Name: generation and culturing of high-grade serous ovarian cancer patient-derived organoids
Uploaded: 2023-01-06T14:50:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Generation and Culturing of High-Grade Serous Ovarian Cancer Patient-Derived Organoids at JoVE.com

نحن ممتنون لتوجيهات رون بوس ، دكتوراه في الطب ، دكتوراه ، ومساعدة باربرا بلاشوت ، دكتوراه في الطب ، في إنشاء هذا البروتوكول. نود أيضا أن نعرب عن تقديرنا لكلية الطب بجامعة واشنطن في قسم أمراض النساء والتوليد في سانت لويس وقسم الأورام النسائية ، وبرنامج الباحث العلمي بجامعة واشنطن ، وبرنامج تطوير علماء الإنجاب لدعمهم لهذا المشروع.

تم الحصول على جميع عينات الأنسجة البشرية التي تم جمعها للبحث وفقا للبروتوكول المعتمد من مجلس المراجعة المؤسسية (IRB). تم تنفيذ البروتوكولات الموضحة أدناه في بيئة زراعة الأنسجة البشرية المعقمة. تم الحصول على موافقة خطية مستنيرة من البشر. يجب أن يكون لدى المرضى المؤهلين تشخيص أو تشخيص مفترض ل...

<ol>
	<li>Bray, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Global+cancer+statistics+2018:+GLOBOCAN+estimates+of+incidence+and+mortality+worldwide+for+36+cancers+in+185+countries.">Global cancer statistics 2018: GLOBOCAN estimates of incidence and mortality worldwide for 36 cancers in 185 countries.</a> CA: A Cancer Journal for Clinicians. 68 (6), 394-424 (2018).</li><li>Drost, J., Clevers, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Organoids+in+cancer+research.">Organoids in cancer research.</a> Nature Reviews Cancer. 18 (7), 407-418 (2018).</li><li>Pauli, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Personalized+in+vitro+and+in+vivo+cancer+models+to+guide+precision+medicine.">Personalized in vitro and in vivo cancer models to guide precision medicine.</a> Cancer Discovery. 7 (5), 462-477 (2017).</li><li>Fujii, E., Kato, A., Suzuki, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Patient-derived+xenograft+(PDX)+models:+Characteristics+and+points+to+consider+for+the+process+of+establishment.">Patient-derived xenograft (PDX) models: Characteristics and points to consider for the process of establishment.</a> Journal of Toxicologic Pathology. 33 (3), 153-160 (2020).</li><li>Yang, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Application+of+ovarian+cancer+organoids+in+precision+medicine:+Key+challenges+and+current+opportunities.">Application of ovarian cancer organoids in precision medicine: Key challenges and current opportunities.</a> Frontiers in Cell and Developmental Biology. 9, 701429 (2021).</li><li>Yang, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Patient-derived+organoids:+A+promising+model+for+personalized+cancer+treatment.">Patient-derived organoids: A promising model for personalized cancer treatment.</a> Gastroenterology Report. 6 (4), 243-245 (2018).</li><li>Karakasheva, T. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+and+characterization+of+patient-derived+head+and+neck,+oral,+and+esophageal+cancer+organoids.">Generation and characterization of patient-derived head and neck, oral, and esophageal cancer organoids.</a> Current Protocols in Stem Cell Biology. 53 (1), 109 (2020).</li><li>Madison, B. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Let-7+represses+carcinogenesis+and+a+stem+cell+phenotype+in+the+intestine+via+regulation+of+Hmga2.">Let-7 represses carcinogenesis and a stem cell phenotype in the intestine via regulation of Hmga2.</a> PLoS Genetics. 11 (8), 1005408 (2015).</li><li>Sato, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single+Lgr5+stem+cells+build+crypt-villus+structures+in+vitro+without+a+mesenchymal+niche.">Single Lgr5 stem cells build crypt-villus structures in vitro without a mesenchymal niche.</a> Nature. 459 (7244), 262-265 (2009).</li><li>Murray, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=HER2+and+APC+mutations+promote+altered+crypt-villus+morphology+and+marked+hyperplasia+in+the+intestinal+epithelium.">HER2 and APC mutations promote altered crypt-villus morphology and marked hyperplasia in the intestinal epithelium.</a> Cellular and Molecular Gastroenterology and Hepatology. 12 (3), 1105-1120 (2021).</li><li>Hill, S. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Prediction+of+DNA+repair+inhibitor+response+in+short-term+patient-derived+ovarian+cancer+organoids.">Prediction of DNA repair inhibitor response in short-term patient-derived ovarian cancer organoids.</a> Cancer Discovery. 8 (11), 1404-1421 (2018).</li><li>Passarelli, M. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Leucyl-tRNA+synthetase+is+a+tumour+suppressor+in+breast+cancer+and+regulates+codon-dependent+translation+dynamics.">Leucyl-tRNA synthetase is a tumour suppressor in breast cancer and regulates codon-dependent translation dynamics.</a> Nature Cell Biology. 24 (3), 307-315 (2022).</li><li>Pleguezuelos-Manzano, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Establishment+and+culture+of+human+intestinal+organoids+derived+from+adult+stem+cells.">Establishment and culture of human intestinal organoids derived from adult stem cells.</a> Current Protocols in Immunology. 130 (1), 106 (2020).</li><li>Stumm, M. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Validation+of+a+postfixation+tissue+storage+and+transport+medium+to+preserve+histopathology+and+molecular+pathology+analyses+(total+and+phosphoactivated+proteins,+and+FISH).">Validation of a postfixation tissue storage and transport medium to preserve histopathology and molecular pathology analyses (total and phosphoactivated proteins, and FISH).</a> American Journal of Clinical Pathology. 137 (3), 429-436 (2012).</li><li>Feldman, A. T., Wolfe, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tissue+processing+and+hematoxylin+and+eosin+staining.">Tissue processing and hematoxylin and eosin staining.</a> Methods in Molecular Biology. 1180, 31-43 (2014).</li><li>Ooft, S. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Patient-derived+organoids+can+predict+response+to+chemotherapy+in+metastatic+colorectal+cancer+patients.">Patient-derived organoids can predict response to chemotherapy in metastatic colorectal cancer patients.</a> Science Translational Medicine. 11 (513), (2019).</li><li>Aisenbrey, E. A., Murphy, W. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synthetic+alternatives+to+Matrigel.">Synthetic alternatives to Matrigel.</a> Nature Reviews Materials. 5 (7), 539-551 (2020).</li><li>Nanki, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Patient-derived+ovarian+cancer+organoids+capture+the+genomic+profiles+of+primary+tumours+applicable+for+drug+sensitivity+and+resistance+testing.">Patient-derived ovarian cancer organoids capture the genomic profiles of primary tumours applicable for drug sensitivity and resistance testing.</a> Scientific Reports. 10, 12581 (2020).</li><li>Mead, B. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Screening+for+modulators+of+the+cellular+composition+of+gut+epithelia+via+organoid+models+of+intestinal+stem+cell+differentiation.">Screening for modulators of the cellular composition of gut epithelia via organoid models of intestinal stem cell differentiation.</a> Nature Biomedical Engineering. 6 (4), 476-494 (2022).</li></ol>

