Name: a simple protocol for mapping the plant root system architecture traits
Uploaded: 2023-02-10T13:10:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about A Simple Protocol for Mapping the Plant Root System Architecture Traits at JoVE.com

אנו מודים למשרד החקלאות האמריקאי (מענק 58-6406-1-017) על תמיכתו במחקר זה. אנו מודים גם למרכז הביוטכנולוגיה WKU, אוניברסיטת מערב קנטקי, באולינג גרין, KY, ארה"ב, ולמנהל המכון המרכזי CSIR לצמחי מרפא וריח, לאקנאו, הודו, על אספקת מתקני המכשיר והתמיכה (CSIR CIMAP manuscript communication no. CIMAP/PUB/2022/103). SS מודה על התמיכה הכספית מאוניברסיטת סנט ג'וזף, פילדלפיה, ארה"ב.

הפרוטוקול כולו מסוכם באופן סכמטי באיור 1, ומציג את כל השלבים החיוניים הכרוכים בחשיפת ארכיטקטורת מערכת השורשים (RSA) של צמחים. שלבי הפרוטוקול מפורטים להלן:
1. עיקור פני השטח של זרעי Arabidopsis
<ol><li>מעבירים כף מדידה זעירה (כ-100 זרעים = כ-2.5 מ"ג) של זרעים לצינור מ...

