Name: a simple protocol for mapping the plant root system architecture traits
Uploaded: 2023-02-10T13:10:00
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Agradecemos ao Departamento de Agricultura dos EUA (Grant 58-6406-1-017) pelo apoio a esta pesquisa. Também agradecemos ao WKU Biotechnology Centre, Western Kentucky University, Bowling Green, KY, EUA, e ao Diretor do CSIR Central Institute of Medicinal and Aromatic Plants, Lucknow, Índia, por fornecer as instalações e o suporte do instrumento (CSIR CIMAP manuscript communication no. CIMAP/PUB/2022/103). A SS agradece o apoio financeiro da Saint Joseph's University, Filadélfia, EUA.

Todo o protocolo está resumido esquematicamente na Figura 1, mostrando todas as etapas essenciais envolvidas na revelação da arquitetura do sistema radicular (ASR) das plântulas. As etapas do protocolo são dadas em detalhes abaixo:
1. Esterilização da superfície das sementes de Arabidopsis
<ol><li>Transfira uma colher minúscula (aproximadamente 100 sementes = aproximadamente 2,5 mg) de sementes para um tubo de microfuga e deixe de molho...

<ol>
	<li>Shukla, D., Rinehart, C. A., Sahi, S. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comprehensive+study+of+excess+phosphate+response+reveals+ethylene+mediated+signaling+that+negatively+regulates+plant+growth+and+development.">Comprehensive study of excess phosphate response reveals ethylene mediated signaling that negatively regulates plant growth and development.</a> Scientific Reports. 7 (1), 3074 (2017).</li><li>Rell&#225;n-&#193;lvarez, R., Lobet, G., Dinneny, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Environmental+control+of+root+system+biology.">Environmental control of root system biology.</a> Annual Review of Plant Biology. 67, 619-642 (2016).</li><li>Gruber, B. D., Giehl, R. F. H., Friedel, S., von Wir&#233;n, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Plasticity+of+the+Arabidopsis+root+system+under+nutrient+deficiencies.">Plasticity of the Arabidopsis root system under nutrient deficiencies.</a> Plant Physiology. 163 (1), 161-179 (2013).</li><li>Shukla, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome-wide+expression+analysis+reveals+contrasting+regulation+of+phosphate+starvation+response+(PSR)+in+root+and+shoot+of+Arabidopsis+and+its+association+with+biotic+stress.">Genome-wide expression analysis reveals contrasting regulation of phosphate starvation response (PSR) in root and shoot of Arabidopsis and its association with biotic stress.</a> Environmental and Experimental Botany. , 188 (2021).</li><li>Robbins 2nd, ., E, N., Dinneny, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Growth+is+required+for+perception+of+water+availability+to+pattern+root+branches+in+plants.">Growth is required for perception of water availability to pattern root branches in plants.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 115 (4), E822-E831 (2018).</li><li>Linkohr, B. I., Williamson, L. C., Fitter, A. H., Leyser, H. M. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nitrate+and+phosphate+availability+and+distribution+have+different+effects+on+root+system+architecture+of+Arabidopsis.">Nitrate and phosphate availability and distribution have different effects on root system architecture of Arabidopsis.</a> The Plant Journal. 29 (6), 751-760 (2002).</li><li>Lynch, J. P., Brown, K. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Topsoil+foraging:+an+architectural+adaptation+of+plants+to+low+phosphorus+availability.">Topsoil foraging: an architectural adaptation of plants to low phosphorus availability.</a> Plant and Soil. 237 (2), 225-237 (2001).</li><li>L&#243;pez-Bucio, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phosphate+availability+alters+architecture+and+causes+changes+in+hormone+sensitivity+in+the+Arabidopsis+root+system.">Phosphate availability alters architecture and causes changes in hormone sensitivity in the Arabidopsis root system.</a> Plant Physiology. 129 (1), 244-256 (2002).</li><li>Jain, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differential+effects+of+sucrose+and+auxin+on+localized+phosphate+deficiency-induced+modulation+of+different+traits+of+root+system+architecture+in+Arabidopsis.">Differential effects of sucrose and auxin on localized phosphate deficiency-induced modulation of different traits of root system architecture in Arabidopsis.