Name: a simple protocol for mapping the plant root system architecture traits
Uploaded: 2023-02-10T13:10:00
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Wir danken dem U.S. Department of Agriculture (Grant 58-6406-1-017) für die Unterstützung dieser Forschung. Wir danken auch dem WKU Biotechnology Centre, Western Kentucky University, Bowling Green, KY, USA, und dem Direktor, CSIR Central Institute of Medicinal and Aromatic Plants, Lucknow, Indien, für die Bereitstellung der Geräteausstattung und Unterstützung (CSIR CIMAP-Manuskriptmitteilung Nr. CIMAP/PUB/2022/103). SS bedankt sich für die finanzielle Unterstützung durch die Saint Joseph's University, Philadelphia, USA.

Das gesamte Protokoll ist in Abbildung 1 schematisch zusammengefasst und zeigt alle wesentlichen Schritte, die zur Aufdeckung der Wurzelsystemarchitektur (RSA) von Pflänzchen erforderlich sind. Die Protokollschritte sind im Folgenden im Detail aufgeführt:
1. Sterilisation der Oberfläche von Arabidopsis-Samen
<ol><li>Übertragen Sie einen winzigen Messlöffel (ca. 100 Samen = ca. 2,5 mg) Samen in ein Mikrofugenröhrchen und weichen Sie ihn 30 ...