سرطان المبيض مميت للغاية بسبب مرحلته المتقدمة في التشخيص ، فضلا عن التطور الشائع لمقاومة العلاج الكيميائي. تم إحراز العديد من التطورات في أبحاث سرطان المبيض من خلال استخدام خطوط الخلايا السرطانية ونماذج PDX. ومع ذلك ، هناك حاجة واضحة لنموذج أكثر تمثيلا وبأسعار معقولة في المختبر . أثبت?...

في عام 2021 ، تم تشخيص ما يقرب من 21,410 امرأة في الولايات المتحدة حديثا بسرطان المبيض الظهاري ، وتوفيت 12,940 امرأة بسبب هذا المرض1. على الرغم من إحراز تقدم كاف في الجراحة والعلاج الكيميائي ، إلا أن أكثر من 70٪ من المرضى الذين يعانون من مرض متقدم يطورون مقاومة العلاج الكيميائي ويموتون في غضون 5 سنوات من التشخيص 2,3. وبالتالي ، هناك حاجة ماسة إلى استراتيجيات جديدة لعلاج هذا المرض الفتاك ونماذج تمثيلية موثوقة للبحوث قبل السريرية.
خطوط الخلايا السرطانية والطعوم الخارجية المشتقة من المريض (PDX) التي تم إنشاؤها من أورام المبيض الأولية هي الأدوات الرئيسية المستخدمة في أبحاث سرطان المبيض. الميزة الرئيسية لخطوط الخلايا السرطانية هي توسعها السريع. ومع ذلك ، فإن ثقافتهم المستمرة تؤدي إلى تغيرات في النمط الظاهري والجيني تتسبب في انحراف خطوط الخلايا السرطانية عن عينة ورم السرطان الأولية الأصلية. نظرا للاختلافات الموجودة بين خط الخلايا السرطانية والورم الرئيسي ، فإن فحوصات الأدوية التي لها تأثيرات إيجابية في خطوط الخلايا تفشل في الحصول على نفس التأثيرات في التجارب السريرية2. للتغلب على هذه القيود ، يتم استخدام نماذج PDX. يتم إنشاء هذه النماذج عن طريق زرع أنسجة سرطان المبيض الطازجة في الفئران التي تعاني من نقص المناعة. كما هي في نماذج الجسم الحي ، فإنها تشبه بدقة الخصائص البيولوجية البشرية ، وبالتالي ، فهي أكثر تنبؤا بنتائج الأدوية. ومع ذلك ، فإن هذه النماذج لها أيضا قيود كبيرة ، بما في ذلك التكلفة والوقت والموارد اللازمة لتوليدها4.
تقدم PDOs نموذجا بديلا للأبحاث قبل السريرية التي تتغلب على قيود كل من خطوط الخلايا السرطانية ونماذج PDX. تلخص PDOs ورم المريض والبيئة المكروية للورم ، وبالتالي توفر نموذجا قابلا للسحب في المختبر مثاليا للبحث قبل السريري2،3،5. تتمتع نماذج 3D هذه بقدرات التنظيم الذاتي التي تصمم الورم الرئيسي ، وهي ميزة لا يمتلكها نظرائهم في خط الخلايا ثنائي الأبعاد (2D). علاوة على ذلك ، فقد ثبت أن هذه النماذج تمثل وراثيا ووظيفيا الأورام الأم ، وبالتالي فهي نماذج موثوقة لدراسة العلاجات الجديدة والعمليات البيولوجية. باختصار ، إنها توفر إمكانات توسع وتخزين طويلة الأجل مماثلة لخطوط الخلايا ولكنها تشمل أيضا البيئة المكروية والتفاعلات بين الخلايا والخلايا المتأصلة في نماذج الماوس 4,6.
يصف البروتوكول الحالي إنشاء PDOs من الأورام المشتقة من المريض ، والاستسقاء ، وعينات السائل الجنبي بمعدل نجاح أعلى من 97٪. يمكن بعد ذلك توسيع مزارع PDO لأجيال متعددة واستخدامها لاختبار حساسية العلاج الدوائي والمؤشرات الحيوية التنبؤية. تمثل هذه الطريقة تقنية يمكن استخدامها لتخصيص العلاجات بناء على الاستجابات العلاجية ل PDOs.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>1% HEPES</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>15630080</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1% Penicillin-Streptomycin</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>30002CI</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1.5 mL Eppendorf Tubes&#160;</td>
			<td>Genesee Scientific</td>
			<td>14125</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10 cm Tissue Culture Dish&#160;</td>
			<td>TPP</td>
			<td>93100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10 mL Serological Pipet</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>100 &#181;m Cell Filter</td>
			<td>MidSci</td>
			<td>100ICS</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>15 mL centrifuge tubes</td>
			<td>Corning</td>
			<td>430052</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2 mL Cryovial</td>
			<td>Simport Scientific</td>
			<td>T301-2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2% Paraformaldehyde Fixative</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>37 &#176;C water bath&#160;</td>
			<td>NEST</td>
			<td>602052</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3dGRO R-Spondin-1 Conditioned Media Supplement</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>SCM104</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>6 well plates</td>
			<td>TPP</td>
			<td>92006</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>70% Ethanol</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>R31541GA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>A83-01</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>SML0788</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Advanced DMEM/F12</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>12634028</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agar</td>