</a> Plant Physiology. 144 (1), 232-247 (2007).</li><li>Jain, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Variations+in+the+composition+of+gelling+agents+affect+morphophysiological+and+molecular+responses+to+deficiencies+of+phosphate+and+other+nutrients.">Variations in the composition of gelling agents affect morphophysiological and molecular responses to deficiencies of phosphate and other nutrients.</a> Plant Physiology. 150 (2), 1033-1049 (2009).</li><li>Jain, A., Sinilal, B., Dhandapani, G., Meagher, R. B., Sahi, S. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+deficiency+and+excess+of+zinc+on+morphophysiological+traits+and+spatiotemporal+regulation+of+zinc-responsive+genes+reveal+incidence+of+cross+talk+between+micro-+and+macronutrients.">Effects of deficiency and excess of zinc on morphophysiological traits and spatiotemporal regulation of zinc-responsive genes reveal incidence of cross talk between micro- and macronutrients.</a> Environmental Science and Technology. 47 (10), 5327-5335 (2013).</li><li>Jain, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Role+of+Fe-responsive+genes+in+bioreduction+and+transport+of+ionic+gold+to+roots+of+Arabidopsis+thaliana+during+synthesis+of+gold+nanoparticles.">Role of Fe-responsive genes in bioreduction and transport of ionic gold to roots of Arabidopsis thaliana during synthesis of gold nanoparticles.</a> Plant Physiology and Biochemistry. 84, 189-196 (2014).</li><li>Williamson, L. C., Ribrioux, S. P., Fitter, A. H., Leyser, H. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phosphate+availability+regulates+root+system+architecture+in+Arabidopsis.">Phosphate availability regulates root system architecture in Arabidopsis.</a> Plant Physiology. 126 (2), 875-882 (2001).</li><li>Yang, T. J. W., Lin, W. D., Schmidt, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transcriptional+profiling+of+the+Arabidopsis+iron+deficiency+response+reveals+conserved+transition+metal+homeostasis+networks.">Transcriptional profiling of the Arabidopsis iron deficiency response reveals conserved transition metal homeostasis networks.</a> Plant Physiology. 152 (4), 2130 (2010).</li><li>Kobae, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Zinc+transporter+of+Arabidopsis+thaliana+AtMTP1+is+localized+to+vacuolar+membranes+and+implicated+in+zinc+homeostasis.">Zinc transporter of Arabidopsis thaliana AtMTP1 is localized to vacuolar membranes and implicated in zinc homeostasis.</a> Plant Cell and Physiology. 45 (12), (2004).</li><li>Al-Ghazi, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Temporal+responses+of+Arabidopsis+root+architecture+to+phosphate+starvation:+evidence+for+the+involvement+of+auxin+signalling.">Temporal responses of Arabidopsis root architecture to phosphate starvation: evidence for the involvement of auxin signalling.</a> Plant, Cell and Environment. 26 (7), 1053-1066 (2003).</li><li>S, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> National Institutes of Health. , 1997-2007 (1997).</li><li>Dubrovsky, J. G., Forde, B. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+analysis+of+lateral+root+development:+pitfalls+and+how+to+avoid+them.">Quantitative analysis of lateral root development: pitfalls and how to avoid them.</a> The Plant Cell. 24 (1), 4-14 (2012).</li><li>Weeks, J. T., Ye, J., Rommens, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+an+in+planta+method+for+transformation+of+Alfalfa+(Medicago+sativa).">Development of an in planta method for transformation of Alfalfa (Medicago sativa).</a> Transgenic Research. 17 (4), 587-597 (2008).</li><li>Shukla, D., Krishnamurthy, S., Sahi, S. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microarray+analysis+of+Arabidopsis+under+gold+exposure+to+identify+putative+genes+involved+in+the+synthesis+of+gold+nanoparticles+(AuNPs).Genomics+Data.">Microarray analysis of Arabidopsis under gold exposure to identify putative genes involved in the synthesis of gold nanoparticles (AuNPs).Genomics Data.</a> 3, 100-102 (2015).</li></ol>

