Name: a simple protocol for mapping the plant root system architecture traits
Uploaded: 2023-02-10T13:10:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about A Simple Protocol for Mapping the Plant Root System Architecture Traits at JoVE.com

We erkennen het Amerikaanse ministerie van Landbouw (Grant 58-6406-1-017) voor het ondersteunen van dit onderzoek. We erkennen ook het WKU Biotechnology Centre, Western Kentucky University, Bowling Green, KY, VS, en de directeur, CSIR Central Institute of Medicinal and Aromatic Plants, Lucknow, India, voor het leveren van de instrumentfaciliteiten en ondersteuning (CSIR CIMAP manuscript communicatie nr. CIMAP / PUB / 2022/103). SS erkent de financiële steun van Saint Joseph's University, Philadelphia, VS.

Het hele protocol is schematisch samengevat in figuur 1, met alle essentiële stappen die betrokken zijn bij het onthullen van de wortelsysteemarchitectuur (RSA) van plantjes. Protocolstappen worden hieronder in detail gegeven:
1. Arabidopsis zaadoppervlak sterilisatie
<ol><li>Breng een klein schepje (ongeveer 100 zaden = ongeveer 2,5 mg) zaden over in een microfugebuis en week gedurende 30 minuten in gedestilleerd water op kamertemperatuur (RT)...

