Name: generation and culturing of high-grade serous ovarian cancer patient-derived organoids
Uploaded: 2023-01-06T14:50:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Generation and Culturing of High-Grade Serous Ovarian Cancer Patient-Derived Organoids at JoVE.com

Vi er taknemmelige for vejledningen fra Ron Bose, MD, PhD, og hjælp fra Barbara Blachut, MD, til at etablere denne protokol. Vi vil også gerne anerkende Washington University's School of Medicine i St. Louis's Department of Obstetrics and Gynecology og Division of Gynecologic Oncology, Washington University's Dean's Scholar Program og Reproductive Scientist Development Program for deres støtte til dette projekt.

Alle humane vævsprøver indsamlet til forskning blev opnået i henhold til Institutional Review Board (IRB) -godkendt protokol. De protokoller, der er skitseret nedenfor, blev udført i et sterilt humant vævskulturmiljø. Der blev indhentet informeret skriftligt samtykke fra mennesker. Egnede patienter skulle have en diagnose eller formodet diagnose af kræft i æggestokkene, være villige og i stand til at underskrive informeret samtykke og være mindst 18 år. Tumorvæv (ondartet primær tumor eller metastatiske sted...

<ol>
	<li>Bray, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Global+cancer+statistics+2018:+GLOBOCAN+estimates+of+incidence+and+mortality+worldwide+for+36+cancers+in+185+countries.">Global cancer statistics 2018: GLOBOCAN estimates of incidence and mortality worldwide for 36 cancers in 185 countries.</a> CA: A Cancer Journal for Clinicians. 68 (6), 394-424 (2018).</li><li>Drost, J., Clevers, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Organoids+in+cancer+research.">Organoids in cancer research.</a> Nature Reviews Cancer. 18 (7), 407-418 (2018).</li><li>Pauli, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Personalized+in+vitro+and+in+vivo+cancer+models+to+guide+precision+medicine.">Personalized in vitro and in vivo cancer models to guide precision medicine.</a> Cancer Discovery. 7 (5), 462-477 (2017).</li><li>Fujii, E., Kato, A., Suzuki, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Patient-derived+xenograft+(PDX)+models:+Characteristics+and+points+to+consider+for+the+process+of+establishment.">Patient-derived xenograft (PDX) models: Characteristics and points to consider for the process of establishment.</a> Journal of Toxicologic Pathology. 33 (3), 153-160 (2020).</li><li>Yang, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Application+of+ovarian+cancer+organoids+in+precision+medicine:+Key+challenges+and+current+opportunities.">Application of ovarian cancer organoids in precision medicine: Key challenges and current opportunities.</a> Frontiers in Cell and Developmental Biology. 9, 701429 (2021).</li><li>Yang, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Patient-derived+organoids:+A+promising+model+for+personalized+cancer+treatment.">Patient-derived organoids: A promising model for personalized cancer treatment.</a> Gastroenterology Report. 6 (4), 243-245 (2018).</li><li>Karakasheva, T. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+and+characterization+of+patient-derived+head+and+neck,+oral,+and+esophageal+cancer+organoids.">Generation and characterization of patient-derived head and neck, oral, and esophageal cancer organoids.</a> Current Protocols in Stem Cell Biology. 53 (1), 109 (2020).</li><li>Madison, B. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Let-7+represses+carcinogenesis+and+a+stem+cell+phenotype+in+the+intestine+via+regulation+of+Hmga2.">Let-7 represses carcinogenesis and a stem cell phenotype in the intestine via regulation of Hmga2.</a> PLoS Genetics. 11 (8), 1005408 (2015).</li><li>Sato, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single+Lgr5+stem+cells+build+crypt-villus+structures+in+vitro+without+a+mesenchymal+niche.">Single Lgr5 stem cells build crypt-villus structures in vitro without a mesenchymal niche.</a> Nature. 459 (7244), 262-265 (2009).