<ol>
	<li>Shukla, D., Rinehart, C. A., Sahi, S. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comprehensive+study+of+excess+phosphate+response+reveals+ethylene+mediated+signaling+that+negatively+regulates+plant+growth+and+development.">Comprehensive study of excess phosphate response reveals ethylene mediated signaling that negatively regulates plant growth and development.</a> Scientific Reports. 7 (1), 3074 (2017).</li><li>Rell&#225;n-&#193;lvarez, R., Lobet, G., Dinneny, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Environmental+control+of+root+system+biology.">Environmental control of root system biology.</a> Annual Review of Plant Biology. 67, 619-642 (2016).</li><li>Gruber, B. D., Giehl, R. F. H., Friedel, S., von Wir&#233;n, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Plasticity+of+the+Arabidopsis+root+system+under+nutrient+deficiencies.">Plasticity of the Arabidopsis root system under nutrient deficiencies.</a> Plant Physiology. 163 (1), 161-179 (2013).</li><li>Shukla, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome-wide+expression+analysis+reveals+contrasting+regulation+of+phosphate+starvation+response+(PSR)+in+root+and+shoot+of+Arabidopsis+and+its+association+with+biotic+stress.">Genome-wide expression analysis reveals contrasting regulation of phosphate starvation response (PSR) in root and shoot of Arabidopsis and its association with biotic stress.</a> Environmental and Experimental Botany. , 188 (2021).</li><li>Robbins 2nd, ., E, N., Dinneny, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Growth+is+required+for+perception+of+water+availability+to+pattern+root+branches+in+plants.">Growth is required for perception of water availability to pattern root branches in plants.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 115 (4), E822-E831 (2018).</li><li>Linkohr, B. I., Williamson, L. C., Fitter, A. H., Leyser, H. M. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nitrate+and+phosphate+availability+and+distribution+have+different+effects+on+root+system+architecture+of+Arabidopsis.">Nitrate and phosphate availability and distribution have different effects on root system architecture of Arabidopsis.</a> The Plant Journal. 29 (6), 751-760 (2002).</li><li>Lynch, J. P., Brown, K. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Topsoil+foraging:+an+architectural+adaptation+of+plants+to+low+phosphorus+availability.">Topsoil foraging: an architectural adaptation of plants to low phosphorus availability.</a> Plant and Soil. 237 (2), 225-237 (2001).</li><li>L&#243;pez-Bucio, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phosphate+availability+alters+architecture+and+causes+changes+in+hormone+sensitivity+in+the+Arabidopsis+root+system.">Phosphate availability alters architecture and causes changes in hormone sensitivity in the Arabidopsis root system.</a> Plant Physiology. 129 (1), 244-256 (2002).</li><li>Jain, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differential+effects+of+sucrose+and+auxin+on+localized+phosphate+deficiency-induced+modulation+of+different+traits+of+root+system+architecture+in+Arabidopsis.">Differential effects of sucrose and auxin on localized phosphate deficiency-induced modulation of different traits of root system architecture in Arabidopsis.</a> Plant Physiology. 144 (1), 232-247 (2007).</li><li>Jain, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Variations+in+the+composition+of+gelling+agents+affect+morphophysiological+and+molecular+responses+to+deficiencies+of+phosphate+and+other+nutrients.">Variations in the composition of gelling agents affect morphophysiological and molecular responses to deficiencies of phosphate and other nutrients.</a> Plant Physiology. 150 (2), 1033-1049 (2009).</li><li>Jain, A., Sinilal, B., Dhandapani, G., Meagher, R. B., Sahi, S. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+deficiency+and+excess+of+zinc+on+morphophysiological+traits+and+spatiotemporal+regulation+of+zinc-responsive+genes+reveal+incidence+of+cross+talk+between+micro-+and+macronutrients.">Effects of deficiency and excess of zinc on morphophysiological traits and spatiotemporal regulation of zinc-responsive genes reveal incidence of cross talk between micro- and macronutrients.</a> Environmental Science and Technology. 47 (10), 5327-5335 (2013).</li><li>Jain, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Role+of+Fe-responsive+genes+in+bioreduction+and+transport+of+ionic+gold+to+roots+of+Arabidopsis+thaliana+during+synthesis+of+gold+nanoparticles.">Role of Fe-responsive genes in bioreduction and transport of ionic gold to roots of Arabidopsis thaliana during synthesis of gold nanoparticles.</a> Plant Physiology and Biochemistry. 84, 189-196 (2014).</li><li>Williamson, L. C., Ribrioux, S. P., Fitter, A. H., Leyser, H. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phosphate+availability+regulates+root+system+architecture+in+Arabidopsis.">Phosphate availability regulates root system architecture in Arabidopsis.</a> Plant Physiology. 126 (2), 875-882 (2001).</li><li>Yang, T. J. W., Lin, W. D., Schmidt, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transcriptional+profiling+of+the+Arabidopsis+iron+deficiency+response+reveals+conserved+transition+metal+homeostasis+networks.">Transcriptional profiling of the Arabidopsis iron deficiency response reveals conserved transition metal homeostasis networks.</a> Plant Physiology. 152 (4), 2130 (2010).</li><li>Kobae, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Zinc+transporter+of+Arabidopsis+thaliana+AtMTP1+is+localized+to+vacuolar+membranes+and+implicated+in+zinc+homeostasis.">Zinc transporter of Arabidopsis thaliana AtMTP1 is localized to vacuolar membranes and implicated in zinc homeostasis.</a> Plant Cell and Physiology. 45 (12), (2004).</li><li>Al-Ghazi, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Temporal+responses+of+Arabidopsis+root+architecture+to+phosphate+starvation:+evidence+for+the+involvement+of+auxin+signalling.">Temporal responses of Arabidopsis root architecture to phosphate starvation: evidence for the involvement of auxin signalling.</a> Plant, Cell and Environment. 26 (7), 1053-1066 (2003).</li><li>S, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> National Institutes of Health. , 1997-2007 (1997).</li><li>Dubrovsky, J. G., Forde, B. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+analysis+of+lateral+root+development:+pitfalls+and+how+to+avoid+them.">Quantitative analysis of lateral root development: pitfalls and how to avoid them.</a> The Plant Cell. 24 (1), 4-14 (2012).</li><li>Weeks, J. T., Ye, J., Rommens, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+an+in+planta+method+for+transformation+of+Alfalfa+(Medicago+sativa).">Development of an in planta method for transformation of Alfalfa (Medicago sativa).</a> Transgenic Research. 17 (4), 587-597 (2008).</li><li>Shukla, D., Krishnamurthy, S., Sahi, S. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microarray+analysis+of+Arabidopsis+under+gold+exposure+to+identify+putative+genes+involved+in+the+synthesis+of+gold+nanoparticles+(AuNPs).Genomics+Data.">Microarray analysis of Arabidopsis under gold exposure to identify putative genes involved in the synthesis of gold nanoparticles (AuNPs).Genomics Data.</a> 3, 100-102 (2015).</li></ol>

עבודה זו הדגימה מיפוי RSA באמצעות ציוד מעבדה פשוט. באמצעות שיטה זו, שינויים פנוטיפיים נרשמים ברמה המעודנת. היתרון של אסטרטגיה זו הוא שחלק הצילומים לעולם לא בא במגע עם התקשורת, ולכן הפנוטיפ של הצמחים הוא מקורי. שיטה זו כוללת הקמת מערכת הידרופונית לגידול צמחים כמתואר בפרוטוקול. לאחר מכן, מוציא...