<ol>
	<li>Shukla, D., Rinehart, C. A., Sahi, S. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comprehensive+study+of+excess+phosphate+response+reveals+ethylene+mediated+signaling+that+negatively+regulates+plant+growth+and+development.">Comprehensive study of excess phosphate response reveals ethylene mediated signaling that negatively regulates plant growth and development.</a> Scientific Reports. 7 (1), 3074 (2017).</li><li>Rell&#225;n-&#193;lvarez, R., Lobet, G., Dinneny, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Environmental+control+of+root+system+biology.">Environmental control of root system biology.</a> Annual Review of Plant Biology. 67, 619-642 (2016).</li><li>Gruber, B. D., Giehl, R. F. H., Friedel, S., von Wir&#233;n, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Plasticity+of+the+Arabidopsis+root+system+under+nutrient+deficiencies.">Plasticity of the Arabidopsis root system under nutrient deficiencies.</a> Plant Physiology. 163 (1), 161-179 (2013).</li><li>Shukla, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome-wide+expression+analysis+reveals+contrasting+regulation+of+phosphate+starvation+response+(PSR)+in+root+and+shoot+of+Arabidopsis+and+its+association+with+biotic+stress.">Genome-wide expression analysis reveals contrasting regulation of phosphate starvation response (PSR) in root and shoot of Arabidopsis and its association with biotic stress.</a> Environmental and Experimental Botany. , 188 (2021).</li><li>Robbins 2nd, ., E, N., Dinneny, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Growth+is+required+for+perception+of+water+availability+to+pattern+root+branches+in+plants.">Growth is required for perception of water availability to pattern root branches in plants.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 115 (4), E822-E831 (2018).</li><li>Linkohr, B. I., Williamson, L. C., Fitter, A. H., Leyser, H. M. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nitrate+and+phosphate+availability+and+distribution+have+different+effects+on+root+system+architecture+of+Arabidopsis.">Nitrate and phosphate availability and distribution have different effects on root system architecture of Arabidopsis.</a> The Plant Journal. 29 (6), 751-760 (2002).</li><li>Lynch, J. P., Brown, K. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Topsoil+foraging:+an+architectural+adaptation+of+plants+to+low+phosphorus+availability.">Topsoil foraging: an architectural adaptation of plants to low phosphorus availability.</a> Plant and Soil. 237 (2), 225-237 (2001).</li><li>L&#243;pez-Bucio, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phosphate+availability+alters+architecture+and+causes+changes+in+hormone+sensitivity+in+the+Arabidopsis+root+system.">Phosphate availability alters architecture and causes changes in hormone sensitivity in the Arabidopsis root system.</a> Plant Physiology. 129 (1), 244-256 (2002).</li><li>Jain, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differential+effects+of+sucrose+and+auxin+on+localized+phosphate+deficiency-induced+modulation+of+different+traits+of+root+system+architecture+in+Arabidopsis.">Differential effects of sucrose and auxin on localized phosphate deficiency-induced modulation of different traits of root system architecture in Arabidopsis.</a> Plant Physiology. 144 (1), 232-247 (2007).</li><li>Jain, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Variations+in+the+composition+of+gelling+agents+affect+morphophysiological+and+molecular+responses+to+deficiencies+of+phosphate+and+other+nutrients.">Variations in the composition of gelling agents affect morphophysiological and molecular responses to deficiencies of phosphate and other nutrients.</a> Plant Physiology. 150 (2), 1033-1049 (2009).</li><li>Jain, A., Sinilal, B., Dhandapani, G., Meagher, R. B., Sahi, S. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+deficiency+and+excess+of+zinc+on+morphophysiological+traits+and+spatiotemporal+regulation+of+zinc-responsive+genes+reveal+incidence+of+cross+talk+between+micro-+and+macronutrients.">Effects of deficiency and excess of zinc on morphophysiological traits and spatiotemporal regulation of zinc-responsive genes reveal incidence of cross talk between micro- and macronutrients.</a> Environmental Science and Technology. 47 (10), 5327-5335 (2013).</li><li>Jain, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Role+of+Fe-responsive+genes+in+bioreduction+and+transport+of+ionic+gold+to+roots+of+Arabidopsis+thaliana+during+synthesis+of+gold+nanoparticles.">Role of Fe-responsive genes in bioreduction and transport of ionic gold to roots of Arabidopsis thaliana during synthesis of gold nanoparticles.</a> Plant Physiology and Biochemistry. 84, 189-196 (2014).</li><li>Williamson, L. C., Ribrioux, S. P., Fitter, A. H., Leyser, H. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phosphate+availability+regulates+root+system+architecture+in+Arabidopsis.">Phosphate availability regulates root system architecture in Arabidopsis.</a> Plant Physiology. 126 (2), 875-882 (2001).</li><li>Yang, T. J. W., Lin, W. D., Schmidt, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transcriptional+profiling+of+the+Arabidopsis+iron+deficiency+response+reveals+conserved+transition+metal+homeostasis+networks.">Transcriptional profiling of the Arabidopsis iron deficiency response reveals conserved transition metal homeostasis networks.</a> Plant Physiology. 152 (4), 2130 (2010).</li><li>Kobae, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Zinc+transporter+of+Arabidopsis+thaliana+AtMTP1+is+localized+to+vacuolar+membranes+and+implicated+in+zinc+homeostasis.">Zinc transporter of Arabidopsis thaliana AtMTP1 is localized to vacuolar membranes and implicated in zinc homeostasis.</a> Plant Cell and Physiology. 45 (12), (2004).</li><li>Al-Ghazi, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Temporal+responses+of+Arabidopsis+root+architecture+to+phosphate+starvation:+evidence+for+the+involvement+of+auxin+signalling.">Temporal responses of Arabidopsis root architecture to phosphate starvation: evidence for the involvement of auxin signalling.</a> Plant, Cell and Environment. 26 (7), 1053-1066 (2003).</li><li>S, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> National Institutes of Health. , 1997-2007 (1997).</li><li>Dubrovsky, J. G., Forde, B. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+analysis+of+lateral+root+development:+pitfalls+and+how+to+avoid+them.">Quantitative analysis of lateral root development: pitfalls and how to avoid them.</a> The Plant Cell. 24 (1), 4-14 (2012).</li><li>Weeks, J. T., Ye, J., Rommens, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+an+in+planta+method+for+transformation+of+Alfalfa+(Medicago+sativa).">Development of an in planta method for transformation of Alfalfa (Medicago sativa).</a> Transgenic Research. 17 (4), 587-597 (2008).</li><li>Shukla, D., Krishnamurthy, S., Sahi, S. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microarray+analysis+of+Arabidopsis+under+gold+exposure+to+identify+putative+genes+involved+in+the+synthesis+of+gold+nanoparticles+(AuNPs).Genomics+Data.">Microarray analysis of Arabidopsis under gold exposure to identify putative genes involved in the synthesis of gold nanoparticles (AuNPs).Genomics Data.</a> 3, 100-102 (2015).</li></ol>

Dit werk demonstreerde het in kaart brengen van RSA met behulp van eenvoudige laboratoriumapparatuur. Met behulp van deze methode worden fenotypische veranderingen op het verfijnde niveau geregistreerd. Het voordeel van deze strategie is dat het scheutgedeelte nooit in contact komt met de media, dus het fenotype van de plantjes is origineel. Deze methode omvat het opzetten van een hydroponisch systeem om planten te laten groeien zoals beschreven in het protocol. Vervolgens wordt elk plantje er intact uitgehaald en op een...