</li><li>Murray, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=HER2+and+APC+mutations+promote+altered+crypt-villus+morphology+and+marked+hyperplasia+in+the+intestinal+epithelium.">HER2 and APC mutations promote altered crypt-villus morphology and marked hyperplasia in the intestinal epithelium.</a> Cellular and Molecular Gastroenterology and Hepatology. 12 (3), 1105-1120 (2021).</li><li>Hill, S. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Prediction+of+DNA+repair+inhibitor+response+in+short-term+patient-derived+ovarian+cancer+organoids.">Prediction of DNA repair inhibitor response in short-term patient-derived ovarian cancer organoids.</a> Cancer Discovery. 8 (11), 1404-1421 (2018).</li><li>Passarelli, M. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Leucyl-tRNA+synthetase+is+a+tumour+suppressor+in+breast+cancer+and+regulates+codon-dependent+translation+dynamics.">Leucyl-tRNA synthetase is a tumour suppressor in breast cancer and regulates codon-dependent translation dynamics.</a> Nature Cell Biology. 24 (3), 307-315 (2022).</li><li>Pleguezuelos-Manzano, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Establishment+and+culture+of+human+intestinal+organoids+derived+from+adult+stem+cells.">Establishment and culture of human intestinal organoids derived from adult stem cells.</a> Current Protocols in Immunology. 130 (1), 106 (2020).</li><li>Stumm, M. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Validation+of+a+postfixation+tissue+storage+and+transport+medium+to+preserve+histopathology+and+molecular+pathology+analyses+(total+and+phosphoactivated+proteins,+and+FISH).">Validation of a postfixation tissue storage and transport medium to preserve histopathology and molecular pathology analyses (total and phosphoactivated proteins, and FISH).</a> American Journal of Clinical Pathology. 137 (3), 429-436 (2012).</li><li>Feldman, A. T., Wolfe, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tissue+processing+and+hematoxylin+and+eosin+staining.">Tissue processing and hematoxylin and eosin staining.</a> Methods in Molecular Biology. 1180, 31-43 (2014).</li><li>Ooft, S. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Patient-derived+organoids+can+predict+response+to+chemotherapy+in+metastatic+colorectal+cancer+patients.">Patient-derived organoids can predict response to chemotherapy in metastatic colorectal cancer patients.</a> Science Translational Medicine. 11 (513), (2019).</li><li>Aisenbrey, E. A., Murphy, W. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synthetic+alternatives+to+Matrigel.">Synthetic alternatives to Matrigel.</a> Nature Reviews Materials. 5 (7), 539-551 (2020).</li><li>Nanki, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Patient-derived+ovarian+cancer+organoids+capture+the+genomic+profiles+of+primary+tumours+applicable+for+drug+sensitivity+and+resistance+testing.">Patient-derived ovarian cancer organoids capture the genomic profiles of primary tumours applicable for drug sensitivity and resistance testing.</a> Scientific Reports. 10, 12581 (2020).</li><li>Mead, B. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Screening+for+modulators+of+the+cellular+composition+of+gut+epithelia+via+organoid+models+of+intestinal+stem+cell+differentiation.">Screening for modulators of the cellular composition of gut epithelia via organoid models of intestinal stem cell differentiation.</a> Nature Biomedical Engineering. 6 (4), 476-494 (2022).</li></ol>

Kræft i æggestokkene er ekstremt dødelig på grund af dets avancerede stadium ved diagnosen samt den almindelige udvikling af kemoterapiresistens. Mange fremskridt inden for forskning i kræft i æggestokkene er blevet gjort ved at udnytte kræftcellelinjer og PDX-modeller; Der er imidlertid et indlysende behov for en mere repræsentativ og økonomisk overkommelig in vitro-model . BDO'er har vist sig nøjagtigt at repræsentere tumorheterogeniteten, tumormikromiljøet og de genomiske og transkriptomiske træk...