ארכיטקטורת מערכת השורשים (RSA), שהיא תת-קרקעית, היא איבר חיוני לגידול צמחים ולפרודוקטיביות 1,2,3. לאחר השלב העוברי, הצמחים עוברים את השינויים המורפולוגיים המשמעותיים ביותר שלהם. האופן שבו השורשים גדלים בקרקע משפיע מאוד על צמיחת חלקי הצמח מעל פני הקרקע. צמיחת שורשים היא הצעד הראשון בנביטה. זוהי תכונה אינפורמטיבית שכן היא מגיבה באופן ייחודי לחומרים מזינים זמינים שונים 1,2,3,4. RSA מפגין רמה גבוהה של פלסטיות התפתחותית, כלומר הסביבה משמשת תמיד לקבלת החלטות על פיתוח 2,5. שינויים בסביבה הקשו על ייצור היבול בתרחיש הנוכחי. באופן רציף, ה-RSA משלב אותות סביבתיים בבחירות התפתחותיות5. כתוצאה מכך, הבנה מעמיקה של העקרונות העומדים מאחורי התפתחות שורשים חיונית ללמידה כיצד צמחים מגיבים לסביבות משתנות 2,5.
ה-RSA חש ריכוזים תזונתיים משתנים ומבצע שינויים פנוטיפיים 4,6,7,8,9,10,11,12. מחקרים מראים שמורפולוגיה של שורשים/RSA היא פלסטית מאוד בהשוואה למורפולוגיה של יורה 1,3. מיפוי תכונות RSA יעיל ביותר ברישום ההשפעה שלשינוי סביבת הקרקע הסובבת 1,11,12.
באופן כללי, פערים בהשפעה של חוסרים תזונתיים שונים על פנוטיפ השורש דווחו במחקרים קודמים רבים 3,11,13,14,15. לדוגמה, ישנם מספר דיווחים מנוגדים על שינויים הנגרמים על ידי רעב פוספט (Pi) במספר, אורך וצפיפות של שורשים רוחביים (LR). עלייה בצפיפות LR דווחה תחת מצב חסר Pi 6,8. לעומת זאת, ירידה בצפיפות LR בתנאים של מחסור ב-Pi דווחה גם על ידי מחברים אחרים 3,13,16. אחד הגורמים הבולטים לחוסר עקביות זה הוא השימוש במדיום הג'לינג הנוטה לזיהום יסודי, אשר אגר מכיל לעתים קרובות10. חוקרים בדרך כלל מגדלים את צמחי הניסוי שלהם על מערכת לוחות מבוססת אגר ורושמים את תכונות השורש. תכונות RSA רבות מוסתרות או מעוגנות לעתים קרובות בתוך חומר האגר ולא ניתן לתעדן. ניסויים הקשורים לגרימת מחסור בחומרים מזינים, שבהם משתמשים לעתים קרובות מוציאים רכיב אחד לחלוטין מהמדיום, אינם יכולים להתבצע בתווך ג'ל הנוטה לזיהום יסודי11,14,15. חומרים מזינים רבים נמצאים לעתים קרובות בכמויות משמעותיות במדיה אגר, כולל P, Zn, Fe, ועוד רבים 11,14,15. יתר על כן, צמיחת RSA איטית יותר במדיה מבוססת אגר מאשר בתווך נוזלי שאינו מבוסס אגר. כתוצאה מכך, יש צורך לבסס גישה חלופית שאינה מבוססת אגר לכימות ורישום איכותי של הפנוטיפ של RSA. כתוצאה מכך, פותחה השיטה הנוכחית, שבה מגדלים פלנטלים במערכת הידרופונית מבוססת קופסת מגנטה על גבי רשת פוליפרופילן הנתמכת על ידי טריזי פוליקרבונט 1,10,11.
מחקר זה מציג גרסה מאולתרת מפורטת של השיטה הקודמת שתוארה על ידי Jain et al.10. אסטרטגיה זו כווננה לדרישות הנוכחיות בביולוגיה של שורשי הצמח וניתן להשתמש בה גם עבור צמחים כמו אספסת, מלבד צמחי מודל. הפרוטוקול הוא הדרך העיקרית למדוד את השינויים ב-RSA, והוא דורש רק ציוד פשוט. הפרוטוקול הנוכחי מדגים כיצד לפנוטיפ מספר תכונות שורש, כגון שורשים ראשוניים ורוחביים בתווך נורמלי ושונה (חסר Pi). הוראות שלב אחר שלב ורמזים מועילים אחרים שלוקטו מחוויותיו של המחבר מסופקים כדי לעזור לחוקרים לעקוב אחר המתודולוגיות המוצעות בשיטה זו. המחקר הנוכחי נועד לספק שיטה פשוטה ויעילה לחשיפת כל מערכת השורשים של צמחים, כולל LR מסדר גבוה יותר. שיטה זו כוללת פיזור ידני של מערכת השורשים באמצעות מברשת עגולה בצבעי מים, המאפשרת שליטה מדויקת בחשיפת השורשים 1,10,11,12. זה לא דורש ציוד יקר או תוכנה מסובכת. שיטה זו שיפרה את ספיגת החומרים המזינים ואת קצב הצמיחה; לצמחים יש תמיסה עשירה בחומרים מזינים הנספגת בקלות על ידי שורשיהם. השיטה הנוכחית מתאימה לחוקרים המעוניינים למפות בפירוט את תכונות מערכת השורשים של הצמח, במיוחד במהלך ההתפתחות המוקדמת (10-15 ימים לאחר הנביטה). הוא מתאים למערכות שורשים קטנות, צמחי מודל כמו ארבידופסיס וטבק, וצמחים לא קונבנציונליים כמו אלפלפה עד שמערכת השורשים שלהם נכנסת לקופסאות המג'נטה.
השלבים לניתוח פנוטיפי של התפתחות RSA בארבידופסיס מתוארים בפרוטוקול זה כדלקמן: (1) שיטת עיקור פני השטח של זרעים לצמחים (Arabidopsis), (2) השלבים להקמת המערכת ההידרופונית, ולאחר מכן זריעת זרעים על מדיום, (3) הליך הוצאת הזריעה המלאה והתפשטות על צלחת פטרי לניתוח RSA, (4) כיצד להקליט את התמונות עבור RSA, ו-(5) לחשב פרמטרים חשובים של RSA באמצעות תוכנת ImageJ.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Arabidospsis thaliana (Col 0)</td>
			<td>Lehle Seeds</td>
			<td>WT-02</td>
			<td>Columbia (Col-0**, no markers)*</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Art brushes</td>
			<td>Amazon or any other vendor</td>
			<td></td>
			<td>Water color round brush size no. 14 (8 mm), 16 (9.5 mm), 18 (12 mm), and 20 (14.2 mm)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Automated Microscope with digital camera</td>
			<td>Leica Microsystems</td>
			<td></td>
			<td>LAS version 4.12.0, Leica Microsystems</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Imaging Software</td>
			<td>ImageJ</td>
			<td></td>
			<td>ImageJ V 
			&#160;1.8.0</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magenta box GA-7</td>
			<td>Fisher Scientific&#160;</td>
			<td>50-255-176</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Medicago sativa</td>
			<td>Johnny&#39;s Seeds</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri-plate (150 mm x 15 mm)</td>
			<td>USA Scientific</td>
			<td>8609-0215</td>
			<td>150 mm x 15 mm PS Petri Dish (https://www.usascientific.com)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Photo camera</td>
			<td>Cannon or Nikon</td>
			<td></td>
			<td>Any high mega pixel (atleast 12 mega pixel per inch) camera on macro mode</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plant-Agar</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A3301</td>
			<td>Agargel&#160; Suitable for plant tissue culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polycarbonate Sheets</td>
			<td>Amazon</td>
			<td></td>
			<td>1 mm&#160; thick</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polypropylene Mesh</td>
			<td>Amazon</td>
			<td></td>
			<td>Pore size 250 &#181;m, 500 &#181;m and 1000 &#181;m</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scanner</td>
			<td>Epson</td>
			<td></td>
			<td>Epson Perfection V700 Photo (Scan at 600 dpi)</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a simple protocol for mapping the plant root system architecture traits