De wortelsysteemarchitectuur (RSA), die ondergronds is, is een vitaal orgaan voor plantengroei en productiviteit 1,2,3. Na het embryonale stadium ondergaan planten hun belangrijkste morfologische veranderingen. De manier waarop de wortels in de grond groeien, heeft grote invloed op de groei van plantendelen boven de grond. Wortelgroei is de eerste stap in ontkieming. Het is een informatieve eigenschap omdat het op unieke wijze reageert op verschillende beschikbare voedingsstoffen 1,2,3,4. De RSA vertoont een hoge mate van ontwikkelingsplasticiteit, wat betekent dat de omgeving altijd wordt gebruikt om beslissingen te nemen over ontwikkeling 2,5. Veranderingen in de omgeving hebben de productie van gewassen in het huidige scenario bemoeilijkt. Op continue basis neemt de RSA omgevingssignalen mee in ontwikkelingskeuzes5. Als gevolg hiervan is een grondig begrip van de principes achter wortelontwikkeling essentieel om te leren hoe planten reageren op veranderende omgevingen 2,5.
De RSA detecteert variërende nutriëntenconcentraties en geeft fenotypische veranderingen 4,6,7,8,9,10,11,12. Studies suggereren dat wortelmorfologie /RSA zeer plastisch is in vergelijking met scheutmorfologie 1,3. RSA trait mapping is zeer effectief in het vastleggen van het effect van het veranderen van de omringende bodemomgeving 1,11,12.
Over het algemeen zijn discrepanties in het effect van verschillende tekorten aan voedingsstoffen op het wortelfenotype gemeld in veel eerdere studies 3,11,13,14,15. Er zijn bijvoorbeeld verschillende contrasterende rapporten over fosfaat (Pi) door uithongering veroorzaakte veranderingen in het aantal, de lengte en de dichtheid van laterale wortels (LRs). Een toename van de LR-dichtheid is gemeld onder de Pi-deficiënte toestand 6,8. Daarentegen is een afname van de LR-dichtheid onder Pi-deficiënte omstandigheden ook gemeld door andere auteurs 3,13,16. Een van de prominente oorzaken van deze inconsistenties is het gebruik van het elementaire contaminatiegevoelige geleermedium, dat agar vaak10 bevat. Onderzoekers kweken hun experimentele planten meestal op een op agar gebaseerd plaatsysteem en registreren de wortelkenmerken. Talrijke RSA-eigenschappen zijn vaak verborgen of verankerd in het agarmateriaal en kunnen niet worden gedocumenteerd. Experimenten die verband houden met het induceren van tekort aan voedingsstoffen, waarbij gebruikers vaak één component volledig uitsluiten van het medium, kunnen niet worden uitgevoerd in elementair contaminatiegevoelig geleermedium11,14,15. Talrijke voedingsstoffen zijn vaak aanwezig in aanzienlijke hoeveelheden in de agar media, waaronder P, Zn, Fe, en nog veel meer11,14,15. Bovendien is de RSA-groei langzamer in op agar gebaseerde media dan in vloeibaar medium dat niet op agar is gebaseerd. Als gevolg hiervan is er behoefte aan een alternatieve, niet-agar-gebaseerde benadering voor het kwantificeren en kwalitatief registreren van het fenotype van RSA. Daarom is de huidige methode ontwikkeld, waarbij plantlets worden grootgebracht in een magenta box-gebaseerd hydroponisch systeem bovenop een polypropyleen gaas ondersteund door polycarbonaat wiggen 1,10,11.
Deze studie presenteert een gedetailleerde geïmproviseerde versie van de eerdere methode beschreven door Jain et al.10. Deze strategie is afgestemd op de huidige eisen in de biologie van plantenwortels en kan ook worden gebruikt voor planten zoals Alfalfa, anders dan modelplanten. Het protocol is de primaire manier om de veranderingen in RSA te meten en vereist alleen eenvoudige apparatuur. Het huidige protocol illustreert hoe verschillende wortelkenmerken kunnen worden fenotypeerd, zoals primaire en laterale wortels in normaal en gemodificeerd medium (Pi-deficiënt). Stapsgewijze aanwijzingen en andere nuttige tips uit de ervaringen van de auteur worden gegeven om de onderzoekers te helpen de methodologieën te volgen die in deze methode worden aangeboden. De huidige studie heeft tot doel een eenvoudige en effectieve methode te bieden voor het onthullen van het hele wortelstelsel van planten, inclusief LRs van hogere orde. Deze methode omvat het handmatig verspreiden van het wortelstelsel met een ronde aquarel art penseel, waardoor nauwkeurige controle over de blootstelling vande wortels 1,10,11,12. Het vereist geen dure apparatuur of ingewikkelde software. Deze methode heeft de opname en groeisnelheid van voedingsstoffen verbeterd; Planten hebben een voedingsrijke oplossing die gemakkelijk door hun wortels wordt opgenomen. De huidige methode is geschikt voor onderzoekers die de eigenschappen van het wortelstelsel van een plant in detail in kaart willen brengen, met name tijdens de vroege ontwikkeling (10-15 dagen na ontkieming). Het is geschikt voor kleine wortelstelsels, modelplanten zoals Arabidopsis en tabak, en niet-conventionele planten zoals Alfalfa totdat hun wortelstelsel in de magenta-dozen past.
De stappen voor fenotypische analyse van RSA-ontwikkeling in Arabidopsis worden in dit protocol als volgt beschreven: (1) de methode van sterilisatie van het zaadoppervlak voor planten (Arabidopsis), (2) de stappen om het hydroponische systeem op te zetten, gevolgd door zaadzaaien op een medium, (3) procedure voor het verwijderen van de volledige zaailingen en het verspreiden op de petriplaat voor RSA-analyse, (4) hoe de beelden voor RSA op te nemen en (5) belangrijke RSA-parameters te berekenen met behulp van ImageJ-software.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Arabidospsis thaliana (Col 0)</td>
			<td>Lehle Seeds</td>
			<td>WT-02</td>
			<td>Columbia (Col-0**, no markers)*</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Art brushes</td>
			<td>Amazon or any other vendor</td>
			<td></td>
			<td>Water color round brush size no. 14 (8 mm), 16 (9.5 mm), 18 (12 mm), and 20 (14.2 mm)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Automated Microscope with digital camera</td>
			<td>Leica Microsystems</td>
			<td></td>
			<td>LAS version 4.12.0, Leica Microsystems</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Imaging Software</td>
			<td>ImageJ</td>
			<td></td>
			<td>ImageJ V 
			&#160;1.8.0</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magenta box GA-7</td>
			<td>Fisher Scientific&#160;</td>
			<td>50-255-176</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Medicago sativa</td>
			<td>Johnny&#39;s Seeds</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri-plate (150 mm x 15 mm)</td>
			<td>USA Scientific</td>
			<td>8609-0215</td>
			<td>150 mm x 15 mm PS Petri Dish (https://www.usascientific.com)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Photo camera</td>
			<td>Cannon or Nikon</td>
			<td></td>
			<td>Any high mega pixel (atleast 12 mega pixel per inch) camera on macro mode</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plant-Agar</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A3301</td>
			<td>Agargel&#160; Suitable for plant tissue culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polycarbonate Sheets</td>
			<td>Amazon</td>
			<td></td>
			<td>1 mm&#160; thick</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polypropylene Mesh</td>
			<td>Amazon</td>
			<td></td>
			<td>Pore size 250 &#181;m, 500 &#181;m and 1000 &#181;m</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scanner</td>
			<td>Epson</td>
			<td></td>
			<td>Epson Perfection V700 Photo (Scan at 600 dpi)</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a simple protocol for mapping the plant root system architecture traits

