagras i flytande kväve och undviker temperaturförändringar i upp till 4 år.
Odling av cellerna i 3 veckor utan medelutbyte väcker frågan om det finns signifikanta osmolalitetsförändringar eller avdunstning av odlingsmedia. Vi har dock bekräftat att avdunstningen av odlingsmedier är liten (minskningsgrad på 3,6 %). Lokaliseringen av synaptiska proteiner och neurons morfologi verkar normal efter 3 veckor. Därför orsakar 3-veckors kultur utan medieutbyte inte stora osmolalitetsförändringar som påverkar förhållandena hos de odlade neuronerna. Att hålla plattan i en inkubator efter Ara-C-behandling är också en viktig punkt som minimerar avdunstningen.
Det finns ingen begränsning när det gäller användningen av frysta stamneuroner. Det finns emellertid vissa begränsningar av lågdensitetsodlingsmetoden. Vi bekräftade att lågdensitetskulturen kunde tillämpas för morfologisk observation av neuroner, utvärdering av synaptisk funktion och GFP-transfektion. Vi har dock inte undersökt levande cellavbildning. Dessutom, som nämnts ovan, krävs högdensitetskultur för att utföra elektrofysiologi.
Synapsmognad tar vanligtvis 3 veckor7, och vi kan inte bekräfta att de odlade neuronerna har ordentliga synapser förrän i slutet. Om synapsmognaden inte är bra efter 3 veckor skulle vi behöva odla igen. Genom att känna till neuronernas kvalitet innan vi börjar experimenten kan vi spara dessa 3 veckor. För att utföra experiment effektivt är det därför bäst att kontrollera neurons kvalitet i förväg. Frysta lager gör det möjligt att kontrollera neurons kvalitet i förväg. Varje parti frysta lager genereras från en kull råttor, och vi kan använda ett av bestånden från varje parti för en kvalitetskontroll. Drebrin är en bra markör för kvalitetskontrollen av neuronerna. Som beskrivits ackumuleras drebrin i ryggradshuvudet i mogna neuroner, och det reagerar på synaptisk stimulering. Således kan vi kontrollera kvaliteten på neuronerna i frysta bestånd genom att använda drebrin som markör.
Denna metod kan tillämpas för att utvärdera effekten av läkemedel på det synaptiska tillståndet. Drebrinutvandringen från dendritiska spines uppträder under de inledande stadierna av synaptisk plasticitet22. Därför visar detekteringen av drebrinklusterreduktion framkallad av läkemedelsbehandling att läkemedlet stimulerar synapsen och orsakar synaptisk plasticitet. För att identifiera om reduktionen är NMDAR-beroende är ett experiment med 2-amino-5-fosfonovalersyra (APV, en NMDAR-antagonist) användbar. Med drebrin som markör är även ett NMDAR-beroende klart bestämt10,15. Den beskrivna metoden är användbar vid läkemedelsscreening, säkerhetsfarmakologiska studier och utvärdering av synaptisk funktion.