ידע מקיף בפיתוח ארכיטקטורת מערכת שורשי צמחים (RSA) הוא קריטי לשיפור יעילות השימוש בחומרים מזינים ולהגברת סבילות זני היבול לאתגרים סביבתיים. פרוטוקול ניסויי מוצג להקמת המערכת ההידרופונית, גידול צמחים, התפשטות RSA והדמיה. הגישה השתמשה במערכת הידרופונית מבוססת קופסת מגנטה המכילה רשת פוליפרופילן הנתמכת על ידי טריזי פוליקרבונט. הגדרות ניסוי מודגמות על ידי הערכת RSA של הצמחים תחת אספקת חומרים מזינים משתנים (פוספט [Pi]). המערכת הוקמה כדי לבחון את RSA של Arabidopsis, אבל זה בקלות להסתגל לחקור צמחים אחרים כמו Medicago sativa (אספסת). צמחי Arabidopsis thaliana (Col-0) משמשים במחקר זה כדוגמה להבנת הצמח RSA. זרעים מעוקרים על פני השטח על ידי טיפול באתנול ואקונומיקה מסחרית מדוללת, ונשמרים בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס לריבוד. הזרעים מונבטים וגדלים על מדיום נוזלי של חצי MS על רשת פוליפרופילן הנתמכת על ידי טריזי פוליקרבונט. העציצים גדלים בתנאי גידול סטנדרטיים למספר הימים הרצוי, נקטפים בעדינות מהרשת ושקועים בצלחות אגר המכילות מים. כל מערכת שורשים של הצמחים נפרסת בעדינות על צלחת מלאה במים בעזרת מברשת אמנות עגולה. לוחות פטרי אלה מצולמים או נסרקים ברזולוציה גבוהה כדי לתעד את תכונות ה-RSA. תכונות השורש, כגון שורש ראשוני, שורשים רוחביים ואזור הסתעפות, נמדדות באמצעות תוכנת ImageJ הזמינה באופן חופשי. מחקר זה מספק טכניקות למדידת מאפייני שורשי צמחים בסביבות סביבתיות מבוקרות. אנו דנים כיצד (1) לגדל את הצמחים, לאסוף ולהפיץ דגימות שורש, (2) להשיג תמונות של דגימות RSA מפוזרות, (3) ללכוד את התמונות, ו-(4) להשתמש בתוכנה לניתוח תמונות כדי לכמת תכונות שורש. יתרונה של השיטה הנוכחית הוא המדידה הרבגונית, הקלה והיעילה של תכונות ה-RSA.