<ol>
	<li>Shukla, D., Rinehart, C. A., Sahi, S. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comprehensive+study+of+excess+phosphate+response+reveals+ethylene+mediated+signaling+that+negatively+regulates+plant+growth+and+development.">Comprehensive study of excess phosphate response reveals ethylene mediated signaling that negatively regulates plant growth and development.</a> Scientific Reports. 7 (1), 3074 (2017).</li><li>Rell&#225;n-&#193;lvarez, R., Lobet, G., Dinneny, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Environmental+control+of+root+system+biology.">Environmental control of root system biology.</a> Annual Review of Plant Biology. 67, 619-642 (2016).</li><li>Gruber, B. D., Giehl, R. F. H., Friedel, S., von Wir&#233;n, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Plasticity+of+the+Arabidopsis+root+system+under+nutrient+deficiencies.">Plasticity of the Arabidopsis root system under nutrient deficiencies.</a> Plant Physiology. 163 (1), 161-179 (2013).</li><li>Shukla, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome-wide+expression+analysis+reveals+contrasting+regulation+of+phosphate+starvation+response+(PSR)+in+root+and+shoot+of+Arabidopsis+and+its+association+with+biotic+stress.">Genome-wide expression analysis reveals contrasting regulation of phosphate starvation response (PSR) in root and shoot of Arabidopsis and its association with biotic stress.</a> Environmental and Experimental Botany. , 188 (2021).</li><li>Robbins 2nd, ., E, N., Dinneny, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Growth+is+required+for+perception+of+water+availability+to+pattern+root+branches+in+plants.">Growth is required for perception of water availability to pattern root branches in plants.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 115 (4), E822-E831 (2018).</li><li>Linkohr, B. I., Williamson, L. C., Fitter, A. H., Leyser, H. M. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nitrate+and+phosphate+availability+and+distribution+have+different+effects+on+root+system+architecture+of+Arabidopsis.">Nitrate and phosphate availability and distribution have different effects on root system architecture of Arabidopsis.</a> The Plant Journal. 29 (6), 751-760 (2002).</li><li>Lynch, J. P., Brown, K. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Topsoil+foraging:+an+architectural+adaptation+of+plants+to+low+phosphorus+availability.">Topsoil foraging: an architectural adaptation of plants to low phosphorus availability.</a> Plant and Soil. 237 (2), 225-237 (2001).</li><li>L&#243;pez-Bucio, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phosphate+availability+alters+architecture+and+causes+changes+in+hormone+sensitivity+in+the+Arabidopsis+root+system.">Phosphate availability alters architecture and causes changes in hormone sensitivity in the Arabidopsis root system.</a> Plant Physiology. 129 (1), 244-256 (2002).</li><li>Jain, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differential+effects+of+sucrose+and+auxin+on+localized+phosphate+deficiency-induced+modulation+of+different+traits+of+root+system+architecture+in+Arabidopsis.">Differential effects of sucrose and auxin on localized phosphate deficiency-induced modulation of different traits of root system architecture in Arabidopsis.</a> Plant Physiology. 144 (1), 232-247 (2007).</li><li>Jain, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Variations+in+the+composition+of+gelling+agents+affect+morphophysiological+and+molecular+responses+to+deficiencies+of+phosphate+and+other+nutrients.">Variations in the composition of gelling agents affect morphophysiological and molecular responses to deficiencies of phosphate and other nutrients.</a> Plant Physiology. 150 (2), 1033-1049 (2009).</li><li>Jain, A., Sinilal, B., Dhandapani, G., Meagher, R. B., Sahi, S. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+deficiency+and+excess+of+zinc+on+morphophysiological+traits+and+spatiotemporal+regulation+of+zinc-responsive+genes+reveal+incidence+of+cross+talk+between+micro-+and+macronutrients.">Effects of deficiency and excess of zinc on morphophysiological traits and spatiotemporal regulation of zinc-responsive genes reveal incidence of cross talk between micro- and macronutrients.</a> Environmental Science and Technology. 47 (10), 5327-5335 (2013).</li><li>Jain, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Role+of+Fe-responsive+genes+in+bioreduction+and+transport+of+ionic+gold+to+roots+of+Arabidopsis+thaliana+during+synthesis+of+gold+nanoparticles.">Role of Fe-responsive genes in bioreduction and transport of ionic gold to roots of Arabidopsis thaliana during synthesis of gold nanoparticles.</a> Plant Physiology and Biochemistry. 84, 189-196 (2014).</li><li>Williamson, L. C., Ribrioux, S. P., Fitter, A. H., Leyser, H. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phosphate+availability+regulates+root+system+architecture+in+Arabidopsis.">Phosphate availability regulates root system architecture in Arabidopsis.</a> Plant Physiology. 126 (2), 875-882 (2001).</li><li>Yang, T. J. W., Lin, W. D., Schmidt, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transcriptional+profiling+of+the+Arabidopsis+iron+deficiency+response+reveals+conserved+transition+metal+homeostasis+networks.">Transcriptional profiling of the Arabidopsis iron deficiency response reveals conserved transition metal homeostasis networks.</a> Plant Physiology. 152 (4), 2130 (2010).</li><li>Kobae, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Zinc+transporter+of+Arabidopsis+thaliana+AtMTP1+is+localized+to+vacuolar+membranes+and+implicated+in+zinc+homeostasis.">Zinc transporter of Arabidopsis thaliana AtMTP1 is localized to vacuolar membranes and implicated in zinc homeostasis.</a> Plant Cell and Physiology. 45 (12), (2004).</li><li>Al-Ghazi, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Temporal+responses+of+Arabidopsis+root+architecture+to+phosphate+starvation:+evidence+for+the+involvement+of+auxin+signalling.">Temporal responses of Arabidopsis root architecture to phosphate starvation: evidence for the involvement of auxin signalling.</a> Plant, Cell and Environment. 26 (7), 1053-1066 (2003).</li><li>S, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> National Institutes of Health. , 1997-2007 (1997).</li><li>Dubrovsky, J. G., Forde, B. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+analysis+of+lateral+root+development:+pitfalls+and+how+to+avoid+them.">Quantitative analysis of lateral root development: pitfalls and how to avoid them.</a> The Plant Cell. 24 (1), 4-14 (2012).</li><li>Weeks, J. T., Ye, J., Rommens, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+an+in+planta+method+for+transformation+of+Alfalfa+(Medicago+sativa).">Development of an in planta method for transformation of Alfalfa (Medicago sativa).</a> Transgenic Research. 17 (4), 587-597 (2008).</li><li>Shukla, D., Krishnamurthy, S., Sahi, S. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microarray+analysis+of+Arabidopsis+under+gold+exposure+to+identify+putative+genes+involved+in+the+synthesis+of+gold+nanoparticles+(AuNPs).Genomics+Data.">Microarray analysis of Arabidopsis under gold exposure to identify putative genes involved in the synthesis of gold nanoparticles (AuNPs).Genomics Data.</a> 3, 100-102 (2015).</li></ol>