Utvecklingen av ett in vitro experimentellt system som kan bedöma synaptiska funktioner som är involverade i inlärning och minne är viktigt. Neuronal kultur är ett värdefullt system för utvärdering av synaptiska funktioner in vitro. Den neuronala odlingstekniken användes först på 1980-talet, och på 1990-talet utvecklades lågdensitetskultur av primära hippocampus neuroner 1,2,3 för studier av enskilda neuroner när det gäller subcellulär lokalisering av proteinkomponenter, proteinhandel, neuronal polaritet, ryggradsmorfologi, synapsutveckling och plasticitet 4,5,6,7,8 . Det finns emellertid många steg involverade i denna teknik: parning av djur, dissekering av embryon, förberedelse av odlingskärl och odling av celler i 3 veckor med medieförändringar en gång i veckan. Dessutom kräver det avancerade tekniker3.
Vi har utvecklat frysta bestånd av dissocierade hippocampus neuroner från råttembryon 9,10. De frysta bestånden av neuroner är färdiga att använda, och inga avancerade tekniker krävs för att odla cellerna11,12. Med andra ord beror odling av neuronerna från frysta bestånd inte på en experimenters teknik. Det eliminerar behovet av djurförsök (t.ex. tillstånd för djurförsök, arrangering av tidsinställda dräktiga djur och dissekering av råttembryon), vilket minskar antalet djur som används. Nyligen har högkvalitativa, färdiga att använda frysta lager av neuroner blivit kommersiellt tillgängliga. Här använde vi kommersiellt tillgängliga frysta bestånd från embryonal dag (E) 18 råtta hippocampus13,14,15. Odling av neuroner från ett fryst bestånd kräver inte glia-konditionerade medier eller samodling med gliaceller. Vanliga primära odlingsmedier utan ytterligare serum kan användas för att odla cellerna; Därför kan vi skaffa reproducerbara data. Dessutom finns det inget behov av medieutbyte under 3 veckor efter cellsådden eftersom tillväxten av gliaceller minskar (figur 1).
Dendritiska spines är det postsynaptiska facket i de flesta excitatoriska synapser. De innehåller receptorproteiner, postsynaptiska ställningsproteiner och aktincytoskeletala proteiner. Vi fokuserade på ett aktinbindande protein drebrin 5,6,7,16,17,18. Drebrin ackumuleras vid ryggradshuvudet i mogna neuroner19, och vi rapporterade drebrin som en markör för det synaptiska tillståndet 15,17,20,21,22,23. Genom att genomföra en höginnehållsanalys med drebrin som avläsning har vi nyligen rapporterat de hämmande effekterna av fencyklidinanaloger på N-metyl-D-asparaginsyra-typ glutamatreceptorer (NMDAR)10 och de NMDAR-beroende effekterna av naturliga föreningar och råläkemedel på synaptiska tillstånd15.
Här beskriver vi hur man odlar frysta lager av neuroner vid låg densitet. Dessutom visar vi en drebrin imaging-baserad utvärdering av det synaptiska tillståndet med hjälp av 96-brunnsplattor.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>96 well plate</td>
			<td>Zeon Corporation</td>
			<td></td>
			<td>Gifted</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96 well plate</td>
			<td>greiner</td>
			<td>655986</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-drebrin antibody (M2F6)</td>
			<td>MBL</td>
			<td>D029-3</td>
			<td>Mouse monoclonal (dilution 1:1)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-MAP2 antibody</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>AB5622</td>
			<td>Rabbit&#160; (dilution 1:1000)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-mouse Alexa Fluor 568</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>A11031</td>
			<td>Dilution 1: 500</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-rabbit Alexa Fluor&#160;</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>A11008</td>
			<td>Dilution 1: 500</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>B-27</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>17504-044</td>
			<td>2 v/v% for MEA plates; 50x for normal plates</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Borax</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>B-9876</td>
			<td>Final concentration 12 mM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Boric acid</td>
			<td>WAKO</td>
			<td>021-02195</td>
			<td>Final concentration 50 mM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine serum albumin</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>12659-100G</td>
			<td>Final concentration: 3% in PBS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Confocal quantitative image cytometer 
			CellVoyager CQ1</td>
			<td>YOKOGAWA</td>
			<td></td>
			<td>Phase contrast images</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cytosine &#946;-D-arabino-furanoside (Ara-C)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>C-6645</td>
			<td>Diluted in dH2O (final concentration: 0.2 &#181;M)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DAPI</td>
			<td>FUJIFILM</td>
			<td>340-07971</td>
			<td>Dilution 1:1000</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GlutaMAX</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>35050-061</td>
			<td>&#160;2.5 mM for MEA plates; 400x for normal plates</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>In Cell Analyzer 2200</td>
			<td>Cytiva</td>
			<td></td>
			<td>Fluorescence images</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Laminin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>114956-81-9</td>
			<td>Final concentration: 20 &#181;g/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Maestro</td>
			<td>Axion Biosystems</td>
			<td></td>
			<td>MEA recordings</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MEA plate</td>
			<td>Axion Biosystems</td>
			<td>M768-tMEA-48W</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Neurobasal</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>21103-049</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde</td>
			<td>nacalai tesque</td>
			<td>26126-25</td>
			<td>Final concentration: 4% in PBS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin/Streptomycin</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15140-122</td>
			<td>&#160;100 U/mL for normal plates</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin/Streptomycin</td>
			<td>nacalai tesque</td>
			<td>26253-84</td>
			<td>100 &#181;g/mL for MEA plates</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>polyethyleimine</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>9002-98-6</td>
			<td>Final concentration: 0.1%</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Poly-L-lysine</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P2636</td>
			<td>Diluted in the borate buffer (final concentration: 1 mg/mL)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SKY Neuron</td>
			<td>AlzMed , Inc.</td>
			<td>ARH001</td>
			<td>1.0 x 106 cells/tube</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium azide</td>
			<td>FUJIFILM</td>
			<td>195-11092</td>
			<td>0.1%</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SodiumL(+)-Glutamate monohydrate</td>
			<td>WAKO</td>
			<td>194-02032</td>
			<td>Diluted in dH2O (final concentrations: 1 &#181;M, 3 &#181;M, 10 &#181;M, 30 &#181;M, 100 &#181;M)</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