Este trabalho demonstrou o mapeamento da ASR utilizando equipamentos laboratoriais simples. Usando este método, as alterações fenotípicas são registradas no nível refinado. O benefício dessa estratégia é que a parte aérea nunca entra em contato com a mídia, de modo que o fenótipo das plântulas é original. Este método envolve a criação de um sistema hidropônico para o cultivo de plântulas, conforme descrito no protocolo. Em seguida, cada plântula é retirada intacta e colocada em uma placa de Petri che...

A arquitetura do sistema radicular (ASR), que é subterrânea, é um órgão vital para o crescimento e produtividade das plantas 1,2,3. Após o estágio embrionário, as plantas sofrem suas alterações morfológicas mais significativas. A maneira como as raízes crescem no solo afeta muito o crescimento das partes das plantas acima do solo. O crescimento radicular é o primeiro passo para a germinação. É uma característica informativa, pois responde de forma única aos diferentes nutrientes disponíveis 1,2,3,4. A ASR apresenta alto grau de plasticidade desenvolvimental, o que significa que o ambiente é sempre utilizado para tomar decisões sobre o desenvolvimento 2,5. As mudanças no ambiente têm dificultado a produção agrícola no cenário atual. De forma contínua, a ASR incorpora sinais ambientais nas escolhas de desenvolvimento5. Como resultado, uma compreensão completa dos princípios por trás do desenvolvimento radicular é essencial para aprender como as plantas respondem às mudanças em ambientes 2,5.
A ASR detecta concentrações variáveis de nutrientes e produz alterações fenotípicas 4,6,7,8,9,10,11,12. Estudos sugerem que a morfologia radicular/ASR é altamente plástica em comparação com a morfologia da parteaérea1,3. O mapeamento das características da ASR é altamente eficaz no registro do efeito da alteração do ambiente do solo circundante 1,11,12.
Em geral, discrepâncias no efeito de várias deficiências de nutrientes sobre o fenótipo radicular foram relatadas em muitos estudos anteriores 3,11,13,14,15. Por exemplo, há vários relatos contrastantes sobre mudanças induzidas pela fome de fosfato (Pi) no número, comprimento e densidade das raízes laterais (RLs). Um aumento na densidade de RV tem sido relatado sob a condição de deficiência de Pi 6,8. Em contraste, uma diminuição na densidade de RV em condições deficientes de Pi também foi relatada por outros autores 3,13,16. Uma das causas proeminentes dessas inconsistências é o uso do meio gelificante propenso à contaminação elementar, que o ágar geralmente contém10. Os pesquisadores normalmente cultivam suas plantas experimentais em um sistema de placas à base de ágar e registram as características radiculares. Numerosas características da ASR são frequentemente ocultadas ou entrincheiradas dentro do material de ágar e não podem ser documentadas. Experimentos ligados à indução de deficiência de nutrientes, nos quais os usuários frequentemente excluem totalmente um componente do meio, não podem ser realizados em meios gelificantes propensos à contaminação elementar11,14,15. Numerosos nutrientes estão frequentemente presentes em quantidades significativas no meio ágar, incluindo P, Zn, Fe e muitos outros11,14,15. Além disso, o crescimento da ASR é mais lento em meios à base de ágar do que em meios líquidos não baseados em ágar. Como resultado, há necessidade de estabelecer uma abordagem alternativa não baseada em ágar para quantificar e registrar qualitativamente o fenótipo da ASR. Consequentemente, o método atual tem sido desenvolvido, no qual as plântulas são levantadas em um sistema hidropônico à base de caixa magenta sobre uma tela de polipropileno suportada por cunhas de policarbonato 1,10,11.