Uitgebreide kennis van de ontwikkeling van de plant root system architecture (RSA) is van cruciaal belang voor het verbeteren van de efficiëntie van het gebruik van voedingsstoffen en het verhogen van de tolerantie van gewascultivar voor milieu-uitdagingen. Een experimenteel protocol wordt gepresenteerd voor het opzetten van het hydrocultuursysteem, plantjesgroei, RSA-verspreiding en beeldvorming. De aanpak maakte gebruik van een magenta box-gebaseerd hydroponisch systeem met polypropyleen gaas ondersteund door polycarbonaat wiggen. Experimentele omgevingen worden geïllustreerd door de RSA van de plantjes te beoordelen onder variërende voedingsstof (fosfaat [Pi]) toevoer. Het systeem is opgezet om de RSA van Arabidopsis te onderzoeken, maar het is gemakkelijk aan te passen om andere planten zoals Medicago sativa (Alfalfa) te bestuderen. Arabidopsis thaliana (Col-0) plantjes worden in dit onderzoek gebruikt als voorbeeld om de plant RSA te begrijpen. Zaden worden aan het oppervlak gesteriliseerd door ethanol en verdund commercieel bleekmiddel te behandelen en op 4 °C te houden voor stratificatie. De zaden worden ontkiemd en gekweekt op een vloeibaar half-MS medium op een polypropyleen gaas ondersteund door polycarbonaat wiggen. De plantjes worden gekweekt onder standaard groeiomstandigheden voor het gewenste aantal dagen, voorzichtig uit het gaas geplukt en ondergedompeld in waterhoudende agarplaten. Elk wortelstelsel van de plantjes wordt zachtjes op de met water gevulde plaat verspreid met behulp van een ronde kunstkwast. Deze petriplaten worden gefotografeerd of gescand met hoge resolutie om de RSA-eigenschappen te documenteren. De wortelkenmerken, zoals primaire wortel, laterale wortels en vertakkingszone, worden gemeten met behulp van de vrij beschikbare ImageJ-software. Deze studie biedt technieken voor het meten van plantwortelkenmerken in gecontroleerde omgevingsomgevingen. We bespreken hoe we (1) de plantjes kunnen laten groeien en wortelmonsters kunnen verzamelen en verspreiden, (2) foto's van verspreide RSA-monsters kunnen verkrijgen, (3) de afbeeldingen kunnen vastleggen en (4) beeldanalysesoftware kunnen gebruiken om wortelkenmerken te kwantificeren. Het voordeel van de huidige methode is de veelzijdige, eenvoudige en efficiënte meting van de RSA-eigenschappen.