easy and reproducible low-density primary culture using frozen stock of embryonic hippocampal neurons

Neuronal kultur är ett värdefullt system för utvärdering av synaptiska funktioner och läkemedelsscreeningar. I synnerhet möjliggör en lågdensitetskultur av primära hippocampus neuroner studier av enskilda neuroner eller subcellulära komponenter. Vi har visat subcellulär proteinlokalisering inom en neuron genom immunocytokemi, neuronal polaritet, synaptisk morfologi och dess utvecklingsförändring med hjälp av en primär hippocampuskultur med låg densitet. Nyligen har färdiga frysta lager av neuroner blivit kommersiellt tillgängliga. Dessa frysta lager av neuroner minskar den tid som behövs för att förbereda djurförsök och bidrar också till att minska antalet djur som används. Här introducerar vi en reproducerbar primärodlingsmetod med låg densitet med användning av en 96-brunnsplatta. Vi använde ett kommersiellt tillgängligt fryst lager av neuroner från råttembryonal hippocampus. Neuronerna kan odlas stabilt långsiktigt utan medieförändringar genom att minska tillväxten av gliaceller vid vissa tidpunkter. Denna analys med hög genomströmning med hjälp av lågdensitetskultur möjliggör reproducerbara bildbaserade utvärderingar av synaptisk plasticitet.

