Name: a simple protocol for mapping the plant root system architecture traits
Uploaded: 2023-02-10T13:10:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about A Simple Protocol for Mapping the Plant Root System Architecture Traits at JoVE.com

Riconosciamo il Dipartimento dell'Agricoltura degli Stati Uniti (sovvenzione 58-6406-1-017) per aver sostenuto questa ricerca. Riconosciamo anche il WKU Biotechnology Centre, Western Kentucky University, Bowling Green, KY, USA, e il direttore, CSIR Central Institute of Medicinal and Aromatic Plants, Lucknow, India, per aver fornito le strutture e il supporto dello strumento (comunicazione manoscritta CSIR CIMAP n. CIMAP / PUB / 2022/103). SS riconosce il sostegno finanziario della Saint Joseph's University, Philadelphia, USA.

L'intero protocollo è riassunto schematicamente nella Figura 1, mostrando tutti i passaggi essenziali coinvolti nella rivelazione dell'architettura del sistema di root (RSA) delle piantine. I passaggi del protocollo sono riportati in dettaglio di seguito:
1. Sterilizzazione della superficie dei semi di Arabidopsis
<ol><li>Trasferire un piccolo misurino (circa 100 semi = circa 2,5 mg) di semi in un tubo di microfuge e immergere per 30 minuti in ...