Este estudo apresenta uma versão improvisada detalhada do método anterior descrito por Jain et al.10. Esta estratégia foi ajustada para as demandas atuais em biologia radicular de plantas e também pode ser usada para plantas como a alfafa, além de plantas modelo. O protocolo é a principal forma de medir as mudanças na ASR, e requer apenas equipamentos simples. O presente protocolo ilustra como fenotipar diversas características radiculares, como raízes primárias e laterais em meio normal e modificado (Pi deficiente). Instruções passo a passo e outras dicas úteis colhidas das experiências do autor são fornecidas para ajudar os pesquisadores a seguir as metodologias oferecidas neste método. O presente estudo tem como objetivo fornecer um método simples e eficaz para revelar todo o sistema radicular das plantas, incluindo as LRs de ordem superior. Este método consiste em espalhar manualmente o sistema radicular com um pincel redondo em aquarela, permitindo um controle preciso sobre a exposição das raízes 1,10,11,12. Não requer equipamentos caros ou softwares complicados. Este método melhorou a absorção de nutrientes e a taxa de crescimento; As plantas têm uma solução rica em nutrientes facilmente absorvida por suas raízes. O presente método é adequado para pesquisadores que desejam mapear detalhadamente as características do sistema radicular de uma planta, particularmente durante o desenvolvimento inicial (10-15 dias após a germinação). É adequado para pequenos sistemas radiculares, plantas modelo como Arabidopsis e tabaco, e plantas não convencionais como alfafa até que seu sistema radicular caiba nas caixas magenta.
As etapas para a análise fenotípica do desenvolvimento da ASR em Arabidopsis são descritas neste protocolo da seguinte forma: (1) o método de esterilização da superfície das sementes para plantas (Arabidopsis), (2) as etapas para a instalação do sistema hidropônico, seguido da semeadura das sementes em um meio, (3) o procedimento para retirar as plântulas completas e espalhar na placa de Petri para análise da ASR, (4) como gravar as imagens para RSA e (5) calcular parâmetros importantes de RSA usando o software ImageJ.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Arabidospsis thaliana (Col 0)</td>
			<td>Lehle Seeds</td>
			<td>WT-02</td>
			<td>Columbia (Col-0**, no markers)*</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Art brushes</td>
			<td>Amazon or any other vendor</td>
			<td></td>
			<td>Water color round brush size no. 14 (8 mm), 16 (9.5 mm), 18 (12 mm), and 20 (14.2 mm)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Automated Microscope with digital camera</td>
			<td>Leica Microsystems</td>
			<td></td>
			<td>LAS version 4.12.0, Leica Microsystems</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Imaging Software</td>
			<td>ImageJ</td>
			<td></td>
			<td>ImageJ V 
			&#160;1.8.0</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magenta box GA-7</td>
			<td>Fisher Scientific&#160;</td>
			<td>50-255-176</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Medicago sativa</td>
			<td>Johnny&#39;s Seeds</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri-plate (150 mm x 15 mm)</td>
			<td>USA Scientific</td>
			<td>8609-0215</td>
			<td>150 mm x 15 mm PS Petri Dish (https://www.usascientific.com)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Photo camera</td>
			<td>Cannon or Nikon</td>
			<td></td>
			<td>Any high mega pixel (atleast 12 mega pixel per inch) camera on macro mode</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plant-Agar</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A3301</td>
			<td>Agargel&#160; Suitable for plant tissue culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polycarbonate Sheets</td>
			<td>Amazon</td>
			<td></td>
			<td>1 mm&#160; thick</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polypropylene Mesh</td>
			<td>Amazon</td>
			<td></td>
			<td>Pore size 250 &#181;m, 500 &#181;m and 1000 &#181;m</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scanner</td>
			<td>Epson</td>
			<td></td>
			<td>Epson Perfection V700 Photo (Scan at 600 dpi)</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a simple protocol for mapping the plant root system architecture traits