			<td>Lamda Biotech</td>
			<td>C121</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>B-27</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>17504044</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge&#160;</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cultrex Type 2</td>
			<td>R&#38;D Systems</td>
			<td>3533-010-02</td>
			<td>basement membrane extract</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNase I</td>
			<td>New England Bio Labs</td>
			<td>M0303S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNase I Reaction Buffer</td>
			<td>New England Bio Labs</td>
			<td>M0303S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EGF</td>
			<td>PeproTech</td>
			<td>AF-100-15</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FBS&#160;</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>F2442</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FGF-10</td>
			<td>PeproTech</td>
			<td>100-26</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FGF2</td>
			<td>PeproTech</td>
			<td>100-18B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>gentleMACS C Tubes</td>
			<td>Miltenyi BioTech</td>
			<td>130-096-334</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>gentleMACS Octo Dissociator with Heaters</td>
			<td>Miltenyi BioTech</td>
			<td>130-096-427</td>
			<td>We use the manufacturers protocol.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GlutaMAX</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>35050061</td>
			<td>dipeptide, L-alanyl-L-glutamine</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hematoxylin and Eosin Staining Kit</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>NC1470670</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Histoplast Paraffin Wax</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>22900700</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microcentrifuge&#160;</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mr. Frosty Freezing Container</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>07202363S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N-acetylcysteine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A9165</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nicotinamide</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>N0636</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>p1000 Pipette with Tips&#160;</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>p200 Pipette with Tips&#160;</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pasteur Pipettes 9&#34;</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>1367820D</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>MT21031CM</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipet Controller</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Prostaglandin E2</td>
			<td>R&#38;D Systems</td>
			<td>2296</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Puromycin&#160;</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>A1113802</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recombinant Murine Noggin</td>
			<td>PeproTech</td>
			<td>250-38</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recovery Cell Culture Freezing Medium</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>12648010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Red Blood Cell Lysis Buffer</td>
			<td>BioLegend</td>
			<td>420301</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ROCK Inhibitor (Y-27632)</td>
			<td>R&#38;D Systems</td>
			<td>1254/1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SB202190</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S7076</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T75 Flask</td>
			<td>MidSci</td>
			<td>TP90076</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue Culture Hood&#160;</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue Embedding Cassette</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TrypLE Express</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>12604013</td>
			<td>animal origin-free, recombinant enzyme</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Type II Collagenase</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>17101015</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vortex</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