התכונות המורפומטריות השונות של ארכיטקטורת מערכת שורשים (RSA) נמדדות באמצעות כלי מעבדה פשוטים, והשלבים מתוארים באופן סכמטי באיור 1. פרטי המערך ההידרופוני מדגימים את הפוטנציאל של הפרוטוקול במדידת RSA (איור 1 ואיור 2).
בהתחשב בהבדלי...

Watch this Scientific Journal Video about A Simple Protocol for Mapping the Plant Root System Architecture Traits at JoVE.com

A Simple Protocol for Mapping the Plant Root System Architecture Traits

אנו משתמשים בכלי מעבדה פשוטים כדי לבחון את ארכיטקטורת מערכת השורשים (RSA) של Arabidopsis ו- Medicago. העציצים גדלים באופן הידרופוני על גבי רשת ומפוזרים באמצעות מברשת אמנותית כדי לחשוף את ה-RSA. התמונות מצולמות באמצעות סריקה או מצלמה ברזולוציה גבוהה, ולאחר מכן מנותחות באמצעות ImageJ כדי למפות תכונות.

פרוטוקול פשוט למיפוי תכונות ארכיטקטורת מערכת שורש הצמח

Comprehensive knowledge of plant root system architecture (RSA) development is critical for improving nutrient use efficiency and increasing crop cultivar ...