<ol>
	<li>Shukla, D., Rinehart, C. A., Sahi, S. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comprehensive+study+of+excess+phosphate+response+reveals+ethylene+mediated+signaling+that+negatively+regulates+plant+growth+and+development.">Comprehensive study of excess phosphate response reveals ethylene mediated signaling that negatively regulates plant growth and development.</a> Scientific Reports. 7 (1), 3074 (2017).</li><li>Rell&#225;n-&#193;lvarez, R., Lobet, G., Dinneny, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Environmental+control+of+root+system+biology.">Environmental control of root system biology.</a> Annual Review of Plant Biology. 67, 619-642 (2016).</li><li>Gruber, B. D., Giehl, R. F. H., Friedel, S., von Wir&#233;n, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Plasticity+of+the+Arabidopsis+root+system+under+nutrient+deficiencies.">Plasticity of the Arabidopsis root system under nutrient deficiencies.</a> Plant Physiology. 163 (1), 161-179 (2013).</li><li>Shukla, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome-wide+expression+analysis+reveals+contrasting+regulation+of+phosphate+starvation+response+(PSR)+in+root+and+shoot+of+Arabidopsis+and+its+association+with+biotic+stress.">Genome-wide expression analysis reveals contrasting regulation of phosphate starvation response (PSR) in root and shoot of Arabidopsis and its association with biotic stress.</a> Environmental and Experimental Botany. , 188 (2021).</li><li>Robbins 2nd, ., E, N., Dinneny, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Growth+is+required+for+perception+of+water+availability+to+pattern+root+branches+in+plants.">Growth is required for perception of water availability to pattern root branches in plants.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 115 (4), E822-E831 (2018).</li><li>Linkohr, B. I., Williamson, L. C., Fitter, A. H., Leyser, H. M. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nitrate+and+phosphate+availability+and+distribution+have+different+effects+on+root+system+architecture+of+Arabidopsis.">Nitrate and phosphate availability and distribution have different effects on root system architecture of Arabidopsis.</a> The Plant Journal. 29 (6), 751-760 (2002).</li><li>Lynch, J. P., Brown, K. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Topsoil+foraging:+an+architectural+adaptation+of+plants+to+low+phosphorus+availability.">Topsoil foraging: an architectural adaptation of plants to low phosphorus availability.</a> Plant and Soil. 237 (2), 225-237 (2001).</li><li>L&#243;pez-Bucio, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phosphate+availability+alters+architecture+and+causes+changes+in+hormone+sensitivity+in+the+Arabidopsis+root+system.">Phosphate availability alters architecture and causes changes in hormone sensitivity in the Arabidopsis root system.</a> Plant Physiology. 129 (1), 244-256 (2002).</li><li>Jain, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differential+effects+of+sucrose+and+auxin+on+localized+phosphate+deficiency-induced+modulation+of+different+traits+of+root+system+architecture+in+Arabidopsis.">Differential effects of sucrose and auxin on localized phosphate deficiency-induced modulation of different traits of root system architecture in Arabidopsis.</a> Plant Physiology. 144 (1), 232-247 (2007).</li><li>Jain, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Variations+in+the+composition+of+gelling+agents+affect+morphophysiological+and+molecular+responses+to+deficiencies+of+phosphate+and+other+nutrients.">Variations in the composition of gelling agents affect morphophysiological and molecular responses to deficiencies of phosphate and other nutrients.</a> Plant Physiology. 150 (2), 1033-1049 (2009).</li><li>Jain, A., Sinilal, B., Dhandapani, G., Meagher, R. B., Sahi, S. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+deficiency+and+excess+of+zinc+on+morphophysiological+traits+and+spatiotemporal+regulation+of+zinc-responsive+genes+reveal+incidence+of+cross+talk+between+micro-+and+macronutrients.">Effects of deficiency and excess of zinc on morphophysiological traits and spatiotemporal regulation of zinc-responsive genes reveal incidence of cross talk between micro- and macronutrients.</a> Environmental Science and Technology. 47 (10), 5327-5335 (2013).</li><li>Jain, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Role+of+Fe-responsive+genes+in+bioreduction+and+transport+of+ionic+gold+to+roots+of+Arabidopsis+thaliana+during+synthesis+of+gold+nanoparticles.">Role of Fe-responsive genes in bioreduction and transport of ionic gold to roots of Arabidopsis thaliana during synthesis of gold nanoparticles.</a> Plant Physiology and Biochemistry. 84, 189-196 (2014).</li><li>Williamson, L. C., Ribrioux, S. P., Fitter, A. H., Leyser, H. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phosphate+availability+regulates+root+system+architecture+in+Arabidopsis.">Phosphate availability regulates root system architecture in Arabidopsis.</a> Plant Physiology. 126 (2), 875-882 (2001).</li><li>Yang, T. J. W., Lin, W. D., Schmidt, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transcriptional+profiling+of+the+Arabidopsis+iron+deficiency+response+reveals+conserved+transition+metal+homeostasis+networks.">Transcriptional profiling of the Arabidopsis iron deficiency response reveals conserved transition metal homeostasis networks.</a> Plant Physiology. 152 (4), 2130 (2010).</li><li>Kobae, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Zinc+transporter+of+Arabidopsis+thaliana+AtMTP1+is+localized+to+vacuolar+membranes+and+implicated+in+zinc+homeostasis.">Zinc transporter of Arabidopsis thaliana AtMTP1 is localized to vacuolar membranes and implicated in zinc homeostasis.</a> Plant Cell and Physiology. 45 (12), (2004).</li><li>Al-Ghazi, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Temporal+responses+of+Arabidopsis+root+architecture+to+phosphate+starvation:+evidence+for+the+involvement+of+auxin+signalling.">Temporal responses of Arabidopsis root architecture to phosphate starvation: evidence for the involvement of auxin signalling.</a> Plant, Cell and Environment. 26 (7), 1053-1066 (2003).</li><li>S, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> National Institutes of Health. , 1997-2007 (1997).</li><li>Dubrovsky, J. G., Forde, B. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+analysis+of+lateral+root+development:+pitfalls+and+how+to+avoid+them.">Quantitative analysis of lateral root development: pitfalls and how to avoid them.</a> The Plant Cell. 24 (1), 4-14 (2012).</li><li>Weeks, J. T., Ye, J., Rommens, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+an+in+planta+method+for+transformation+of+Alfalfa+(Medicago+sativa).">Development of an in planta method for transformation of Alfalfa (Medicago sativa).</a> Transgenic Research. 17 (4), 587-597 (2008).</li><li>Shukla, D., Krishnamurthy, S., Sahi, S. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microarray+analysis+of+Arabidopsis+under+gold+exposure+to+identify+putative+genes+involved+in+the+synthesis+of+gold+nanoparticles+(AuNPs).Genomics+Data.">Microarray analysis of Arabidopsis under gold exposure to identify putative genes involved in the synthesis of gold nanoparticles (AuNPs).Genomics Data.</a> 3, 100-102 (2015).</li></ol>

Questo lavoro ha dimostrato la mappatura di RSA utilizzando semplici apparecchiature di laboratorio. Utilizzando questo metodo, le alterazioni fenotipiche vengono registrate a livello raffinato. Il vantaggio di questa strategia è che la porzione di germoglio non entra mai in contatto con i media, quindi il fenotipo delle piantine è originale. Questo metodo prevede la creazione di un sistema idroponico per coltivare le piantine come descritto nel protocollo. Quindi, ogni piantina viene estratta intatta e posta su una pi...