De verschillende morfometrische eigenschappen van wortelsysteemarchitectuur (RSA) worden gemeten met behulp van eenvoudige laboratoriumhulpmiddelen en de stappen zijn schematisch weergegeven in figuur 1. De details van de hydroponische opstelling tonen het potentieel van het protocol bij het meten van de RSA (figuur 1 en figuur 2).
Gezien de waargenomen verschillen in geleermiddelen, gebruikten we een hyd...

Watch this Scientific Journal Video about A Simple Protocol for Mapping the Plant Root System Architecture Traits at JoVE.com

A Simple Protocol for Mapping the Plant Root System Architecture Traits

We gebruiken eenvoudige laboratoriumtools om de wortelsysteemarchitectuur (RSA) van Arabidopsis en Medicago te onderzoeken. De plantjes worden hydroponisch over gaas gekweekt en verspreid met behulp van een kunstkwast om de RSA te onthullen. Foto's worden gemaakt met behulp van scannen of een camera met hoge resolutie en vervolgens geanalyseerd met ImageJ om eigenschappen in kaart te brengen.

Een eenvoudig protocol voor het in kaart brengen van de eigenschappen van de plantwortelsysteemarchitectuur

Comprehensive knowledge of plant root system architecture (RSA) development is critical for improving nutrient use efficiency and increasing crop cultivar ...