Efter protokollet odlades neuronerna i en 96-brunnsplatta i 21 dagar och behandlades sedan med glutamat (figur 1). Neuronerna utvecklades normalt utan utbyte av odlingsmediet i 3 veckor (figur 2). Vi behandlade cellerna med flera koncentrationer av glutamat (1 μM, 3 μM, 10 μM, 30 μM och 100 μM utspädd i steriliserat vatten) i 10 minuter och fixerade dem. Immunocytokemi utfördes och fluorescensbilder av drebrin och MAP2 förvärvades med hjälp av ett automatiserat fluorescensmikroskop med en sCMOS-kamera. Som visas i figur 3 observeras drebrinpositiva dendritiska ryggar tydligt längs MAP2-positiva dendriter. Det har visats att glutamatstimulering framkallar Ca2+ tillströmning genom NMDAR, vilket orsakar drebrinflykt från dendritiska ryggar vilket resulterar i en minskning av drebrin klusterdensiteter 5,17. Följaktligen observerade vi den dosberoende minskningen av drebrinklusterdensiteter mot glutamatstimulering10 (figur 4). Som visas i figur 5 är denna metod mycket reproducerbar om drebrin används som markör för synaptiska tillstånd.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64872/64872fig01.jpg"> Figur 1: Schema för metoden. Neuronerna odlades i en 96-brunnsplatta i 21 dagar och behandlades sedan med glutamat. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64872/64872fig01large.jpg" target="_blank">Klicka här för att se en större version av denna figur.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64872/64872fig02.jpg"> Figur 2: Ljusfältsbilder av odlade neuroner med hjälp av en 96-brunnsplatta. Faskontrastbilder erhölls från varje utvecklingsstadium (DIV 1, 7, 14, 21) med hjälp av en konfokal kvantitativ bildcytometer. Skalstapel: 50 μm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64872/64872fig02large.jpg" target="_blank">Klicka här för att se en större version av denna figur.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64872/64872fig03.jpg"> Figur 3: Representativa bilder av immunfärgade odlade nervceller. (vänster) Sammanslagna fluorescensbilder av drebrin (grön) och MAP2 (röd). Varje fluorescensbild av drebrin och MAP2 visades i mitten respektive höger paneler. Vita rektanglar visar området förstorat nedan. Skala staplar; Övre paneler: 50 μm, nedre paneler: 20 μm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64872/64872fig03large.jpg" target="_blank">Klicka här för att se en större version av denna figur.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64872/64872fig04.jpg"> Figur 4: Glutamatberoende dos-responsförändringar i normaliserad drebrinklusterdensitet. (A) Representativa fluorescensbilder immunfärgade med drebrin (grönt) och MAP2 (rött) från brunnen som behandlas med 0 μM, 10 μM och 100 μM glutamat (från vänster till höger). Skalstapel: 50 μm. (B) Drebrin klustertäthet normaliserades med medelvärdet av kontrollen (0 μM). 0 μM, N = 58 brunnar; 1 μM, N = 46; 3 μM, N = 54; 10 μM, N = 45; 30 μM, N = 54; 100 μM, N = 55, från 13 experiment med olika partier. ** P < 0,01 jämfört med kontroll (0 μM) genom Dunnetts multipla jämförelsetest efter ANOVA. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64872/64872fig04large.jpg" target="_blank">Klicka här för att se en större version av denna figur.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64872/64872fig05.jpg"> Figur 5: Glutamatberoende dos-responsförändringar i drebrinklusterdensitet. Rådata från sex experiment med olika partier. N = 4 brunnar för varje koncentration (0 μM, 3 μM, 10 μM, 30 μM och 100 μM). Värdena uttrycks som medelvärde ± SEM. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64872/64872fig05large.jpg" target="_blank">Klicka här för att se en större version av denna figur.</a>
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64872/64872fig06.jpg"> Figur 6: Användning av de frysta bestånden av neuroner på elektrofysiologiska experiment. (A) Ett protokoll för elektrofysiologiska experiment med mikroelektrodmatrisplattor (MEA). Beläggning: En dag före plätering av cellerna förbelades varje 48-brunns MEA-platta med en polyeteniminlösning (PEI: 0,1%) och inkuberades i 1 timme vid 37 °C. MEA-plattan tvättades sedan 3x med steriliserat vatten och torkades i 1 timme. Därefter hölls MEA-plattan vid 4 °C över natten. Högdensitetskultur: 50 000 celler / brunn av neuronerna pläterades på 48-brunns MEA-plattor. Cellsåddsteget utfördes enligt beskrivningen i avsnitt 2 i det ovan beskrivna protokollet. Laminin (20 μg / ml) tillsatt odlingsmedium (tillsätt 2 v / v% B-27, 2,5 mM Glutamax och 100 μg / ml penicillin / streptomycin till det neurobasala mediet) användes för att platta neuronerna. Därefter odlades neuronerna vid 37 °C, 5%CO2 i odlingsmediet. Media utbyttes helt på DIV 1 med odlingsmediet upp till DIV 3. Ara-C tillsattes vid DIV 4 (slutlig 0,2 μM). Från DIV 5 och framåt och 2 gånger i veckan ändrades 50% av medierna med kulturmediet. Neuronernas aktivitet på varje brunn på MEA-plattan registrerades med ett MEA-system. (B) Spontan neuronal aktivitet förvärvades vid 37 °C under en 5% CO2-atmosfär med hjälp av ett MEA-system med en samplingsfrekvens på 12,5 kHz / kanal vid DIV 21. Inspelningar från 4 kanaler av de 16 kanalerna i en brunn visas. För alla inspelningar applicerades ett Butterworth-bandpassfilter (200-3 000 Hz). Pilspetsar visar tidpunkten för synkroniserad burst-avfyrning. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64872/64872fig06large.jpg" target="_blank">Klicka här för att se en större version av denna figur.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Easy and Reproducible Low-Density Primary Culture using Frozen Stock of Embryonic Hippocampal Neurons at JoVE.com