L'architettura del sistema radicale (RSA), che è sotterranea, è un organo vitale per la crescita e la produttività delle piante 1,2,3. Dopo lo stadio embrionale, le piante subiscono i loro cambiamenti morfologici più significativi. Il modo in cui le radici crescono nel terreno influisce notevolmente sulla crescita delle parti delle piante fuori terra. La crescita delle radici è il primo passo nella germinazione. È un tratto informativo in quanto risponde in modo univoco ai diversi nutrienti disponibili 1,2,3,4. L'RSA presenta un alto grado di plasticità dello sviluppo, il che significa che l'ambiente viene sempre utilizzato per prendere decisioni sullo sviluppo 2,5. I cambiamenti nell'ambiente hanno reso la produzione agricola più difficile nello scenario attuale. Su base continuativa, la RSA incorpora i segnali ambientali nelle scelte di sviluppo5. Di conseguenza, una conoscenza approfondita dei principi alla base dello sviluppo delle radici è essenziale per imparare come le piante rispondono ai cambiamenti ambientali 2,5.
L'RSA rileva concentrazioni variabili di nutrienti e rende alterazioni fenotipiche 4,6,7,8,9,10,11,12. Gli studi suggeriscono che la morfologia delle radici/RSA è altamente plastica rispetto alla morfologia del germoglio 1,3. La mappatura dei tratti RSA è altamente efficace nel registrare l'effetto del cambiamento dell'ambiente circostante del suolo 1,11,12.
In generale, discrepanze nell'effetto di varie carenze nutrizionali sul fenotipo radicale sono state riportate in molti studi precedenti 3,11,13,14,15. Ad esempio, ci sono diversi rapporti contrastanti sui cambiamenti indotti dalla fame di fosfato (Pi) nel numero, nella lunghezza e nella densità delle radici laterali (LR). Un aumento della densità di LR è stato riportato nella condizione di deficit di Pi 6,8. Al contrario, una diminuzione della densità di LR in condizioni di carenza di Pi greco è stata riportata anche da altri autori 3,13,16. Una delle cause principali di queste incongruenze è l'uso del mezzo gelificante soggetto a contaminazione elementare, che l'agar spesso contiene10. I ricercatori in genere coltivano le loro piante sperimentali su un sistema di piastre a base di agar e registrano i tratti delle radici. Numerosi tratti RSA sono spesso nascosti o trincerati all'interno del materiale agar e non possono essere documentati. Gli esperimenti legati all'induzione di carenza di nutrienti, in cui gli utenti spesso escludono totalmente un componente dal mezzo, non possono essere eseguiti in un mezzo gelificante soggetto a contaminazione elementare11,14,15. Numerosi nutrienti sono frequentemente presenti in quantità significative nei mezzi agar, tra cui P, Zn, Fe e molti altri11,14,15. Inoltre, la crescita dell'RSA è più lenta nei terreni a base di agar rispetto ai mezzi liquidi non a base di agar. Di conseguenza, è necessario stabilire un approccio alternativo non basato su agar per quantificare e registrare qualitativamente il fenotipo di RSA. Di conseguenza, è stato sviluppato il metodo attuale, in cui le piantine vengono allevate in un sistema idroponico a base di scatola magenta in cima a una rete di polipropilene supportata da cunei in policarbonato 1,10,11.
Questo studio presenta una versione improvvisata dettagliata del metodo precedente descritto da Jain et al.10. Questa strategia è stata messa a punto per le attuali esigenze della biologia delle radici delle piante e può essere utilizzata anche per piante come l'erba medica, diverse dalle piante modello. Il protocollo è il modo principale per misurare i cambiamenti in RSA e richiede solo apparecchiature semplici. Il presente protocollo illustra come fenotipizzare diverse caratteristiche della radice, come le radici primarie e laterali in mezzo normale e modificato (deficit di Pi greco). Vengono fornite indicazioni passo-passo e altri suggerimenti utili raccolti dalle esperienze dell'autore per aiutare i ricercatori a seguire le metodologie offerte in questo metodo. Il presente studio mira a fornire un metodo semplice ed efficace per rivelare l'intero apparato radicale delle piante, compresi gli LR di ordine superiore. Questo metodo prevede la diffusione manuale del sistema radicale con un pennello rotondo per acquerello, consentendo un controllo preciso sull'esposizione delle radici 1,10,11,12. Non richiede attrezzature costose o software complicati. Questo metodo ha migliorato l'assorbimento dei nutrienti e il tasso di crescita; Le piante hanno una soluzione ricca di sostanze nutritive facilmente assorbita dalle loro radici. Il presente metodo è adatto per i ricercatori che desiderano mappare i tratti del sistema radicale di una pianta in dettaglio, in particolare durante lo sviluppo precoce (10-15 giorni dopo la germinazione). È adatto per piccoli sistemi radicali, piante modello come Arabidopsis e tabacco e piante non convenzionali come l'erba medica fino a quando il loro apparato radicale non si adatta alle scatole magenta.
Le fasi per l'analisi fenotipica dello sviluppo di RSA in Arabidopsis sono descritte in questo protocollo come segue: (1) il metodo di sterilizzazione della superficie del seme per le piante (Arabidopsis), (2) le fasi per impostare il sistema idroponico, seguite dalla semina dei semi su un terreno, (3) procedura per estrarre le piantine complete e spargere sulla piastra di Petri per l'analisi RSA, (4) come registrare le immagini per RSA e (5) calcolare importanti parametri RSA utilizzando il software ImageJ.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Arabidospsis thaliana (Col 0)</td>
			<td>Lehle Seeds</td>
			<td>WT-02</td>
			<td>Columbia (Col-0**, no markers)*</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Art brushes</td>
			<td>Amazon or any other vendor</td>
			<td></td>
			<td>Water color round brush size no. 14 (8 mm), 16 (9.5 mm), 18 (12 mm), and 20 (14.2 mm)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Automated Microscope with digital camera</td>
			<td>Leica Microsystems</td>
			<td></td>
			<td>LAS version 4.12.0, Leica Microsystems</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Imaging Software</td>
			<td>ImageJ</td>
			<td></td>
			<td>ImageJ V 
			&#160;1.8.0</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magenta box GA-7</td>
			<td>Fisher Scientific&#160;</td>
			<td>50-255-176</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Medicago sativa</td>
			<td>Johnny&#39;s Seeds</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri-plate (150 mm x 15 mm)</td>
			<td>USA Scientific</td>
			<td>8609-0215</td>
			<td>150 mm x 15 mm PS Petri Dish (https://www.usascientific.com)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Photo camera</td>
			<td>Cannon or Nikon</td>
			<td></td>
			<td>Any high mega pixel (atleast 12 mega pixel per inch) camera on macro mode</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plant-Agar</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A3301</td>
			<td>Agargel&#160; Suitable for plant tissue culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polycarbonate Sheets</td>
			<td>Amazon</td>
			<td></td>
			<td>1 mm&#160; thick</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polypropylene Mesh</td>
			<td>Amazon</td>
			<td></td>
			<td>Pore size 250 &#181;m, 500 &#181;m and 1000 &#181;m</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scanner</td>
			<td>Epson</td>
			<td></td>
			<td>Epson Perfection V700 Photo (Scan at 600 dpi)</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a simple protocol for mapping the plant root system architecture traits