זוהי שיטה הידרופונית לא פולשנית למדידת ארכיטקטורת מערכת השורשים באמצעות ציוד מעבדה שגרתי. פרוטוקול זה מאפשר הדמיה מלאה של כל מערכת השורשים של הצמח על ידי פיזור ידני שלה. אחד היתרונות העיקריים של ניתוח RSA הוא שהוא מאפשר ללמוד את מערכת שורשי הצמח ללא צורך אשר יכול להציג זיהום יסוד לא רצוי.שיטה זו יכולה לתעד את האינטראקציה הסביבתית הישירה כולל הורמונים, חומרים מזינים ותנאי אקלים עם RSA של מערכות צמחים. התחילו את עיקור פני השטח של זרעי Arabidopsis על ידי השריית כף מדידה זעירה של כ-100 זרעים במים מזוקקים בטמפרטורת החדר. לאחר 30 דקות, צנטריפוגה קצרה של הזרעים ב 500 G למשך חמש שניות באמצעות צנטריפוגה שולחנית.לאחר מכן, decant את המים, ולהוסיף 700 מיקרוליטר של 70% אתנול לפני מערבול הצינור במשך כמה שניות. צנטריפוגו שוב את הזרעים. במידת הצורך, חזור על מערבולות וצנטריפוגה, וודא כי טיפול 70% אתנול לא יעלה על שלוש דקות.לאחר שלוש דקות, מיד לשטוף את הזרעים עם מים סטריליים. לאחר מכן, טפלו בזרעים באמצעות אקונומיקה מסחרית מדוללת המכילה טיפה של TWEEN 20 למשך שבע דקות. מערבבים את הזרעים עם תמיסת אקונומיקה על ידי היפוך הצינורות במהירות שמונה עד 12 פעמים.לאחר צנטריפוגה קצרה, רוקנו את הסופרנאטנט באמצעות פיפטה של מיליליטר אחד, ושטפו את הזרעים לפחות חמש פעמים במים סטריליים, לאחר אותו הליך מערבול. השאירו את הזרעים המעוקרים על פני השטח במים, ודגרו עליהם במשך יומיים-שלושה בארבע מעלות צלזיוס לריבוד. Autoclave קופסת מגנטה סטנדרטית מלאה למחצה במים מזוקקים.חתכו את יריעת הפוליקרבונט האוטוקלאבית למלבנים בגודל ארבעה על שמונה סנטימטרים עם נקודת אמצע מחורצת יותר ממחצית הדרך של המלבן, כך ששני מלבנים יוכלו להתברג יחד ליצירת צורת X. השתמש במערך זה כדי להחזיק את רשת הפוליפרופילן בגודל נקבוביות בגודל 250 מיקרומטר חתוכה לריבועים בגודל שישה על שישה סנטימטרים. בארון זרימת האוויר הלמינרי, הוסיפו חצי מדיה בסיסית סטרילית של MS עם ויטמינים בתוספת 1.5% סוכרוז לכל קופסה כדי להגיע לקצה התחתון של רשת הפוליפרופילן.זרעו את הזרעים המעוקרים על פני השטח על הרשת באופן הידרופוני, וגדלו אותם במשך שלושה ימים. לאחר שלושה ימים, מעבירים את השתילים לרשת בגודל נקבוביות של 500 מיקרומטר, ומאפשרים להם לגדול במשך יומיים. לאחר מכן, העבירו את השתילים לאמצעי הבקרה ולמדיה הניסיונית, ותנו לזרעים לגדול במשך שבעה ימים.הוסף 10 עד 20 מיליליטר של מי ברז מסוננים autoclaved לצלחת Petri. מוציאים בעדינות את השתילים מהרשת של 500 מיקרומטר. בעזרת מברשת אומנות עגולה, מורחים שורשים דמויי צמחים בצלחת המלאה במים וטובלים אותם במים.הטו מעט את הצלחת כדי להסיר את המים. סרקו או צלמו את לוחות הפטרי הללו בהתאם. מדוד את ארכיטקטורת מערכת הבסיס, או תכונות RSA, באמצעות תוכנת ImageJ הזמינה באופן חופשי, ולאחר מכן פתח את הקובץ לניתוח.לאחר קביעת קנה המידה, השתמשו בכלי קו ישר ליצירת בחירת קו המתווה את סרגל קנה המידה. סיים חלוקה לרמות על-ידי לחיצה באמצעות לחצן העכבר הימני, לחיצה כפולה או לחיצה בתיבה בהתחלה. כדי למדוד את אורך סרגל קנה המידה הידוע בפיקסלים, לחץ על נתח ולאחר מכן על מדידה בסרגל הכלים.רשום לעצמך את אורך הפיקסלים. פתח את תיבת הדו-שיח הגדרת קנה מידה על-ידי לחיצה על הכרטיסיה הגדרת קנה מידה בכרטיסיה ניתוח. בדוק את אורך הפיקסלים במרחק בשדה פיקסלים.לאחר מכן, הזן את ערך סרגל קנה המידה בשדה המרחק הידוע והגדר את יחידת האורך כמילימטרים. נעל את קנה המידה עבור תמונה מסוימת זו על ידי לחיצה על אישור. השתמש בכלי קו מקוטע לבחירת שורה המתווה את אורך השורש.