Easy and Reproducible Low-Density Primary Culture using Frozen Stock of Embryonic Hippocampal Neurons

Ett färdigt att använda fryst lager av neuroner är ett kraftfullt verktyg för att utvärdera synaptiska funktioner. Här introducerar vi en primärkultur med enkel låg densitet från fryst lager med en 96-brunnsplatta.

Enkel och reproducerbar primärkultur med låg densitet med fryst stam av embryonala hippocampus neuroner

Neuronal culture is a valuable system for evaluating synaptic functions and drug screenings. In particular, a low-density culture of primary hippocampal ...

De frysta bestånden av embryonala nervceller från råtta är redo att användas, och inga avancerade tekniker krävs för att odla cellerna. Denna teknik är väldigt enkel och du behöver inget tillstånd för djurförsök, arrangera tidsinställda gravida djur eller dissekera embryon. Neuronerna kan odlas i andra odlingskärl och tillämpas för andra typer av experiment.Till exempel mikroelektrodmatrisplattor för elektrofysiologiska experiment. Börja med att belägga en 96-brunns mikroplatta med 100 mikroliter poly-L-lysin per brunn. Inkubera sedan plattorna över natten vid 37 grader Celsius.Vid slutet av inkubationen, avlägsna poly-L-lysinlösningen. Tvätta plattorna två gånger med steriliserat vatten och en gång med tilläggsfritt, färskt odlingsmedium. Placera plattorna för att torka.Torra plattor kan förpackas och förvaras i upp till en månad vid fyra grader Celsius. För att starta cellsådd, tillsätt 50 mikroliter av odlingsmediet till varje brunn i de belagda plattorna. Fyll de perifera brunnarna med 200 mikroliter steriliserat vatten och inkubera plattan i en timme vid 37 grader Celsius med 5% koldioxid.Ta bort neuronkryoflaskan från tanken med flytande kväve och placera den i ett 37 grader Celsius värmeblock för att delvis tina innehållet. Använd en en-milliliter pipett med en bred borrspets, överför långsamt innehållet i injektionsflaskorna droppvis till ett sterilt 50-milliliter rör. Skölj den tomma kryoflaskan med en milliliter odlingsmedium i rumstemperatur.Överför sköljlösningen till 50-milliliterröret som innehåller cellsuspensionen. Tillsätt sedan nio milliliter av rumstemperaturodlingsmediet droppvis i 50-milliliterröret, vilket gör volymen till 11 ml. Efter att ha räknat cellerna med hjälp av en hemocytometer, överför cellsuspensionen till en behållare.Nu, med hjälp av en flerkanalig pipett med breda borrspetsar, dispensera cellsuspensionen med ett slutligt antal på 1,0 gånger 10 till de fyra cellerna per brunn i den belagda 96-brunnsplattan. Inkubera neuronerna i en till två timmar vid 37 grader Celsius under 5% koldioxid. Byt sedan ut odlingsmediet med 100 mikroliter förvärmt odlingsmedium och inkubera igen vid samma betingelser.Efter fyra dagar in vitro, tillsätt cytosin beta-D-arabinofuranosid vid den slutliga koncentrationen av 0,2 mikromolar per brunn för att minska tillväxten av gliaceller. Sätt tillbaka plattan i inkubatorn. Efter 21 dagar in vitro, behandla cellerna med läkemedlen av intresse.För att upprätthålla en positiv kontroll, behandla celler med 100 mikromolar glutamat per brunn i 10 minuter vid 37 grader Celsius före fixering. Innan du utför immunocytokemiska studier, fixera cellerna i 20 minuter genom att ersätta odlingslösningen med 100 mikroliter paraformaldehyd i varje brunn. Efter fixering, tvätta brunnarna två gånger med 250 mikroliter fosfatbuffrad saltlösning per brunn i fem minuter vardera.I den aktuella studien utvecklades neuronerna normalt utan att byta odlingsmedium i tre veckor. Immunhistokemi avslöjade drebrin-positiva dendritiska ryggar längs MAP2-positiva dendriter. Den dosberoende minskningen av drebrinklusterdensiteter mot glutamatstimulering observerades.Transplantationen av cellsuspensionen innan den blir för varm är mycket viktig. Den droppvisa tillsatsen av odlingsmedium är också avgörande för att undvika plötslig förändring av osmolariteten.