Una conoscenza completa dello sviluppo dell'architettura del sistema radicale delle piante (RSA) è fondamentale per migliorare l'efficienza nell'uso dei nutrienti e aumentare la tolleranza delle cultivar alle sfide ambientali. Viene presentato un protocollo sperimentale per la configurazione del sistema idroponico, la crescita delle piantine, la diffusione di RSA e l'imaging. L'approccio ha utilizzato un sistema idroponico a base di scatola magenta contenente rete in polipropilene supportata da cunei in policarbonato. Le impostazioni sperimentali sono esemplificate valutando l'RSA delle piantine sotto apporto variabile di nutrienti (fosfato [Pi]). Il sistema è stato istituito per esaminare la RSA di Arabidopsis, ma è facilmente adattabile per studiare altre piante come Medicago sativa (Alfalfa). Le piantine di Arabidopsis thaliana (Col-0) sono utilizzate in questa indagine come esempio per comprendere la pianta RSA. I semi vengono sterilizzati in superficie trattando etanolo e candeggina commerciale diluita e mantenuti a 4 °C per la stratificazione. I semi vengono germinati e coltivati su un mezzo liquido semi-MS su una rete di polipropilene sostenuta da cunei in policarbonato. Le piantine vengono coltivate in condizioni di crescita standard per il numero desiderato di giorni, raccolte delicatamente dalla rete e immerse in piastre di agar contenenti acqua. Ogni apparato radicale delle piantine viene distribuito delicatamente sulla piastra piena d'acqua con l'aiuto di un pennello rotondo. Queste lastre di Petri vengono fotografate o scansionate ad alta risoluzione per documentare i tratti RSA. I tratti radice, come la radice primaria, le radici laterali e la zona di ramificazione, vengono misurati utilizzando il software ImageJ disponibile gratuitamente. Questo studio fornisce tecniche per misurare le caratteristiche delle radici delle piante in ambienti ambientali controllati. Discutiamo su come (1) coltivare le piantine e raccogliere e diffondere campioni di radici, (2) ottenere immagini di campioni RSA diffusi, (3) acquisire le immagini e (4) utilizzare il software di analisi delle immagini per quantificare gli attributi radice. Il vantaggio del presente metodo è la misurazione versatile, facile ed efficiente dei tratti RSA.