O conhecimento abrangente do desenvolvimento da arquitetura do sistema radicular das plantas (RSA) é fundamental para melhorar a eficiência do uso de nutrientes e aumentar a tolerância das cultivares aos desafios ambientais. Um protocolo experimental é apresentado para a montagem do sistema hidropônico, crescimento de plântulas, disseminação da ASR e obtenção de imagens. A abordagem utilizou um sistema hidropônico à base de caixa magenta contendo tela de polipropileno suportada por cunhas de policarbonato. Os cenários experimentais são exemplificados pela avaliação da ASR das plântulas sob oferta variável de nutrientes (fosfato [Pi]). O sistema foi estabelecido para examinar a ASR de Arabidopsis, mas é facilmente adaptável para estudar outras plantas como Medicago sativa (Alfafa). As plântulas de Arabidopsis thaliana (Col-0) são utilizadas nesta investigação como exemplo para o entendimento da planta RSA. As sementes são esterilizadas superficialmente por tratamento com etanol e água sanitária comercial diluída e mantidas a 4 °C para estratificação. As sementes são germinadas e cultivadas em meio líquido semi-MS sobre tela de polipropileno suportada por cunhas de policarbonato. As plântulas são cultivadas sob condições padrão de crescimento para o número desejado de dias, delicadamente retiradas da malha e submersas em placas de ágar contendo água. Cada sistema radicular das plântulas é espalhado suavemente na placa cheia de água com a ajuda de um pincel de arte redondo. Essas placas de Petri são fotografadas ou digitalizadas em alta resolução para documentar as características da RSA. As características radiculares, como raiz primária, raízes laterais e zona de ramificação, são medidas usando o software ImageJ disponível gratuitamente. Este estudo fornece técnicas para medir as características radiculares de plantas em ambientes controlados. Nós discutimos como (1) cultivar as plântulas, coletar e espalhar amostras de raízes, (2) obter fotos de amostras de RSA espalhadas, (3) capturar as imagens e (4) usar software de análise de imagens para quantificar atributos radiculares. A vantagem do presente método é a medição versátil, fácil e eficiente das características da ASR.

As diferentes características morfométricas da arquitetura do sistema radicular (ASR) são medidas usando ferramentas laboratoriais simples, e os passos são representados esquematicamente na Figura 1. Os detalhes do arranjo hidropônico demonstram o potencial do protocolo na mensuração da ASR (Figura 1 e Figura 2).
Dadas as diferenças observadas nos gelificantes, utilizamos um sistema hidropônico d...

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A Simple Protocol for Mapping the Plant Root System Architecture Traits

Usamos ferramentas laboratoriais simples para examinar a arquitetura do sistema radicular (RSA) de Arabidopsis e Medicago. As plântulas são cultivadas hidroponicamente sobre malha e espalhadas usando um pincel de arte para revelar a RSA. As imagens são tiradas usando digitalização ou uma câmera de alta resolução e, em seguida, analisadas com o ImageJ para mapear traços.

Um Protocolo Simples para Mapear as Características da Arquitetura do Sistema Radicular da Planta

Comprehensive knowledge of plant root system architecture (RSA) development is critical for improving nutrient use efficiency and increasing crop cultivar ...