In dieser Arbeit wurde die Kartierung von RSA mit einfachen Laborgeräten demonstriert. Mit dieser Methode werden phänotypische Veränderungen auf der verfeinerten Ebene erfasst. Der Vorteil dieser Strategie besteht darin, dass der Sprossteil nie mit dem Medium in Berührung kommt, so dass der Phänotyp der Pflänzchen ursprünglich ist. Bei dieser Methode wird ein hydroponisches System eingerichtet, um Pflänzchen zu züchten, wie im Protokoll beschrieben. Dann wird jedes Pflänzchen unversehrt herausgenommen und auf e...

Die unterirdische Wurzelsystemarchitektur (RSA) ist ein wichtiges Organ für das Wachstum und die Produktivität von Pflanzen 1,2,3. Nach dem Embryonalstadium durchlaufen Pflanzen ihre wichtigsten morphologischen Veränderungen. Die Art und Weise, wie die Wurzeln im Boden wachsen, hat einen großen Einfluss auf das Wachstum von Pflanzenteilen über der Erde. Das Wurzelwachstum ist der erste Schritt in der Keimung. Es ist ein informatives Merkmal, da es auf einzigartige Weise auf verschiedene verfügbare Nährstoffe reagiert 1,2,3,4. Die RSA weist ein hohes Maß an Entwicklungsplastizität auf, was bedeutet, dass die Umgebung immer verwendet wird, um Entscheidungen über die Entwicklung zu treffen 2,5. Veränderungen in der Umwelt haben die Pflanzenproduktion im gegenwärtigen Szenario erschwert. Die RSA bezieht kontinuierlich Umweltsignale in Entwicklungsentscheidungen ein5. Daher ist ein gründliches Verständnis der Prinzipien, die der Wurzelentwicklung zugrunde liegen, unerlässlich, um zu lernen, wie Pflanzen auf sich verändernde Umweltbedingungen reagieren 2,5.
Der RSA erkennt variierende Nährstoffkonzentrationen und gibt phänotypische Veränderungen wieder: 4,6,7,8,9,10,11,12. Studien deuten darauf hin, dass die Wurzelmorphologie/RSA im Vergleich zur Sprossmorphologie sehr plastisch ist 1,3. Die Kartierung von RSA-Merkmalen ist sehr effektiv bei der Erfassung der Auswirkungen der Veränderung der umgebenden Bodenumgebung 1,11,12.
Im Allgemeinen wurden in vielen früheren Studien Diskrepanzen in der Wirkung verschiedener Nährstoffmängel auf den Wurzelphänotyp berichtet 3,11,13,14,15. Zum Beispiel gibt es mehrere gegensätzliche Berichte über Phosphat (Pi)-Hunger induzierte Veränderungen in der Anzahl, Länge und Dichte der Seitenwurzeln (LRs). Eine Zunahme der LR-Dichte wurde unter der Pi-Mangelbedingung 6,8 berichtet. Im Gegensatz dazu wurde auch von anderen Autoren über eine Abnahme der LR-Dichte unter Pi-defizienten Bedingungen berichtet 3,13,16. Eine der Hauptursachen für diese Inkonsistenzen ist die Verwendung des elementaren kontaminationsanfälligen Geliermediums, das Agar oftenthält 10. Forscher züchten ihre Versuchspflanzen in der Regel auf einem Plattensystem auf Agarbasis und zeichnen die Wurzelmerkmale auf. Zahlreiche RSA-Merkmale sind häufig im Agarmaterial verborgen oder verankert und können nicht dokumentiert werden. Experimente im Zusammenhang mit der Induktion eines Nährstoffmangels, bei denen Anwender häufig eine Komponente vollständig aus dem Medium ausschließen, können in elementar kontaminationsanfälligem Geliermedium nicht durchgeführt werden11,14,15. Zahlreiche Nährstoffe sind häufig in signifikanten Mengen in den Agarmedien vorhanden, darunter P, Zn, Fe und viele mehr11,14,15. Darüber hinaus ist das RSA-Wachstum in agarbasierten Medien langsamer als in flüssigen Medien ohne Agar. Daher besteht die Notwendigkeit, einen alternativen, nicht-agar-basierten Ansatz zur Quantifizierung und qualitativen Erfassung des Phänotyps von RSA zu etablieren. Folglich wurde die aktuelle Methode entwickelt, bei der Pflänzchen in einem magentafarbenen, kastenbasierten hydroponischen System auf einem Polypropylennetz aufgezogen werden, das von Polycarbonatkeilengetragen wird 1,10,11.