I diversi tratti morfometrici dell'architettura del sistema radicale (RSA) sono misurati utilizzando semplici strumenti di laboratorio e i passaggi sono rappresentati schematicamente nella Figura 1. I dettagli della configurazione idroponica dimostrano il potenziale del protocollo nella misurazione dell'RSA (Figura 1 e Figura 2).
Date le differenze osservate negli agenti gelificanti, abbiamo utilizzato un...

Watch this Scientific Journal Video about A Simple Protocol for Mapping the Plant Root System Architecture Traits at JoVE.com

A Simple Protocol for Mapping the Plant Root System Architecture Traits

Utilizziamo semplici strumenti di laboratorio per esaminare l'architettura del sistema di root (RSA) di Arabidopsis e Medicago. Le piantine vengono coltivate idroponicamente su rete e distribuite usando un pennello artistico per rivelare la RSA. Le immagini vengono scattate utilizzando la scansione o una fotocamera ad alta risoluzione, quindi analizzate con ImageJ per mappare i tratti.

Un semplice protocollo per mappare i tratti dell'architettura del sistema di root delle piante

Comprehensive knowledge of plant root system architecture (RSA) development is critical for improving nutrient use efficiency and increasing crop cultivar ...

Questo è un metodo idroponico non invasivo per misurare l'architettura del sistema radicale utilizzando apparecchiature di laboratorio di routine. Questo protocollo consente la visualizzazione completa dell'intero apparato radicale della pianta diffondendolo manualmente. Uno dei principali vantaggi dell'analisi RSA è che consente di studiare il sistema radicale delle piante senza la necessità di introdurre contaminazioni elementari indesiderate.Questo metodo può registrare l'interazione ambientale diretta, comprese le condizioni ormonali, nutritive e climatiche, con l'RSA dei sistemi vegetali. Iniziare la sterilizzazione superficiale dei semi di Arabidopsis immergendo un piccolo misurino di circa 100 semi in acqua distillata a temperatura ambiente. Dopo 30 minuti, centrifugare brevemente i semi a 500 g per cinque secondi utilizzando una centrifuga da tavolo.Quindi, decantare l'acqua e aggiungere 700 microlitri di etanolo al 70% prima di vorticare il tubo per alcuni secondi. Centrifugare nuovamente i semi. Se necessario, ripetere il vortice e la centrifugazione, assicurando che il trattamento con etanolo al 70% non superi i tre minuti.Dopo tre minuti, sciacquare immediatamente i semi con acqua sterile. Quindi, trattare i semi con candeggina commerciale diluita contenente una goccia di TWEEN 20 per sette minuti. Mescolare i semi con una soluzione di candeggina invertendo rapidamente i tubi da otto a 12 volte.Dopo una breve centrifugazione, decantare il surnatante con una pipetta da un millilitro e sciacquare i semi almeno cinque volte con acqua sterile, seguendo la stessa procedura di vortice. Lasciare i semi sterilizzati superficiali in acqua e incubarli per due o tre giorni a quattro gradi Celsius per la stratificazione. Autoclavare la scatola standard magenta riempita per metà con acqua distillata.Tagliare il foglio di policarbonato autoclavato in rettangoli di quattro per otto centimetri con un punto medio dentellato più di metà del rettangolo in modo che due rettangoli possano incastrarsi insieme per formare una forma a X. Utilizzare questa configurazione per tenere la rete in polipropilene di dimensioni dei pori di 250 micrometri tagliata in quadrati di sei per sei centimetri. Nell'armadio del flusso d'aria laminare, aggiungere mezzo mezzo MS basale sterile con vitamine più 1,5% di saccarosio a ciascuna scatola per raggiungere il bordo inferiore della rete in polipropilene.Semina idroponicamente i semi sterilizzati sulla rete e coltivali per tre giorni. Dopo tre giorni, trasferire le piantine su una maglia di 500 micrometri delle dimensioni dei pori e lasciarle crescere per due giorni. Quindi, trasferire le piantine sui mezzi di controllo e sui terreni sperimentali e lasciare crescere i semi per sette giorni.Aggiungere da 10 a 20 millilitri di acqua di rubinetto filtrata in autoclave alla piastra di Petri. Estrarre delicatamente le piantine dalla maglia di 500 micrometri. Con l'aiuto di un pennello artistico rotondo, spargi radici simili a piante nel piatto pieno d'acqua e immergili nell'acqua.Inclinare leggermente la piastra per rimuovere l'acqua. Scansiona o fotografa queste lastre di Petri in modo appropriato. Misurare l'architettura del sistema di root, o tratti RSA, utilizzando il software ImageJ disponibile gratuitamente, quindi aprire il file da analizzare.Dopo aver impostato la scala, usate lo strumento linea retta per creare una selezione di linea che delinei la barra della scala. Completa la struttura facendo clic con il pulsante destro del mouse, facendo doppio clic o facendo clic nella casella all'inizio. Per misurare la lunghezza della barra di scala nota in pixel, fare clic su Analizza, seguito da Misura sulla barra degli strumenti.Prendi nota della lunghezza in pixel. Aprire la finestra di dialogo Imposta scala facendo clic sulla scheda Imposta scala nella scheda Analizza. Controlla la lunghezza dei pixel in lontananza nel campo pixel.Quindi, immettere il valore