generation and culturing of high-grade serous ovarian cancer patient-derived organoids

Organoids هي نماذج الورم الديناميكي 3D التي يمكن أن تنمو بنجاح من أنسجة ورم المبيض المشتقة من المريض ، أو الاستسقاء ، أو السائل الجنبي وتساعد في اكتشاف علاجات جديدة ومؤشرات حيوية تنبؤية لسرطان المبيض. تلخص هذه النماذج عدم التجانس النسيلي ، والبيئة المكروية للورم ، وتفاعلات الخلايا الخلوية ومصفوفة الخلايا. بالإضافة إلى ذلك ، فقد ثبت أنها تتطابق مع الورم الرئيسي من الناحية الشكلية والخلوية والكيميائية المناعية ووراثيا. وبالتالي ، فإن المواد العضوية تسهل البحث عن الخلايا السرطانية والبيئة المكروية للورم وتتفوق على خطوط الخلايا. يصف البروتوكول الحالي طرقا متميزة لتوليد عضويات سرطان المبيض المشتقة من المريض من أورام المرضى والاستسقاء وعينات السائل الجنبي بمعدل نجاح أعلى من 97٪. يتم فصل عينات المريض إلى معلقات خلوية عن طريق الهضم الميكانيكي والأنزيمي. ثم يتم طلاء الخلايا باستخدام مستخلص الغشاء القاعدي (BME) ويتم دعمها بوسائط نمو محسنة تحتوي على مكملات خاصة بزراعة سرطان المبيض المصلي عالي الدرجة (HGSOC). بعد تشكيل المواد العضوية الأولية ، يمكن ل PDOs الحفاظ على ثقافة طويلة الأجل ، بما في ذلك المرور للتوسع في التجارب اللاحقة.

لتوليد PDOs ، تم هضم العينات ميكانيكيا وإنزيميا في معلقات أحادية الخلية. ثم أعيد تعليق الخلايا في BME واستكملت بوسائط مصممة خصيصا (الشكل 3). عادة ما يتم إنشاء المواد العضوية على مدى إطار زمني مدته 10 أيام ، وبعد ذلك تظهر عضويات منفصلة في الثقافة (الشكل 4).
<p class="jov...