Dit is een niet-invasieve hydroponische methode om de architectuur van het wortelsysteem te meten met behulp van routinematige laboratoriumapparatuur. Dit protocol maakt de volledige visualisatie van het gehele wortelstelsel van de plant mogelijk door het handmatig te verspreiden. Een van de belangrijkste voordelen van de RSA-analyse is dat het mogelijk is om het wortelstelsel van planten te bestuderen zonder dat dit ongewenste elementaire besmetting kan veroorzaken.Deze methode kan de directe omgevingsinteractie registreren, inclusief hormonale, voedings- en klimatologische omstandigheden met de RSA van plantensystemen. Begin met de oppervlaktesterilisatie van Arabidopsis-zaden door een klein schepje van ongeveer 100 zaden in gedestilleerd water bij kamertemperatuur te weken. Centrifugeer na 30 minuten de zaden kort op 500 G gedurende vijf seconden met behulp van een tafelcentrifuge.Decanteer vervolgens het water en voeg 700 microliter 70% ethanol toe voordat je de buis een paar seconden vortext. Centrifugeer de zaden opnieuw. Herhaal indien nodig vortexing en centrifugatie, waarbij u ervoor zorgt dat de behandeling met 70% ethanol niet langer duurt dan drie minuten.Spoel de zaden na drie minuten onmiddellijk af met steriel water. Behandel vervolgens de zaden met verdund commercieel bleekmiddel met een druppel TWEEN 20 gedurende zeven minuten. Meng de zaden met bleekoplossing door de buisjes acht tot 12 keer snel om te keren.Na een korte centrifugatie decanteer je het supernatant met een pipet van één milliliter en spoel je de zaden minstens vijf keer af met steriel water, volgens dezelfde vortexingprocedure. Laat de oppervlakte gesteriliseerde zaden in water en incubeer ze gedurende twee tot drie dagen bij vier graden Celsius voor stratificatie. Autoclaaf de standaard magenta doos half gevuld met gedestilleerd water.Snijd de geautoclaveerde polycarbonaatplaat in rechthoeken van vier bij acht centimeter met een middelpunt dat meer dan halverwege de rechthoek is ingekerfd, zodat twee rechthoeken samen kunnen glijden om een X-vorm te vormen. Gebruik deze opstelling om het polypropyleengaas van 250 micrometer poriegrootte vast te houden dat in vierkanten van zes bij zes centimeter is gesneden. Voeg in de laminaire luchtstroomkast steriele halve MS-basale media met vitamines plus 1,5% sucrose toe aan elke doos om de onderkant van het polypropyleengaas te bereiken.Zaai de oppervlakte gesteriliseerde zaden hydroponisch op het gaas en laat ze drie dagen groeien. Breng de zaailingen na drie dagen over op een poriegroot gaas van 500 micrometer en laat ze twee dagen groeien. Breng vervolgens de zaailingen over op de controlemedia en op de experimentele media en laat de zaden zeven dagen groeien.Voeg 10 tot 20 milliliter gefilterd kraanwater in autoclaaf toe aan de petriplaat. Trek de zaailingen voorzichtig uit het gaas van 500 micrometer. Verspreid met behulp van een ronde kunstkwast plantachtige wortels in de met water gevulde plaat en dompel ze onder in water.Kantel de plaat iets om het water te verwijderen. Scan of fotografeer deze petriplaten op de juiste manier. Meet de architectuur van het rootsysteem, of RSA-kenmerken, met behulp van vrij beschikbare ImageJ-software en open vervolgens het bestand dat moet worden geanalyseerd.Nadat u de schaal hebt ingesteld, gebruikt u het gereedschap Rechte lijn om een lijnselectie te maken die de schaalbalk omlijnt. Voltooi het schetsen door met de rechtermuisknop te klikken, te dubbelklikken of te klikken in het vak aan het begin. Om de lengte van de bekende schaalbalk in pixels te meten, klikt u op analyseren, gevolgd door meten op de werkbalk.Noteer de pixellengte. Open het dialoogvenster Schaal instellen door op het tabblad Schaal instellen op het tabblad Analyseren te klikken. Controleer de pixellengte in de verte in het veld pixels.Voer vervolgens de waarde van de schaalbalk in het bekende afstandsveld in en stel de lengte-eenheid in op millimeters. Vergrendel de schaal voor deze specifieke afbeelding door op OK te klikken. Gebruik het gereedschap Gesegmenteerde lijn voor een lijnselectie die de wortellengte omlijnt.Nadat u de omtrek hebt voltooid, past u de lijnselectie aan door op de kleine zwart-witte handgrepen te klikken en deze langs de omtrek te slepen. Selecteer op het tabblad analyseren van ImageJ de opdracht meten en kwantificeer de wortellengte. Breng de