della barra della scala nel campo Distanza nota e impostare l'unità di lunghezza in millimetri. Blocca la scala per questa particolare immagine facendo clic su OK. Usate lo strumento linea segmentata per una selezione di linee che delinea la lunghezza della radice.Dopo aver completato la struttura, regolate la selezione della linea facendo clic e trascinando le maniglie bianche e nere lungo il contorno. Nella scheda Analizza di ImageJ, selezionare il comando di misura e quantificare la lunghezza della radice. Trasferisci i dati misurati su un foglio di calcolo facendo clic con il pulsante destro del mouse sulla finestra dei risultati, selezionando Copia tutto dal menu a comparsa, passando al foglio di calcolo e incollando i dati.Per la misurazione e il calcolo dei tratti RSA, misurare la lunghezza della radice primaria tra la giunzione ipocotilicica e l'estremità delle punte delle radici. Quindi misurare le radici laterali del primo ordine, o una lunghezza LR di un grado, e le radici laterali del secondo ordine, o una lunghezza di due gradi LR. Una volta fatto, copia e incolla tutte le misurazioni nel foglio di calcolo.Misurare e registrare la zona di ramificazione della radice primaria, o BZPR, che si estende dal primo punto emergente della radice laterale all'ultimo punto emergente della radice laterale. Allo stesso modo, registrare il numero di radici laterali originate all'interno del confine del BZPR. Quindi, misurare la lunghezza media delle radici laterali di primo e ordine superiore.Ricavare la lunghezza media delle radici laterali primarie dividendo la lunghezza totale delle radici laterali primarie per il numero totale di radici laterali primarie. Quindi, per misurare la lunghezza media delle radici laterali del secondo ordine, calcolare la lunghezza media delle radici laterali secondarie dividendo la lunghezza totale delle radici laterali secondarie per il numero totale di radici laterali secondarie. Misurare la densità della radice laterale primaria dividendo il numero di radici laterali primarie per la lunghezza del BZPR.Quindi, misurare la zona di ramificazione delle singole radici laterali e calcolare la densità della radice laterale secondaria dividendo il numero di radici laterali secondarie per la lunghezza delle zone di ramificazione delle lunghezze delle radici laterali di secondo ordine. Una volta fatto, misurare la lunghezza totale della radice, o TRL. Questo è l'aggregato delle radici primarie e delle lunghezze delle radici laterali primarie e secondarie.Il sistema idroponico utilizzato in questo esperimento ha funzionato bene, riflettendo l'apparente fenotipo contrastante in condizioni carenti di fosfato inorganico e sufficienti. Vari tratti RSA sono stati analizzati in regimi di fosfato inorganico contrastanti in condizioni idroponiche. Il trattamento carente di fosfato inorganico ha invocato un fenotipo radicale che mostra un RSA più corto, meno profondo e meno ramificato, rispetto alla condizione sufficiente di fosfato inorganico.La lunghezza della radice primaria è stata significativamente attenuata nella condizione carente di fosfato inorganico. Un guadagno significativo e rapido nella lunghezza della radice primaria in presenza di fosfato inorganico millimolare o mezzi di controllo indicava l'efficienza del sistema idroponico e rifletteva adeguatamente i cambiamenti fisiomorfologici. La zona di ramificazione è stata significativamente ridotta nella condizione carente di fosfato inorganico.La lunghezza media della radice laterale primaria è stata significativamente ridotta nella condizione di deficit di pi greco. La lunghezza media della radice laterale secondaria è stata ridotta in modo simile a causa della condizione carente di fosfato, tuttavia, era inferiore in quantità rispetto alla lunghezza media della radice laterale primaria. Il numero di radici laterali primarie e secondarie è diminuito pesantemente nella condizione carente di fosfato, rispetto alla condizione di fosfato inorganico di controllo, 1,25 millimolari.La densità primaria della radice laterale non è stata modificata nella condizione di carenza di fosfato, rispetto alla condizione di fosfato inorganico di controllo, 1,25 millimolari. La densità della radice laterale secondaria non ha mostrato alcun cambiamento significativo, indicando l'importanza della densità della radice laterale per ottenere informazioni sulla plasticità RSA. Ho rimosso delicatamente le piantine dalla rete usando una pinzetta.Spargo le radici in un piatto pieno d'acqua usando un pennello rotondo, tutte le radici primarie, e lo stendo dritto, stendo simmetricamente le radici laterali, stendo le radici laterali del secondo ordine collegate alle radici laterali del primo ordine. Un metodo simile può essere utilizzato per calcolare l'area di fuliggine delle punte delle piante di Arabidopsis. Le foglie di Arabidopsis possono essere distribuite sull'altra piastra seguite dall'acquisizione e dall'analisi delle immagini utilizzando il software ImageJ disponibile gratuitamente per determinare l'area di fuliggine.Questo protocollo può essere utilizzato per rispondere a qualsiasi domanda sull'influenza dell'ambiente sulla plasticità del sistema di root.