לאחר סיום חלוקה לרמות, התאם את בחירת הקו על-ידי לחיצה וגרירה של נקודות האחיזה הקטנות בשחור-לבן לאורך המתאר. תחת כרטיסיית הניתוח של ImageJ, בחר בפקודת המדידה וכמת את אורך השורש. העבר את הנתונים הנמדדים לגיליון אלקטרוני על ידי לחיצה ימנית על חלון התוצאות, בחירה באפשרות העתק הכל מהתפריט הקופץ, מעבר לגיליון האלקטרוני והדבקת הנתונים.למדידה וחישוב של תכונות RSA, מדדו את אורך השורש הראשוני בין צומת ההיפוקוטיל לסוף קצות השורש. לאחר מכן מדדו את השורשים הרוחביים מסדר ראשון, או אורך LR מדרגה אחת, ושורשים רוחביים מסדר שני, או אורך LR בשתי מעלות. לאחר שתסיים, העתק והדבק את כל המדידות לתוך הגיליון האלקטרוני.מדוד ורשום את אזור ההסתעפות של השורש הראשוני, או BZPR, המשתרע על פני נקודת היציאה הצידית הראשונה של השורש הצידי עד לנקודת היציאה האחרונה של השורש הצידי. באופן דומה, רשום את מספר השורשים הרוחביים שמקורם בגבול ה- BZPR. לאחר מכן, למדוד את האורך הממוצע של שורשים לרוחב מסדר ראשון גבוה יותר.גוזרים את האורך הממוצע של השורשים הצדיים הראשוניים על ידי חלוקת האורך הכולל של השורשים הצדיים הראשוניים במספר הכולל של שורשים רוחביים ראשוניים. לאחר מכן כדי למדוד את האורך הממוצע של השורשים הרוחביים מסדר שני, חשב את האורך הממוצע של השורשים הרוחביים המשניים על ידי חלוקת האורך הכולל של השורשים הרוחביים המשניים במספר הכולל של שורשים רוחביים משניים. מדוד את צפיפות השורש הצידי הראשוני על ידי חלוקת מספר השורשים הרוחביים הראשוניים באורך ה- BZPR.לאחר מכן, מדדו את אזור ההסתעפות של שורשים צדדיים בודדים וחשבו את צפיפות השורשים הצידיים המשניים על ידי חלוקת מספר השורשים הצדיים המשניים באורך אזורי ההסתעפות של אורכי שורשים רוחביים מסדר שני. לאחר שתסיים, מדוד את אורך השורש הכולל, או TRL. זהו המצרף של שורשים ראשוניים ואורכי שורשים רוחביים ראשוניים ומשניים.המערכת ההידרופונית ששימשה בניסוי זה פעלה היטב, ומשקפת את הפנוטיפ המנוגד לכאורה בתנאים של מחסור בפוספט אנאורגני ובתנאים מספיקים. תכונות RSA שונות נותחו תחת משטרי פוספט אנאורגניים מנוגדים בתנאים הידרופוניים. הטיפול במחסור בפוספט אנאורגני עורר פנוטיפ שורש המציג RSA קצר יותר, רדוד יותר ומסועף פחות, בהשוואה למצב הפוספט האי-אורגני.אורך השורש הראשוני נחלש משמעותית במצב של מחסור בפוספט אנאורגני. עלייה משמעותית ומהירה באורך השורש הראשוני בנוכחות פוספט אנאורגני 1.25 מילימולרי או אמצעי בקרה הצביעה על יעילות המערכת ההידרופונית, ושיקפה את השינויים הפיזיולוגיים כראוי. אזור ההסתעפות צומצם משמעותית במצב של מחסור בפוספט אנאורגני.אורכו הממוצע של השורש הצידי הראשוני הופחת משמעותית במצב של חוסר פאי. אורך השורש המשני הצדדי הממוצע הופחת באופן דומה עקב מצב המחסור בפוספט, אולם הוא היה נמוך יותר בכמות מאורך השורש הצידי הראשוני הממוצע. מספר השורשים הצדיים הראשוניים והמשניים ירד מאוד במצב של מחסור בפוספט, בהשוואה לקבוצת הביקורת, 1.25 מילימולר במצב פוספט אנאורגני.צפיפות השורש הצידית הראשונית לא השתנתה במצב של מחסור בפוספט, יחסית לתנאי הביקורת, 1.25 מילימולר פוספט אנאורגני. צפיפות השורשים הצידית המשנית לא הראתה שינוי משמעותי, דבר המצביע על חשיבותה של צפיפות השורשים הצידית להשגת תובנה לגבי פלסטיות RSA. הוצאתי בעדינות שתילים מהרשת בעזרת פינצטה.אני מורחת שורשים בפלטה מלאה במים בעזרת מברשת עגולה, את כל השורשים הראשוניים, ומורחת ישר, פורשת שורשים רוחביים בצורה סימטרית, מורחת שורשים רוחביים מסדר שני המחוברים לשורשים רוחביים מסדר ראשון. שיטה דומה ניתן להשתמש כדי לחשב את שטח פיח של קצות צמח Arabidopsis. ניתן לפזר את עלי Arabidopsis על הצלחת השנייה ולאחר מכן ללכוד תמונה ולנתח באמצעות תוכנת ImageJ הזמינה באופן חופשי כדי לקבוע את אזור הפיח.פרוטוקול זה יכול לשמש כדי לענות על כל שאלה לגבי השפעת הסביבה על פלסטיות מערכת השורש.