Diese Studie präsentiert eine detaillierte improvisierte Version der früheren Methode, die von Jain et al.10 beschrieben wurde. Diese Strategie wurde auf die aktuellen Anforderungen in der Pflanzenwurzelbiologie abgestimmt und kann auch für andere Pflanzen wie Luzerne als Modellpflanzen verwendet werden. Das Protokoll ist die primäre Methode, um die Änderungen in RSA zu messen, und es erfordert nur einfache Geräte. Das vorliegende Protokoll veranschaulicht die Phänotypisierung verschiedener Wurzelmerkmale, wie z.B. Primär- und Seitenwurzeln in normalem und modifiziertem Medium (Pi-defizient). Schritt-für-Schritt-Anleitungen und andere hilfreiche Hinweise, die aus den Erfahrungen des Autors gewonnen wurden, werden bereitgestellt, um den Forschern zu helfen, den in dieser Methode angebotenen Methoden zu folgen. Ziel der vorliegenden Studie ist es, eine einfache und effektive Methode zur Aufdeckung des gesamten Wurzelsystems von Pflanzen, einschließlich LRs höherer Ordnung, bereitzustellen. Bei dieser Methode wird das Wurzelsystem manuell mit einem runden Aquarellpinsel verteilt, was eine präzise Kontrolle über die Belichtung der Wurzeln ermöglicht 1,10,11,12. Es erfordert keine teure Ausrüstung oder komplizierte Software. Diese Methode hat die Nährstoffaufnahme und die Wachstumsrate verbessert; Pflanzen haben eine nährstoffreiche Lösung, die leicht von ihren Wurzeln aufgenommen wird. Die vorliegende Methode eignet sich für Forscher, die die Merkmale des Wurzelsystems einer Pflanze detailliert kartieren möchten, insbesondere während der frühen Entwicklung (10-15 Tage nach der Keimung). Es eignet sich für kleine Wurzelsysteme, Modellpflanzen wie Arabidopsis und Tabak und unkonventionelle Pflanzen wie Luzerne, bis ihr Wurzelsystem in die magentafarbenen Boxen passt.
Die Schritte zur phänotypischen Analyse der RSA-Entwicklung in Arabidopsis werden in diesem Protokoll wie folgt beschrieben: (1) die Methode der Sterilisation der Samenoberfläche für Pflanzen (Arabidopsis), (2) die Schritte zum Aufbau des hydroponischen Systems, gefolgt von der Aussaat des Saatguts auf einem Medium, (3) Verfahren zum Herausnehmen der vollständigen Aussaat und zum Verteilen auf der Petriplatte für die RSA-Analyse, (4) wie man die Bilder für RSA aufzeichnet und (5) wie man wichtige RSA-Parameter mit der ImageJ-Software berechnet.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Arabidospsis thaliana (Col 0)</td>
			<td>Lehle Seeds</td>
			<td>WT-02</td>
			<td>Columbia (Col-0**, no markers)*</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Art brushes</td>
			<td>Amazon or any other vendor</td>
			<td></td>
			<td>Water color round brush size no. 14 (8 mm), 16 (9.5 mm), 18 (12 mm), and 20 (14.2 mm)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Automated Microscope with digital camera</td>
			<td>Leica Microsystems</td>
			<td></td>
			<td>LAS version 4.12.0, Leica Microsystems</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Imaging Software</td>
			<td>ImageJ</td>
			<td></td>
			<td>ImageJ V 
			&#160;1.8.0</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magenta box GA-7</td>
			<td>Fisher Scientific&#160;</td>
			<td>50-255-176</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Medicago sativa</td>
			<td>Johnny&#39;s Seeds</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri-plate (150 mm x 15 mm)</td>
			<td>USA Scientific</td>
			<td>8609-0215</td>
			<td>150 mm x 15 mm PS Petri Dish (https://www.usascientific.com)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Photo camera</td>
			<td>Cannon or Nikon</td>
			<td></td>
			<td>Any high mega pixel (atleast 12 mega pixel per inch) camera on macro mode</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plant-Agar</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A3301</td>
			<td>Agargel&#160; Suitable for plant tissue culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polycarbonate Sheets</td>
			<td>Amazon</td>
			<td></td>
			<td>1 mm&#160; thick</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polypropylene Mesh</td>
			<td>Amazon</td>
			<td></td>
			<td>Pore size 250 &#181;m, 500 &#181;m and 1000 &#181;m</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scanner</td>
			<td>Epson</td>
			<td></td>
			<td>Epson Perfection V700 Photo (Scan at 600 dpi)</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a simple protocol for mapping the plant root system architecture traits