Watch this Scientific Journal Video about Generation and Culturing of High-Grade Serous Ovarian Cancer Patient-Derived Organoids at JoVE.com

Generation and Culturing of High-Grade Serous Ovarian Cancer Patient-Derived Organoids

المواد العضوية المشتقة من المريض (PDO) هي ثقافة ثلاثية الأبعاد (3D) يمكنها تقليد بيئة الورم في المختبر. في سرطان المبيض المصلي عالي الدرجة ، تمثل PDOs نموذجا لدراسة المؤشرات الحيوية والعلاجات الجديدة.

توليد وزراعة المواد العضوية عالية الجودة المشتقة من سرطان المبيض المصلي

Organoids are 3D dynamic tumor models that can be grown successfully from patient-derived ovarian tumor tissue, ascites, or pleural fluid and aid in the ...

تمثل النماذج العضوية التي يقودها المريض وراثيا ووظيفيا الأورام الأم ، وبالتالي فهي نماذج موثوقة لدراسة العلاجات الجديدة والعمليات البيولوجية المعقدة في سرطان المبيض. من خلال تلخيص عدم التجانس النسيلي ، والبيئة المكروية للورم ، والتفاعلات بين الخلايا في المختبر ، تتغلب هذه النماذج على قيود خطوط الخلايا السرطانية والطعوم الخارجية المشتقة من المريض. توفر المواد العضوية المشتقة من المريض قدرات توسع وتخزين طويلة الأجل وتحاكي فسيولوجيا الورم.ونتيجة لذلك ، فهي نماذج مثالية لدراسة العلاجات الجديدة والمؤشرات الحيوية التنبؤية. ابدأ في حصاد المواد العضوية عن طريق وضع عينات الورم في طبق زراعة الأنسجة 10 سم وفرم الأنسجة لإنشاء خليط متجانس باستخدام مشرط يمكن التخلص منه. ضع خليط الأنسجة المتجانسة في أنبوب تفكك باستخدام ملقط.لكل واحد إلى ملليلتر من الأنسجة المتجانسة أضف سبعة إلى ثمانية ملليلتر من ملليغرام واحد لكل ملليلتر من النوع الثاني من محلول كولاجيناز في وسط قاعدة عضوي وملليلتر واحد من محلول DNase One. دوامة الحل في 458 G.Liquefy الأنسجة أثناء وجودها في محلول كولاجيناز باستخدام آلة التفكك. قم بتشغيل البرنامج 37 C شرطة سفلية H شرطة سفلية TDK ثلاث ساعات واحدة حتى يتم تعليق خلية واحدة.بمجرد الانتهاء من ذلك ، انقل الخليط المتجانس إلى أنبوب مخروطي جديد سعة 50 ملليلتر. أضف 20 إلى 40 ملليلتر من الوسط الأساسي العضوي والدوامة المحلول عند 458 جم ، ثم قم بتصفية المحلول من خلال مصفاة خلية 100 ميكرومتر في أنبوب مخروطي 50 ملليلتر المسمى حديثا. بعد ذلك ، قم بطرد الخليط المصفى عند 1،650 جم لمدة خمس دقائق عند أربع درجات مئوية واستنشاق المادة الطافية باستخدام ماصة مرعى زجاجية.تحضير 100 ميكروغرام لكل مليلتر Dnase One وإعادة تعليق الخلايا في ملليلتر واحد من محلول Dnase One عن طريق إضافة محلول DNase One الحكيم. بعد 15 دقيقة من الحضانة في درجة حرارة الغرفة ، أضف 25 مل من وسط القاعدة العضوية إلى الخلايا واقلبها للخلط. ثم قم بطرد الخلايا عند 1،650 جم لمدة خمس دقائق عند أربع درجات مئوية واستنشاق المادة الطافية بعناية باستخدام ماصة مرعى زجاجية.أعد تعليق حبيبات الخلايا المشكلة حديثا في خمسة ملليلتر من خلايا الدم الحمراء الدافئة مسبقا أو محلول تحلل كرات الدم الحمراء. دوامة المحاليل في كل أنبوب مخروطي عند 458 جم واحتضانها لمدة خمس دقائق. مرة أخرى ، قم بطرد الحبيبات المعلقة في محلول تحلل كرات الدم الحمراء واستنشاق المادة الطافية باستخدام ماصة مرعى زجاجية.