Research

JoVE Journal

Biology

A Protocol for the Identification of Protein-protein Interactions Based on 15N Metabolic Labeling, Immunoprecipitation, Quantitative Mass Spectrometry and Affinity Modulation

A Protocol for the Identification of Protein-protein Interactions Based on 15N Metabolic Labeling, Immunoprecipitation, Quantitative Mass Spectrometry and Affinity Modulation

פרוטוקול לזיהוי של אינטראקציות בין חלבונים על הסמך<sup&gt; 15</sup&gt; תיוג N מטבולית, immunoprecipitation, כמותית המונית ספקטרומטריית וזיקת ​​אפנון

Protein-protein interactions are fundamental for many biological processes in the cell. Therefore, their characterization plays an important role in ...

A Simple Protocol for Extracting Hemocytes from Wild Caterpillars

פרוטוקול פשוט לחילוץ Hemocytes מזחלי Wild

Insect hemocytes (equivalent to mammalian white blood cells) play an important role in several physiological processes throughout an insect's life cycle ...

An Efficient Method for Quantitative, Single-cell Analysis of Chromatin Modification and Nuclear Architecture in Whole-mount Ovules in Arabidopsis

An Efficient Method for Quantitative, Single-cell Analysis of Chromatin Modification and Nuclear Architecture in Whole-mount Ovules in Arabidopsis

שיטה יעילה לניתוח כמותי, תא בודד של הכרומטין שינוי ואדריכלות גרעינית בהר שלם-ביציות ב<em&gt; ארבידופסיס</em

In flowering plants, the somatic-to-reproductive cell fate transition is marked by the specification of spore mother cells (SMCs) in floral organs of the ...

Lateral Root Inducible System in Arabidopsis and Maize

Lateral Root Inducible System in Arabidopsis and Maize

מערכת עין מתנהל שורש לרוחב ב<em&gt; ארבידופסיס</em&gt; ותירס

Lateral root development contributes significantly to the root system, and hence is crucial for plant growth. The study of lateral root initiation is ...

Imaging Spatial Reorganization of a MAPK Signaling Pathway Using the Tobacco Transient Expression System

הדמית ארגון מחדש מרחבית של מסלול איתות MAPK שימוש במערכת הביטוי החולפת הטבק

Visualization of dynamic signaling events in live cells has been a challenge. We expanded an established transient expression system, the biomolecular ...

Plant Promoter Analysis: Identification and Characterization of Root Nodule Specific Promoter in the Common Bean

מי קולחין יזם: זיהוי ואפיון של השורש גולה יזם ספציפי בתוך השעועית נפוצות

The upstream sequences of gene coding sequences are termed as promoter sequences. Studying the expression patterns of promoters are very significant in ...

A Simple High Efficiency Protocol for Pancreatic Islet Isolation from Mice

פרוטוקול פשוט יעילות גבוהה לבידוד איון הלבלב של עכברים

Pancreatic islets, also called the Islets of Langerhans, are a cluster of endocrine cells which produces hormones for glucose regulation and other ...

A Labor-saving and Repeatable Touch-force Signaling Mutant Screen Protocol for the Study of Thigmomorphogenesis of a Model Plant Arabidopsis thaliana

A Labor-saving and Repeatable Touch-force Signaling Mutant Screen Protocol for the Study of Thigmomorphogenesis of a Model Plant Arabidopsis thaliana

שמירת עבודה והמשך המגע הכוח איתות פרוטוקול המסך מוטציה למחקר של Thigmomorphogenesis של צמח המודל Arabidopsis thaliana

Plants responding to both intracellular and extracellular mechanical stimulations (or force signals) and develop special morphological changes, a called ...

Dry Root Rot Disease Assays in Chickpea: a Detailed Methodology

שורש יבש רוט רוט מחלה אומר חומוס: מתודולוגיה מפורטת

Dry root rot (DRR) disease is an emerging biotic stress threat to chickpea cultivation around the world. It is caused by a soil-borne fungal pathogen, ...

Preparing and Rearing Axenic Insects with Tissue Cultured Seedlings for Host-Gut Microbiota Interaction Studies of the Leaf Beetle

הכנה וגידול של חרקים אקסניים עם שתילים מתרבית רקמה למחקרי אינטראקציה של מיקרוביוטה של המעי המארח של חיפושית העלים

Insect guts are colonized by diverse bacteria that can profoundly impact the host&#39;s physiological traits. Introducing a particular bacterial strain ...