Umfassende Kenntnisse über die Entwicklung der Architektur des Pflanzenwurzelsystems (RSA) sind entscheidend für die Verbesserung der Nährstoffnutzungseffizienz und die Erhöhung der Toleranz der Pflanzensorten gegenüber Umweltherausforderungen. Es wird ein experimentelles Protokoll für den Aufbau des hydroponischen Systems, das Wachstum der Pflänzchen, die RSA-Ausbreitung und die Bildgebung vorgestellt. Der Ansatz verwendete ein magentafarbenes, kastenbasiertes hydroponisches System, das Polypropylengewebe enthält, das von Polycarbonatkeilen getragen wird. Experimentelle Settings werden beispielhaft durch die Bewertung der RSA der Pflänzchen unter variierender Nährstoffversorgung (Phosphat [Pi]) veranschaulicht. Das System wurde entwickelt, um die RSA von Arabidopsis zu untersuchen, aber es ist leicht anpassbar, um andere Pflanzen wie Medicago sativa (Alfalfa ) zu untersuchen. Arabidopsis thaliana (Col-0) Pflänzchen werden in dieser Untersuchung als Beispiel verwendet, um die Pflanze RSA zu verstehen. Das Saatgut wird durch Behandlung mit Ethanol und verdünntem handelsüblichem Bleichmittel oberflächensterilisiert und zur Stratifizierung bei 4 °C gehalten. Die Samen werden gekeimt und auf einem flüssigen Halb-MS-Medium auf einem Polypropylengewebe gezüchtet, das von Polycarbonatkeilen getragen wird. Die Pflänzchen werden unter Standard-Wachstumsbedingungen für die gewünschte Anzahl von Tagen gezüchtet, vorsichtig aus dem Netz gepflückt und in wasserhaltige Agarplatten getaucht. Jedes Wurzelsystem der Pflänzchen wird mit Hilfe eines runden Kunstpinsels sanft auf der mit Wasser gefüllten Platte verteilt. Diese Petriplatten werden mit hoher Auflösung fotografiert oder gescannt, um die RSA-Merkmale zu dokumentieren. Die Wurzelmerkmale, wie Primärwurzel, Seitenwurzeln und Verzweigungszone, werden mit der frei verfügbaren Software ImageJ gemessen. In dieser Studie werden Techniken zur Messung von Pflanzenwurzelmerkmalen in kontrollierten Umweltumgebungen vorgestellt. Wir diskutieren, wie man (1) die Pflänzchen züchtet und Wurzelproben sammelt und verteilt, (2) Bilder von ausgebreiteten RSA-Proben erhält, (3) die Bilder erfasst und (4) Bildanalysesoftware verwendet, um Wurzelattribute zu quantifizieren. Der Vorteil der vorliegenden Methode liegt in der vielseitigen, einfachen und effizienten Messung der RSA-Merkmale.

Die verschiedenen morphometrischen Merkmale der Wurzelsystemarchitektur (RSA) werden mit einfachen Laborwerkzeugen gemessen und die Schritte sind in Abbildung 1 schematisch dargestellt. Die Details des hydroponischen Aufbaus zeigen das Potenzial des Protokolls bei der Messung des RSA (Abbildung 1 und Abbildung 2).
Angesichts der beobachteten Unterschiede bei den Geliermitteln verwendeten wir ein hydroponi...