Este é um método hidropônico não invasivo para medir a arquitetura do sistema radicular usando equipamentos de laboratório de rotina. Este protocolo permite a visualização completa de todo o sistema radicular da planta, espalhando-o manualmente. Uma das principais vantagens da análise de RSA é que ela permite estudar o sistema radicular das plantas sem a necessidade de introduzir contaminação elementar indesejada.Este método pode registrar a interação ambiental direta, incluindo condições hormonais, de nutrientes e climáticas com a ASR dos sistemas vegetais. Comece a esterilização superficial das sementes de Arabidopsis mergulhando uma pequena colher de aproximadamente 100 sementes em água destilada à temperatura ambiente. Após 30 minutos, centrifugar brevemente as sementes a 500 G por cinco segundos usando uma centrífuga de mesa.Em seguida, decantar a água e adicionar 700 microlitros de etanol a 70% antes de agitar o tubo por alguns segundos. Centrifugar as sementes novamente. Se necessário, repita o vórtice e a centrifugação, garantindo que o tratamento com etanol a 70% não exceda três minutos.Após três minutos, enxaguar imediatamente as sementes com água estéril. Em seguida, tratar as sementes com água sanitária comercial diluída contendo uma gota de TWEEN 20 por sete minutos. Misture as sementes com solução de água sanitária invertendo os tubos rapidamente oito a 12 vezes.Após uma breve centrifugação, decantar o sobrenadante com uma pipeta de um mililitro e enxaguar as sementes pelo menos cinco vezes com água estéril, seguindo o mesmo procedimento de vórtice. Deixe as sementes esterilizadas na superfície em água e incube-as por dois a três dias a quatro graus Celsius para estratificação. Autoclave a caixa magenta padrão meio cheia de água destilada.Corte a folha de policarbonato autoclavada em retângulos de quatro por oito centímetros com um entalhe médio mais da metade do retângulo para que dois retângulos possam se encaixar para formar uma forma de X. Use esta configuração para segurar a malha de polipropileno de tamanho de poro de 250 micrômetros cortada em quadrados de seis por seis centímetros. No gabinete de fluxo de ar laminar, adicione meio basal MS estéril com vitaminas mais 1,5% de sacarose a cada caixa para alcançar a borda inferior da tela de polipropileno.Semear hidroponicamente as sementes esterilizadas na superfície e cultivá-las por três dias. Após três dias, transfira as mudas para uma malha de poros de 500 micrômetros e deixe crescer por dois dias. Em seguida, transferir as mudas para o meio controle e para o meio experimental, e deixar as sementes crescerem por sete dias.Adicione de 10 a 20 mililitros de água filtrada autoclavada à placa de Petri. Retire suavemente as mudas da malha de 500 micrômetros. Com a ajuda de um pincel de arte redondo, espalhe raízes semelhantes a plantas no prato cheio de água e submerja-as em água.Incline levemente a placa para retirar a água. Digitalize ou fotografe essas placas de Petri adequadamente. Meça a arquitetura do sistema raiz, ou características RSA, usando o software ImageJ disponível gratuitamente e, em seguida, abra o arquivo a ser analisado.Depois de definir a escala, use a ferramenta de linha reta para criar uma seleção de linha que contorne a barra de escala. Conclua a estrutura de tópicos clicando com o botão direito, clicando duas vezes ou clicando na caixa no início. Para medir o comprimento da barra de escala conhecida em pixels, clique em analisar, seguido de medir na barra de ferramentas.Anote o comprimento do pixel. Abra a caixa de diálogo Definir escala clicando na guia Definir escala na guia Analisar. Verifique o comprimento do pixel no campo de distância em pixels.Em seguida, insira o valor da barra de escala no campo de distância conhecida e defina a unidade de comprimento como milímetros. Bloqueie a escala para esta imagem específica clicando em ok. Use a ferramenta de linha segmentada para uma seleção de linha que delineie o comprimento da raiz.Depois de terminar o contorno, ajuste a seleção de linha clicando e arrastando as pequenas alças em preto e branco ao longo do contorno. Na guia analyze do ImageJ, selecione o comando measure e quantifique o comprimento da raiz. Transfira os dados medidos para uma planilha clicando com o