غسل بيليه مع 10 ملليلتر PBS ودوامة الخلايا قبل الطرد المركزي للخلايا. بالنسبة لحبيبات الخلية الكبيرة ، قم بشفط PBS وإضافة ملليلتر واحد من وسط القاعدة العضوية أعلى الحبيبات. بعد دوامة المحلول ، انقل 300 إلى 400 ميكرولتر من تعليق الخلية إلى أنبوب طرد مركزي صغير.بعد خمس دقائق من الطرد المركزي ، قم بنضح المادة الطافية وإعادة تعليقها في مستخلص الغشاء القاعدي ، أو BME ، ووسط القاعدة العضوية باستخدام أطراف باردة. ضع محلول الخلية المعاد تعليقه في صفيحة من ستة آبار في 40 ميكرولتر من القسامة. لوحة تصل إلى خمسة حصص لكل بئر.ضع صفيحة البئر على الفور في الحاضنة لمدة 20 دقيقة ، وبعد الحضانة ، أضف برفق ملليلتر من الوسط العضوي الكامل في كل بئر. أضف ملليلتر واحد من وسط القاعدة العضوية إلى كل بئر وقم بسحب الوسائط لأعلى ولأسفل مباشرة على علامات التبويب العضوية للتفكك. اجمع كل الوسط الذي يحتوي على الكريات المعاد تعليقها في أنبوب مخروطي 15 ملليلتر.ثم ، الطرد المركزي الأنبوب المخروطي 15 ملليلتر الذي يحتوي على الخليط لمدة خمس دقائق قبل استنشاق المادة الطافية. أضف ملليلترا واحدا من الإنزيم المؤتلف الحر من أصل حيواني إلى حبيبات الخلية. امزج عن طريق الدوامة وانقل التعليق إلى أنبوب طرد مركزي دقيق سعة 1.5 ملليلتر.بعد 15 دقيقة من الحضانة في حمام مائي 37 درجة مئوية وخمس دقائق من الطرد المركزي ، استنشق الطاف. أعد تعليق الحبيبات في BME ووسط القاعدة العضوية وقم بطلاء محلول الخلية المعاد تعليقه في صفيحة من ستة آبار في حصص 40 ميكرولتر. لوحة تصل إلى خمسة حصص لكل بئر.بعد 20 دقيقة من الحضانة ، أضف برفق ملليلتر من الوسط العضوي الكامل في كل بئر. أعد تعليق حبيبات الخلايا العضوية في 0.5 إلى ملليلتر واحد من وسط تجميد ثقافة الخلايا الاسترداد وانقل ملليلتر واحد إلى كل قارورة تبريد قبل نقلها إلى 80 درجة تحت الصفر وخزان النيتروجين السائل للتخزين طويل الأجل. قم بإذابة المواد العضوية عن طريق نقل قوارير التبريد المخزنة في النيتروجين السائل إلى حمام مائي 37 درجة مئوية.بمجرد إذابتها ، انقل المواد العضوية إلى أنبوب مخروطي سعة 15 ملليلتر وطردها مركزيا قبل استنشاق المادة الطافية. بعد ذلك ، أضف ملليلتر واحد من PBS إلى الحبيبات وانقل الحبيبات المعاد تعليقها إلى أنبوب طرد مركزي دقيق سعة 1.5 ملليلتر بعد الطرد المركزي عند 1،650 جم لمدة خمس دقائق عند أربع درجات مئوية ، قم باستنشاق المادة الطافية بعناية باستخدام ماصة مرعى زجاجية. أعد تعليق الحبيبات في BME ووسط القاعدة العضوية وقم بطلاء الخلايا المعاد تعليقها على صفيحة من ستة آبار في 40 ميكرولتر من القسامة.ضع ما يصل إلى خمسة حصص لكل بئر. ضع اللوحة على الفور في الحاضنة لمدة 20 دقيقة قبل إضافة ملليلتر من الوسط العضوي الكامل إلى الآبار. تم إنشاء المواد العضوية على مدى 10 أيام وبعد ذلك أظهروا عضويات منفصلة في الثقافة.تم تقييم الثقافات العضوية المشتقة من المرضى عن طريق دمجها في الأغاروز وتقييمها باستخدام تلطيخ الهيماتوكسيلين ويوزين. من المهم النظر في تحديات العمل مع BME. يجب أن تتم إعادة تعليق حبيبات الخلية و BME على الجليد لضمان عدم تكوين فقاعات في هذه العملية.تسمح هذه التقنية بإجراء مزيد من الأبحاث حول تأثير العلاج الكيميائي على توليد الأعضاء وتطورها بسبب المشاكل التي يواجهها المرضى الذين خضعوا للعلاج الكيميائي المساعد الجديد.