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A Simple Protocol for Mapping the Plant Root System Architecture Traits

Wir verwenden einfache Laborwerkzeuge, um die Wurzelsystemarchitektur (RSA) von Arabidopsis und Medicago zu untersuchen. Die Pflänzchen werden hydroponisch über Mesh gezüchtet und mit einem Kunstpinsel verteilt, um die RSA freizulegen. Die Bilder werden mit Hilfe eines Scans oder einer hochauflösenden Kamera aufgenommen und dann mit ImageJ analysiert, um Merkmale zu kartieren.

Ein einfaches Protokoll zur Kartierung der Architekturmerkmale des Pflanzenwurzelsystems

Comprehensive knowledge of plant root system architecture (RSA) development is critical for improving nutrient use efficiency and increasing crop cultivar ...

Hierbei handelt es sich um eine nicht-invasive hydroponische Methode zur Messung der Wurzelsystemarchitektur mit routinemäßigen Laborgeräten. Dieses Protokoll ermöglicht die vollständige Visualisierung des gesamten Wurzelsystems der Pflanze durch manuelles Spreizen. Einer der Hauptvorteile der RSA-Analyse besteht darin, dass sie die Untersuchung des Pflanzenwurzelsystems ermöglicht, ohne dass dies zu unerwünschten elementaren Verunreinigungen führen kann.Mit dieser Methode kann die direkte Umweltinteraktion einschließlich hormoneller, Nährstoff- und klimatischer Bedingungen mit der RSA von Pflanzensystemen aufgezeichnet werden. Beginnen Sie mit der Oberflächensterilisation von Arabidopsis-Samen, indem Sie einen winzigen Messlöffel mit etwa 100 Samen in destilliertem Wasser bei Raumtemperatur einweichen. Nach 30 Minuten zentrifugieren Sie die Samen kurz bei 500 g für fünf Sekunden mit einer Tischzentrifuge.Als nächstes dekantieren Sie das Wasser und fügen 700 Mikroliter 70%iges Ethanol hinzu, bevor Sie das Röhrchen einige Sekunden lang vortexen. Zentrifugieren Sie die Samen erneut. Falls erforderlich, wiederholen Sie das Vortexen und Zentrifugieren, wobei darauf zu achten ist, dass die Behandlung mit 70 % Ethanol nicht länger als drei Minuten dauert.Spülen Sie die Samen nach drei Minuten sofort mit sterilem Wasser ab. Als nächstes behandeln Sie die Samen sieben Minuten lang mit verdünntem handelsüblichem Bleichmittel, das einen Tropfen TWEEN 20 enthält. Mischen Sie die Samen mit Bleichlösung, indem Sie die Röhrchen acht bis 12 Mal schnell umdrehen.Nach einer kurzen Zentrifugation wird der Überstand mit einer Ein-Milliliter-Pipette umgefüllt und die Samen mindestens fünfmal mit sterilem Wasser gespült, wobei das gleiche Vortex-Verfahren folgt. Lassen Sie die oberflächlich sterilisierten Samen in Wasser und inkubieren Sie sie zwei bis drei Tage lang bei vier Grad Celsius zur Stratifizierung. Autoklavieren Sie die magentafarbene Standardbox, die zur Hälfte mit destilliertem Wasser gefüllt ist.Schneiden Sie die autoklavierte Polycarbonatplatte in vier mal acht Zentimeter große Rechtecke mit einem Mittelpunkt, der mehr als in der Mitte des Rechtecks eingekerbt ist, so dass zwei Rechtecke zusammenpassen können, um eine X-Form zu bilden. Verwenden Sie diesen Aufbau, um das 250 Mikrometer große, porengroße Polypropylengewebe zu halten, das in sechs mal sechs Zentimeter große Quadrate geschnitten ist. Geben Sie im Laminar-Airflow-Schrank sterile halbe MS-Basalmedien mit Vitaminen plus 1,5 % Saccharose in jede Box, um die Unterkante des Polypropylengewebes zu erreichen.Säen Sie die oberflächlich sterilisierten