gemeten gegevens over naar een spreadsheet door met de rechtermuisknop op het resultatenvenster te klikken, Alles kopiëren te selecteren in het pop-upmenu, over te schakelen naar de spreadsheet en de gegevens te plakken.Meet voor het meten en berekenen van RSA-kenmerken de primaire wortellengte tussen de hypocotylverbinding en het uiteinde van de wortelpunten. Meet vervolgens de eerste orde laterale wortels, of één graad LR-lengte, en tweede orde laterale wortels, of twee graden LR-lengte. Als u klaar bent, kopieert en plakt u alle metingen in de spreadsheet.Meet en registreer de vertakkingszone van de primaire wortel, of BZPR, die het eerste opkomende punt van de laterale wortel overspant tot het laatste opkomende punt van de laterale wortel. Noteer ook het aantal zijwortels afkomstig binnen de grens van de BZPR. Meet vervolgens de gemiddelde lengte van de eerste en hogere orde laterale wortels.Leid de gemiddelde lengte van de primaire laterale wortels af door de totale lengte van de primaire laterale wortels te delen door het totale aantal primaire laterale wortels. Om vervolgens de gemiddelde lengte van de tweede orde laterale wortels te meten, berekent u de gemiddelde lengte van de secundaire laterale wortels door de totale lengte van de secundaire laterale wortels te delen door het totale aantal secundaire laterale wortels. Meet de primaire laterale worteldichtheid door het aantal primaire laterale wortels te delen door de lengte van de BZPR.Meet vervolgens de vertakkingszone van individuele laterale wortels en bereken de secundaire laterale worteldichtheid door het aantal secundaire laterale wortels te delen door de lengte van de vertakkingszones van tweede orde laterale wortellengtes. Als u klaar bent, meet u de totale wortellengte of TRL. Dit is het totaal van primaire wortels en primaire en secundaire laterale wortellengtes.Het hydroponische systeem dat in dit experiment werd gebruikt, werkte goed en weerspiegelde het schijnbare contrasterende fenotype onder anorganisch fosfaatdeficiënte en voldoende omstandigheden. Verschillende RSA-eigenschappen werden geanalyseerd onder contrasterende anorganische fosfaatregimes in hydroponische omstandigheden. De anorganische fosfaatdeficiënte behandeling riep een wortelfenotype op dat een kortere, ondiepere en minder vertakte RSA vertoonde, vergeleken met de anorganische fosfaatconditie.De primaire wortellengte was significant verzwakt onder de anorganische fosfaatdeficiënte toestand. Significante en snelle toename van de primaire wortellengte in de aanwezigheid van 1,25 millimolair anorganisch fosfaat of controlemedia gaf de efficiëntie van het hydroponische systeem aan en weerspiegelde de fysiomorfologische veranderingen adequaat. De vertakkingszone werd aanzienlijk verminderd onder de anorganische fosfaatdeficiënte toestand.De gemiddelde lengte van de primaire laterale wortel was significant verminderd in de pi-deficiënte toestand. De gemiddelde secundaire laterale wortellengte was op dezelfde manier verminderd als gevolg van de fosfaatdeficiënte toestand, maar het was lager in hoeveelheid dan de gemiddelde primaire laterale wortellengte. Het aantal primaire en secundaire zijwortels nam sterk af onder de fosfaatdeficiënte conditie, vergeleken met de controle, 1,25 millimolar anorganische fosfaatconditie.De primaire laterale worteldichtheid was niet veranderd onder de fosfaatdeficiënte toestand, ten opzichte van de controle, 1,25 millimolar anorganisch fosfaat. De secundaire laterale worteldichtheid vertoonde geen significante verandering, wat wijst op het belang van laterale worteldichtheid voor het verkrijgen van inzicht in de RSA-plasticiteit. Ik heb voorzichtig zaailingen uit gaas verwijderd met een pincet.Ik spreid wortels in een met water gevulde plaat met een ronde borstel, alle primaire wortels, en spreid het recht, spreid laterale wortels symmetrisch, verspreid tweede orde laterale wortels gekoppeld aan eerste orde laterale wortels. Een vergelijkbare methode kan worden gebruikt om het roetoppervlak van Arabidopsis-plantentips te berekenen. De Arabidopsis-bladeren kunnen op de andere plaat worden verspreid, gevolgd door beeldopname en analyse met behulp van vrij beschikbare ImageJ-software om het roetgebied te bepalen.Dit protocol kan worden gebruikt om vragen te beantwoorden over de invloed van de omgeving op de plasticiteit van het wortelstelsel.