Research

JoVE Journal

Cancer Research

Establishment of Gastric Cancer Patient-derived Xenograft Models and Primary Cell Lines

إنشاء نماذج Xenograft المستمدة من سرطان المعدة وخطوط الخلايا الأولية

The use of preclinical models to advance our understanding of tumor biology and investigate the efficacy of therapeutic agents is key to cancer research. ...

High-Throughput In Vitro Assay using Patient-Derived Tumor Organoids

High-Throughput In Vitro Assay using Patient-Derived Tumor Organoids

عالية الإنتاجية في المختبر المقايسة باستخدام الجهازيات الورم المستمدة من المريض

Patient-derived tumor organoids (PDOs) are expected to be a preclinical cancer model with better reproducibility of disease than traditional cell culture ...

Profiling Sensitivity to Targeted Therapies in EGFR-Mutant NSCLC Patient-Derived Organoids

حساسية التنميط للعلاجات المستهدفة في المواد العضوية المشتقة من المريض NSCLC المتحورة EGFR

Novel 3D cancer organoid cultures derived from clinical patient specimens represent an important model system to evaluate intratumor heterogeneity and ...

Orthotopic Implantation of Patient-Derived Cancer Cells in Mice Recapitulates Advanced Colorectal Cancer

زرع تقويم العظام للخلايا السرطانية المشتقة من المريض في الفئران يلخص سرطان القولون والمستقيم المتقدم

Over the last decade, more sophisticated preclinical colorectal cancer (CRC) models have been established using patient-derived cancer cells and 3D ...

Establishment and Culture of Patient-Derived Breast Organoids

إنشاء وثقافة عضويات الثدي المشتقة من المريض

Breast cancer is a complex disease that has been classified into several different histological and molecular subtypes. Patient-derived breast tumor ...

Visualizing DNA Damage Repair Proteins in Patient-Derived Ovarian Cancer Organoids via Immunofluorescence Assays

Visualizing DNA Damage Repair Proteins in Patient-Derived Ovarian Cancer Organoids via Immunofluorescence Assays

تصور بروتينات إصلاح تلف الحمض النووي في عضويات سرطان المبيض المشتقة من المريض عن طريق فحوصات التألق المناعي

Immunofluorescence is one of the most widely used techniques to visualize target antigens with high sensitivity and specificity, allowing for the accurate ...

Ovarian Cancer Patient-Derived Organoid Models for Pre-Clinical Drug Testing

Ovarian cancer is a fatal gynecologic cancer and the fifth leading cause of cancer death among women in the United States. Developing new drug treatments ...

Automated Kinetic Imaging for Drug Assessment in Patient-Derived Tumor Organoids

Multiplexed Live-Cell Imaging for Drug Responses in Patient-Derived Organoid Models of Cancer

Author Spotlight: Developing Multiplexed Kinetic Assays for Organoid-Based Drug Response Analysis

Patient-derived organoid (PDO) models of cancer are a multifunctional research system that better recapitulates human disease as compared to cancer cell ...

Derivation of 3D Glioma Organoids from Chopper-Processed Patient Tumors

Cultivating Ex Vivo Patient-Derived Glioma Organoids Using a Tissue Chopper

Author Spotlight: Enhanced Generation of Patient-Derived 3D Organoids for Glioblastoma and Glioma

Glioblastoma, IDH-wild type, CNS WHO grade 4 (GBM) is a primary brain tumor associated with poor patient survival despite aggressive treatment. Developing ...

Standardizing Ovarian Cancer Organoid Biobanking

Strategy for Biobanking of Ovarian Cancer Organoids: Addressing the Interpatient Heterogeneity across Histological Subtypes and Disease Stages

Author Spotlight: Advancing Personalized Medicine in Ovarian Cancer 

استراتيجية البنوك الحيوية لعضويات سرطان المبيض: معالجة عدم التجانس بين المرضى عبر الأنواع الفرعية النسيجية ومراحل المرض

While the establishment of an ovarian cancer biobank from patient-derived organoids along with their clinical background information promises advances in ...