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Dissection and Culture of Commissural Neurons from Embryonic Spinal Cord

Dissektion och kultur commissural neuroner från embryonala ryggmärg

Commissural neurons have been widely used to investigate the mechanisms underlying axon guidance during embryonic spinal cord development. The cell bodies ...

Nucleofection and Primary Culture of Embryonic Mouse Hippocampal and Cortical Neurons

Nucleofection och Primary kultur av embryonala Mouse hippocampus och kortikala Neuroner

Hippocampal and cortical neurons have been used extensively to study central nervous system (CNS) neuronal polarization, axon/dendrite outgrowth, and ...

Bilaminar Co-culture of Primary Rat Cortical Neurons and Glia

Bilaminar Co-kultur Primär Rat kortikala neuron och Glia

This video will guide you through the process of culturing rat cortical neurons in the presence of a glial feeder layer, a system known as a bilaminar or ...

Isolation and Culture of Hippocampal Neurons from Prenatal Mice

Isolering och kultur hippocampusneuroner från Prenatal möss

Primary cultures of rat and murine hippocampal neurons are widely used to reveal cellular mechanisms in neurobiology. By isolating and growing individual ...

Assaying DNA Damage in Hippocampal Neurons Using the Comet Assay

Analys DNA-skador i hippocampus neuroner Använda Comet Assay

A number of drugs target the DNA repair pathways and induce cell kill by creating DNA damage. Thus, processes to directly measure DNA damage have been ...

Preparation of Primary Neurons for Visualizing Neurites in a Frozen-hydrated State Using Cryo-Electron Tomography

Beredning av primär nervceller för Visualisering neuriter i en Frozen-hydrerad stat Använda Cryo-elektrontomografi

Neurites, both dendrites and axons, are neuronal cellular processes that enable the conduction of electrical impulses between neurons. Defining the ...

Calcium Phosphate Transfection of Primary Hippocampal Neurons

Kalciumfosfattransfektion av primär hippocampus nervceller

Calcium phosphate precipitation is a convenient and economical method for transfection of cultured cells. With optimization, it is possible to use this ...

Imaging Dendritic Spines of Rat Primary Hippocampal Neurons using Structured Illumination Microscopy

Imaging Dendritutskotten av Rat Primär hippocampus nervceller med hjälp av strukturerade Illumination Mikroskopi

Dendritic spines are protrusions emerging from the dendrite of a neuron and represent the primary postsynaptic targets of excitatory inputs in the brain. ...

Primary Culture of Mouse Dopaminergic Neurons

Primär kultur av mus dopaminerga neuroner

Dopaminergic neurons represent less than 1% of the total number of neurons in the brain. This low amount of neurons regulates important brain functions ...

Isolation, Culture and Long-Term Maintenance of Primary Mesencephalic Dopaminergic Neurons From Embryonic Rodent Brains

Isolering, kultur och långsiktigt underhåll av primär mesencefala dopaminerga neuron från embryonala Gnagare Brains

Degeneration of mesencephalic dopaminergic (mesDA) neurons is the pathological hallmark of Parkinson&#8217;s diseae. Study of the biological processes ...