Research

JoVE Journal

Biology

A Protocol for the Identification of Protein-protein Interactions Based on 15N Metabolic Labeling, Immunoprecipitation, Quantitative Mass Spectrometry and Affinity Modulation

A Protocol for the Identification of Protein-protein Interactions Based on 15N Metabolic Labeling, Immunoprecipitation, Quantitative Mass Spectrometry and Affinity Modulation

Een protocol voor de identificatie van eiwit-eiwit interacties op basis van<sup&gt; 15</sup&gt; N Metabole Labeling, Immunoprecipitatie, kwantitatieve Massaspectrometrie en Affiniteit Modulatie

Protein-protein interactions are fundamental for many biological processes in the cell. Therefore, their characterization plays an important role in ...

A Simple Protocol for Extracting Hemocytes from Wild Caterpillars

Een eenvoudig protocol voor het extraheren van hemocyten van Wild Rupsen

Insect hemocytes (equivalent to mammalian white blood cells) play an important role in several physiological processes throughout an insect's life cycle ...

An Efficient Method for Quantitative, Single-cell Analysis of Chromatin Modification and Nuclear Architecture in Whole-mount Ovules in Arabidopsis

An Efficient Method for Quantitative, Single-cell Analysis of Chromatin Modification and Nuclear Architecture in Whole-mount Ovules in Arabidopsis

Een efficiënte methode voor kwantitatieve, single-cell analyse van chromatine modificatie en Nucleaire Architectuur in zijn geheel-mount Ovules in<em&gt; Arabidopsis</em

In flowering plants, the somatic-to-reproductive cell fate transition is marked by the specification of spore mother cells (SMCs) in floral organs of the ...

Lateral Root Inducible System in Arabidopsis and Maize

Lateral Root Inducible System in Arabidopsis and Maize

Laterale Root Induceerbare System in<em&gt; Arabidopsis</em&gt; En maïs

Lateral root development contributes significantly to the root system, and hence is crucial for plant growth. The study of lateral root initiation is ...

Imaging Spatial Reorganization of a MAPK Signaling Pathway Using the Tobacco Transient Expression System

Beeldvorming Ruimtelijke Reorganisatie van een MAPK signaalroute Met behulp van de Tabak Transient Expression System

Visualization of dynamic signaling events in live cells has been a challenge. We expanded an established transient expression system, the biomolecular ...

Plant Promoter Analysis: Identification and Characterization of Root Nodule Specific Promoter in the Common Bean

De analyse van de promotor van de plant: Identificatie en karakterisering van Root knobbeltje specifieke promotor in de gemeenschappelijke Boon

The upstream sequences of gene coding sequences are termed as promoter sequences. Studying the expression patterns of promoters are very significant in ...

A Simple High Efficiency Protocol for Pancreatic Islet Isolation from Mice

Een eenvoudig hoog rendement protocol voor isolatie van de alvleesklier eiland van muizen

Pancreatic islets, also called the Islets of Langerhans, are a cluster of endocrine cells which produces hormones for glucose regulation and other ...

A Labor-saving and Repeatable Touch-force Signaling Mutant Screen Protocol for the Study of Thigmomorphogenesis of a Model Plant Arabidopsis thaliana

A Labor-saving and Repeatable Touch-force Signaling Mutant Screen Protocol for the Study of Thigmomorphogenesis of a Model Plant Arabidopsis thaliana

Een arbeidsbesparende en herhaalbare Touch-Force signalering Mutant screen protocol voor de studie van Thigmomorphogenesis van een model plant Arabidopsis thaliana

Plants responding to both intracellular and extracellular mechanical stimulations (or force signals) and develop special morphological changes, a called ...

Dry Root Rot Disease Assays in Chickpea: a Detailed Methodology

Dry Root Rot Disease Assays in Chickpea: een gedetailleerde methodologie

Dry root rot (DRR) disease is an emerging biotic stress threat to chickpea cultivation around the world. It is caused by a soil-borne fungal pathogen, ...

Preparing and Rearing Axenic Insects with Tissue Cultured Seedlings for Host-Gut Microbiota Interaction Studies of the Leaf Beetle

Het voorbereiden en fokken van axeeninsecten met weefsel gekweekte zaailingen voor gastheer-darmmicrobiota-interactiestudies van de bladkever

Insect guts are colonized by diverse bacteria that can profoundly impact the host&#39;s physiological traits. Introducing a particular bacterial strain ...