Samen hydroponisch auf das Netz und züchten Sie sie drei Tage lang. Übertragen Sie die Sämlinge nach drei Tagen auf ein 500 Mikrometer porengroßes Netz und lassen Sie sie zwei Tage lang wachsen. Als nächstes werden die Sämlinge auf das Kontrollmedium und auf das Versuchsmedium übertragen und die Samen sieben Tage lang wachsen lassen.Geben Sie 10 bis 20 Milliliter autoklaviertes gefiltertes Leitungswasser auf die Petriplatte. Ziehen Sie die Sämlinge vorsichtig aus der 500-Mikrometer-Maschenweite. Verteilen Sie mit Hilfe eines runden Kunstpinsels pflanzenartige Wurzeln in der mit Wasser gefüllten Platte und tauchen Sie sie in Wasser.Kippen Sie die Platte leicht, um das Wasser zu entfernen. Scannen oder fotografieren Sie diese Petriplatten entsprechend. Messen Sie die Root-Systemarchitektur oder RSA-Merkmale mit der frei verfügbaren ImageJ-Software und öffnen Sie dann die zu analysierende Datei.Verwenden Sie nach dem Festlegen der Skalierung das Werkzeug für gerade Linien, um eine Linienauswahl zu erstellen, die die Maßstabsleiste umreißt. Beenden Sie die Gliederung, indem Sie mit der rechten Maustaste klicken, doppelklicken oder in das Feld am Anfang klicken. Um die Länge der bekannten Maßstabsleiste in Pixeln zu messen, klicken Sie in der Symbolleiste auf Analysieren und anschließend auf Messen.Notieren Sie sich die Pixellänge. Öffnen Sie das Dialogfeld "Skalierung festlegen", indem Sie auf der Registerkarte "Analysieren" auf die Registerkarte "Skalierung festlegen" klicken. Überprüfen Sie die Pixellänge im Feld Abstand in Pixeln.Geben Sie als Nächstes den Wert der Maßstabsleiste in das Feld "Bekannte Entfernung" ein, und legen Sie die Längeneinheit auf Millimeter fest. Sperren Sie den Maßstab für dieses bestimmte Bild, indem Sie auf OK klicken. Verwenden Sie das Werkzeug Segmentierte Linien für eine Linienauswahl, die die Wurzellänge umreißt.Nachdem Sie die Kontur fertiggestellt haben, passen Sie die Linienauswahl an, indem Sie auf die kleinen schwarz-weißen Griffe klicken und sie entlang der Kontur ziehen. Wählen Sie auf der Registerkarte "Analysieren" von ImageJ den Befehl "Messen" aus, und quantifizieren Sie die Wurzellänge. Übertragen Sie die gemessenen Daten in eine Tabelle, indem Sie mit der rechten Maustaste auf das Ergebnisfenster klicken, alle kopieren aus dem Popup-Menü auswählen, zur Tabelle wechseln und die Daten einfügen.Messen Sie für die Messung und Berechnung von RSA-Merkmalen die primäre Wurzellänge zwischen der Hypokotylverbindung und dem Ende der Wurzelspitzen. Messen Sie dann die Seitenwurzeln erster Ordnung oder ein Grad LR-Länge und die Seitenwurzeln zweiter Ordnung oder zwei Grad LR-Länge. Wenn Sie fertig sind, kopieren Sie alle Messungen und fügen Sie sie in die Tabelle ein.Messen und zeichnen Sie die Verzweigungszone der Primärwurzel (BZPR) auf, die sich über den ersten Austrittspunkt der Seitenwurzel bis zum letzten Austrittspunkt der Seitenwurzel erstreckt. Erfassen Sie in ähnlicher Weise die Anzahl der Seitenwurzeln, die innerhalb der BZPR-Grenze entstehen. Messen Sie als Nächstes die durchschnittliche Länge der Seitenwurzeln erster und höherer Ordnung.Leiten Sie die durchschnittliche Länge der primären Seitenwurzeln ab, indem Sie die Gesamtlänge der primären Seitenwurzeln durch die Gesamtzahl der primären Seitenwurzeln dividieren. Um dann die durchschnittliche Länge der Seitenwurzeln zweiter Ordnung zu messen, berechnen