botão direito do mouse na janela de resultados, selecionando Copiar tudo no menu pop-up, alternando para a planilha e colando os dados.Para a medição e cálculo das características da ASR, meça o comprimento da raiz primária entre a junção do hipocótilo até a extremidade da ponta da raiz. Em seguida, meça as raízes laterais de primeira ordem, ou comprimento LR de um grau, e raízes laterais de segunda ordem, ou comprimento LR de dois graus. Feito isso, copie e cole todas as medidas na planilha.Meça e registre a zona de ramificação da raiz primária, ou BZPR, que abrange o primeiro ponto emergente da raiz lateral até o último ponto emergente da raiz lateral. Da mesma forma, registre o número de raízes laterais originadas dentro do limite do BZPR. Em seguida, meça o comprimento médio das raízes laterais de primeira e de ordem superior.Derivar o comprimento médio das raízes laterais primárias dividindo o comprimento total das raízes laterais primárias pelo número total de raízes laterais primárias. Em seguida, para medir o comprimento médio das raízes laterais de segunda ordem, calcule o comprimento médio das raízes laterais secundárias dividindo o comprimento total das raízes laterais secundárias pelo número total de raízes laterais secundárias. Medir a densidade da raiz lateral primária dividindo o número de raízes laterais primárias pelo comprimento do BZPR.Em seguida, meça a zona de ramificação de raízes laterais individuais e calcule a densidade de raízes laterais secundárias dividindo o número de raízes laterais secundárias pelo comprimento das zonas de ramificação de comprimentos de raízes laterais de segunda ordem. Uma vez feito, meça o comprimento total da raiz, ou TRL. Este é o agregado de raízes primárias e comprimentos de raízes laterais primárias e secundárias.O sistema hidropônico utilizado neste experimento funcionou bem, refletindo o fenótipo contrastante aparente sob condições deficientes e suficientes de fosfato inorgânico. Várias características da ASR foram analisadas sob regimes contrastantes de fosfato inorgânico em condições hidropônicas. O tratamento deficiente em fosfato inorgânico invocou um fenótipo radicular exibindo uma ASR mais curta, mais rasa e menos ramificada, em comparação com a condição suficiente de fosfato inorgânico.O comprimento da raiz primária foi significativamente atenuado na condição de deficiência de fosfato inorgânico. O ganho significativo e rápido no comprimento primário da raiz na presença de fosfato inorgânico de 1,25 milimolar ou meio controle indicou a eficiência do sistema hidropônico e refletiu adequadamente as alterações fisiomorfológicas. A zona de ramificação foi significativamente reduzida sob a condição deficiente de fosfato inorgânico.O comprimento médio da raiz lateral primária foi significativamente reduzido na condição deficiente em pi. O comprimento médio da raiz lateral secundária foi igualmente reduzido devido à condição deficiente de fosfato, no entanto, foi menor em quantidade do que o comprimento médio da raiz lateral primária. O número de raízes laterais primárias e secundárias diminuiu fortemente sob a condição deficiente em fosfato, em comparação com o controle, condição de fosfato inorgânico de 1,25 milimolar.A densidade radicular lateral primária não foi alterada na condição de fosfato deficiente, em relação ao controle, 1,25 milimolar de fosfato inorgânico. A densidade radicular lateral secundária não apresentou alteração significativa, indicando a importância da densidade radicular lateral para o conhecimento da plasticidade da ASR. Removi suavemente as mudas da malha usando pinças.Espalhei raízes em uma placa cheia de água usando um pincel redondo, todas as raízes primárias, e espalhei reto, espalhei raízes laterais simetricamente, espalhei raízes laterais de segunda ordem ligadas a raízes laterais de primeira ordem. Um método semelhante pode ser usado para calcular a área de fuligem das pontas das plantas de Arabidopsis. As folhas de Arabidopsis podem ser espalhadas na outra placa, seguidas de captura e análise de imagens usando o software ImageJ disponível gratuitamente para determinar a área de fuligem.Este protocolo pode ser utilizado para esclarecer quaisquer dúvidas sobre a influência do ambiente na plasticidade do sistema radicular.