Research

JoVE Journal

Biology

A Protocol for the Identification of Protein-protein Interactions Based on 15N Metabolic Labeling, Immunoprecipitation, Quantitative Mass Spectrometry and Affinity Modulation

A Protocol for the Identification of Protein-protein Interactions Based on 15N Metabolic Labeling, Immunoprecipitation, Quantitative Mass Spectrometry and Affinity Modulation

Un protocollo per l&#39;identificazione di interazioni proteina-proteina Sulla base di<sup&gt; 15</sup&gt; N marcatura metabolica, immunoprecipitazione, Spettrometria di massa quantitativa e di affinità di modulazione

Protein-protein interactions are fundamental for many biological processes in the cell. Therefore, their characterization plays an important role in ...

Ricerca

Biologia

A Simple Protocol for Extracting Hemocytes from Wild Caterpillars

Un protocollo semplice per Estrazione emociti da bruchi selvaggi

Insect hemocytes (equivalent to mammalian white blood cells) play an important role in several physiological processes throughout an insect's life cycle ...

An Efficient Method for Quantitative, Single-cell Analysis of Chromatin Modification and Nuclear Architecture in Whole-mount Ovules in Arabidopsis

An Efficient Method for Quantitative, Single-cell Analysis of Chromatin Modification and Nuclear Architecture in Whole-mount Ovules in Arabidopsis

Un metodo efficiente per quantitativa, analisi singola cella della cromatina Cambiamento e architettura nucleare in tutto il montaggio Ovuli in<em&gt; Arabidopsis</em

In flowering plants, the somatic-to-reproductive cell fate transition is marked by the specification of spore mother cells (SMCs) in floral organs of the ...

Lateral Root Inducible System in Arabidopsis and Maize

Lateral Root Inducible System in Arabidopsis and Maize

Laterale Root inducibile di sistema in<em&gt; Arabidopsis</em&gt; E mais

Lateral root development contributes significantly to the root system, and hence is crucial for plant growth. The study of lateral root initiation is ...

Imaging Spatial Reorganization of a MAPK Signaling Pathway Using the Tobacco Transient Expression System

Imaging Riorganizzazione spaziale di una via di segnalazione MAPK Utilizzando il sistema transitorio Expression Tabacco

Visualization of dynamic signaling events in live cells has been a challenge. We expanded an established transient expression system, the biomolecular ...

Plant Promoter Analysis: Identification and Characterization of Root Nodule Specific Promoter in the Common Bean

Analisi del promotore di pianta: Identificazione e caratterizzazione di radice nodulo specifico promotore nel fagiolo comune

The upstream sequences of gene coding sequences are termed as promoter sequences. Studying the expression patterns of promoters are very significant in ...

A Simple High Efficiency Protocol for Pancreatic Islet Isolation from Mice

Un semplice protocollo ad alta efficienza per l'isolamento delle isolozioni pancreatiche dai topi

Pancreatic islets, also called the Islets of Langerhans, are a cluster of endocrine cells which produces hormones for glucose regulation and other ...

A Labor-saving and Repeatable Touch-force Signaling Mutant Screen Protocol for the Study of Thigmomorphogenesis of a Model Plant Arabidopsis thaliana

A Labor-saving and Repeatable Touch-force Signaling Mutant Screen Protocol for the Study of Thigmomorphogenesis of a Model Plant Arabidopsis thaliana

Un protocollo dello schermo mutante di segnalazione della forza di manodopera e ripetibile per lo studio della Thigmomorphogenesis di un modello di arabidopsis thaliana

Plants responding to both intracellular and extracellular mechanical stimulations (or force signals) and develop special morphological changes, a called ...

Dry Root Rot Disease Assays in Chickpea: a Detailed Methodology

Test della malattia del marciume delle radici secche nei ceci: una metodologia dettagliata

Dry root rot (DRR) disease is an emerging biotic stress threat to chickpea cultivation around the world. It is caused by a soil-borne fungal pathogen, ...

Preparing and Rearing Axenic Insects with Tissue Cultured Seedlings for Host-Gut Microbiota Interaction Studies of the Leaf Beetle

Preparazione e allevamento di insetti axenici con piantine coltivate su tessuto per studi di interazione microbiota ospite-intestino dello scarabeo fogliare

Insect guts are colonized by diverse bacteria that can profoundly impact the host&#39;s physiological traits. Introducing a particular bacterial strain ...