Sie die durchschnittliche Länge der sekundären Seitenwurzeln, indem Sie die Gesamtlänge der sekundären Seitenwurzeln durch die Gesamtzahl der sekundären Seitenwurzeln dividieren. Messen Sie die primäre Seitenwurzeldichte, indem Sie die Anzahl der primären Seitenwurzeln durch die Länge des BZPR dividieren.Als nächstes messen Sie die Verzweigungszone einzelner Seitenwurzeln und berechnen die sekundäre Seitenwurzeldichte, indem Sie die Anzahl der sekundären Seitenwurzeln durch die Länge der Verzweigungszonen der Seitenwurzellängen zweiter Ordnung teilen. Wenn Sie fertig sind, messen Sie die Gesamtfußlänge oder TRL. Dies ist die Summe der Primärwurzeln und der primären und sekundären Seitenwurzellängen.Das hydroponische System, das in diesem Experiment verwendet wurde, funktionierte gut und spiegelte den offensichtlich kontrastierenden Phänotyp unter anorganischen Phosphatmangel und ausreichenden Bedingungen wider. Verschiedene RSA-Merkmale wurden unter kontrastierenden anorganischen Phosphatregimen unter hydroponischen Bedingungen analysiert. Die Behandlung mit anorganischem Phosphatmangel rief einen Wurzelphänotyp hervor, der eine kürzere, flachere und weniger verzweigte RSA aufwies, verglichen mit der anorganischen Phosphat-Suffizienz-Bedingung.Die primäre Wurzellänge war unter der anorganischen Phosphatmangelbedingung signifikant abgeschwächt. Eine signifikante und schnelle Zunahme der primären Wurzellänge in Gegenwart von 1,25 millimolar anorganischem Phosphat oder Kontrollmedien deutete auf die Effizienz des hydroponischen Systems hin und spiegelte die physiomorphologischen Veränderungen angemessen wider. Die Verzweigungszone war unter der anorganischen Phosphatmangelbedingung signifikant reduziert.Die durchschnittliche Länge der primären Seitenwurzel war im pi-defizienten Zustand signifikant reduziert. Die durchschnittliche sekundäre Seitenwurzellänge war aufgrund des phosphatarmen Zustands ebenfalls reduziert, jedoch mengenmäßig geringer als die durchschnittliche primäre Seitenwurzellänge. Die Anzahl der primären und sekundären Seitenwurzeln nahm unter der phosphatarmen Bedingung stark ab, verglichen mit der Kontrollbedingung mit 1,25 millimolarem anorganischem Phosphat.Die primäre laterale Wurzeldichte wurde unter der phosphatarmen Bedingung im Vergleich zur Kontrollbedingung mit 1,25 millimolarem anorganischem Phosphat nicht verändert. Die sekundäre Seitenwurzeldichte zeigte keine signifikante Veränderung, was auf die Bedeutung der Seitenwurzeldichte für den Einblick in die RSA-Plastizität hinweist. Ich habe die Sämlinge vorsichtig mit einer Pinzette aus dem Netz entfernt.Ich verteile die Wurzeln in einer mit Wasser gefüllten Platte mit einer Rundbürste, alle Primärwurzeln, und spreize sie gerade, spreizte die Seitenwurzeln symmetrisch, spreizte Seitenwurzeln zweiter Ordnung, die mit Seitenwurzeln erster Ordnung verbunden sind. Eine ähnliche Methode kann verwendet werden, um die Rußfläche von Arabidopsis-Pflanzenspitzen zu berechnen. Die Arabidopsis-Blätter können auf der anderen Platte verteilt werden, gefolgt von einer Bildaufnahme und Analyse mit der frei verfügbaren ImageJ-Software, um die Rußfläche zu bestimmen.Dieses Protokoll kann verwendet werden, um alle Fragen über den Einfluss der Umwelt auf die Plastizität des Wurzelsystems zu beantworten.

Research

JoVE Journal

Biology

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