Research

JoVE Journal

Biology

A Protocol for the Identification of Protein-protein Interactions Based on 15N Metabolic Labeling, Immunoprecipitation, Quantitative Mass Spectrometry and Affinity Modulation

A Protocol for the Identification of Protein-protein Interactions Based on 15N Metabolic Labeling, Immunoprecipitation, Quantitative Mass Spectrometry and Affinity Modulation

Um protocolo para a identificação de interações proteína-proteína Baseado<sup&gt; 15</sup&gt; Etiquetagem N Metabólica, imunoprecipitação, Quantitativa Espectrometria de Massa e Affinity Modulação

Protein-protein interactions are fundamental for many biological processes in the cell. Therefore, their characterization plays an important role in ...

Biologia

A Simple Protocol for Extracting Hemocytes from Wild Caterpillars

Um protocolo simples para extrair Hemócitos de Lagartas selvagens

Insect hemocytes (equivalent to mammalian white blood cells) play an important role in several physiological processes throughout an insect's life cycle ...

An Efficient Method for Quantitative, Single-cell Analysis of Chromatin Modification and Nuclear Architecture in Whole-mount Ovules in Arabidopsis

An Efficient Method for Quantitative, Single-cell Analysis of Chromatin Modification and Nuclear Architecture in Whole-mount Ovules in Arabidopsis

Um método eficiente para Quantitativa, Análise de células Único de cromatina Modificação e Arquitetura Nuclear em Todo-mount óvulos em<em&gt; Arabidopsis</em

In flowering plants, the somatic-to-reproductive cell fate transition is marked by the specification of spore mother cells (SMCs) in floral organs of the ...

Lateral Root Inducible System in Arabidopsis and Maize

Lateral Root Inducible System in Arabidopsis and Maize

Sistema induzível de raiz lateral em Arabidopsis e milho

Lateral root development contributes significantly to the root system, and hence is crucial for plant growth. The study of lateral root initiation is ...

Imaging Spatial Reorganization of a MAPK Signaling Pathway Using the Tobacco Transient Expression System

Imagiologia reorganização espacial de uma via de sinalização MAPK Utilizar o sistema de expressão transitória do Tabaco

Visualization of dynamic signaling events in live cells has been a challenge. We expanded an established transient expression system, the biomolecular ...

Plant Promoter Analysis: Identification and Characterization of Root Nodule Specific Promoter in the Common Bean

Análise do promotor de planta: Identificação e caracterização de raiz nódulo promotor específico no feijão comum

The upstream sequences of gene coding sequences are termed as promoter sequences. Studying the expression patterns of promoters are very significant in ...

A Simple High Efficiency Protocol for Pancreatic Islet Isolation from Mice

Um protocolo de alta eficiência simples para isolamento de Islet pancreático de camundongos

Pancreatic islets, also called the Islets of Langerhans, are a cluster of endocrine cells which produces hormones for glucose regulation and other ...

A Labor-saving and Repeatable Touch-force Signaling Mutant Screen Protocol for the Study of Thigmomorphogenesis of a Model Plant Arabidopsis thaliana

A Labor-saving and Repeatable Touch-force Signaling Mutant Screen Protocol for the Study of Thigmomorphogenesis of a Model Plant Arabidopsis thaliana

Um trabalho-economia e repetível Touch-Force sinalização mutante Screen Protocol para o estudo de Thigmomorphogenesis de uma planta modelo Arabidopsis Arabidopsis thaliana

Plants responding to both intracellular and extracellular mechanical stimulations (or force signals) and develop special morphological changes, a called ...

Dry Root Rot Disease Assays in Chickpea: a Detailed Methodology

Ensaios da doença de podridão de raízes secas no grão-de-bico: uma metodologia detalhada

Dry root rot (DRR) disease is an emerging biotic stress threat to chickpea cultivation around the world. It is caused by a soil-borne fungal pathogen, ...

Preparing and Rearing Axenic Insects with Tissue Cultured Seedlings for Host-Gut Microbiota Interaction Studies of the Leaf Beetle

Preparando e criando insetos axeônicos com mudas cultivadas de tecido para estudos de interação microbiota hospedeiro-intestinal do besouro-folha

Insect guts are colonized by diverse bacteria that can profoundly impact the host&#39;s physiological traits. Introducing a particular bacterial strain ...