I 2021 blev cirka 21,410 kvinder i USA nyligt diagnosticeret med epitelial kræft i æggestokkene, og 12,940 kvinder døde af denne sygdom1. Selvom der er gjort tilstrækkelige fremskridt inden for kirurgi og kemoterapi, udvikler over 70% af patienterne med avanceret sygdom kemoterapeutisk resistens og dør inden for 5 år efter diagnose 2,3. Derfor er der et presserende behov for nye strategier til behandling af denne dødelige sygdom og repræsentative, pålidelige modeller for præklinisk forskning.
Kræftcellelinjer og patientafledte xenotransplantater (PDX) skabt af primære ovarietumorer er de vigtigste instrumenter, der anvendes i forskning i kræft i æggestokkene. En stor fordel ved kræftcellelinjer er deres hurtige ekspansion. Imidlertid resulterer deres kontinuerlige kultur i fænotypiske og genotypiske ændringer, der får kræftcellelinjerne til at afvige fra den oprindelige primære kræfttumorprøve. På grund af de eksisterende forskelle mellem kræftcellelinjen og den primære tumor har lægemiddelanalyser, der har positive virkninger i cellelinjer, ikke de samme virkninger i kliniske forsøg2. For at overvinde disse begrænsninger anvendes PDX-modeller. Disse modeller er skabt ved at implantere frisk ovariecancervæv i immundefekte mus. Da de er in vivo-modeller , ligner de mere nøjagtigt menneskelige biologiske egenskaber og er igen mere forudsigelige for lægemiddelresultater. Disse modeller har dog også betydelige begrænsninger, herunder omkostninger, tid og ressourcer, der er nødvendige for at generere dem4.
BDO'er tilbyder en alternativ model til præklinisk forskning, der overvinder begrænsningerne i både kræftcellelinjer og PDX-modeller. BDO'er rekapitulerer en patients tumor- og tumormikromiljø og giver således en in vitro-medgørlig model, der er ideel til præklinisk forskning 2,3,5. Disse 3D-modeller har selvorganiseringsfunktioner, der modellerer den primære tumor, hvilket er en funktion, som deres todimensionelle (2D) cellelinjemodstykker ikke besidder. Desuden har disse modeller vist sig at genetisk og funktionelt repræsentere deres modertumorer og er således pålidelige modeller til undersøgelse af nye terapeutiske og biologiske processer. Kort sagt tilbyder de langsigtede ekspansions- og lagringsfunktioner, der ligner cellelinjer, men omfatter også mikromiljøet og celle-celle-interaktioner, der er forbundet med musemodeller 4,6.
Denne protokol beskriver oprettelsen af BDO'er fra patientafledte tumorer, ascites og pleurvæskeprøver med en succesrate på mere end 97%. BOB-kulturerne kan derefter udvides i flere generationer og bruges til at teste lægemiddelterapifølsomhed og prædiktive biomarkører. Denne metode repræsenterer en teknik, der kan bruges til at personalisere behandlinger baseret på de terapeutiske reaktioner fra BDO'er.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>1% HEPES</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>15630080</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1% Penicillin-Streptomycin</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>30002CI</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1.5 mL Eppendorf Tubes&#160;</td>
			<td>Genesee Scientific</td>
			<td>14125</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10 cm Tissue Culture Dish&#160;</td>
			<td>TPP</td>
			<td>93100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10 mL Serological Pipet</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>100 &#181;m Cell Filter</td>
			<td>MidSci</td>
			<td>100ICS</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>15 mL centrifuge tubes</td>
			<td>Corning</td>
			<td>430052</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2 mL Cryovial</td>
			<td>Simport Scientific</td>
			<td>T301-2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2% Paraformaldehyde Fixative</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>37 &#176;C water bath&#160;</td>
			<td>NEST</td>
			<td>602052</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3dGRO R-Spondin-1 Conditioned Media Supplement</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>SCM104</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>6 well plates</td>
			<td>TPP</td>
			<td>92006</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>70% Ethanol</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>R31541GA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>A83-01</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>SML0788</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Advanced DMEM/F12</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>12634028</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agar</td>
			<td>Lamda Biotech</td>
			<td>C121</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>B-27</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>17504044</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge&#160;</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cultrex Type 2</td>
			<td>R&#38;D Systems</td>
			<td>3533-010-02</td>
			<td>basement membrane extract</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNase I</td>
			<td>New England Bio Labs</td>
			<td>M0303S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNase I Reaction Buffer</td>
			<td>New England Bio Labs</td>
			<td>M0303S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EGF</td>
			<td>PeproTech</td>
			<td>AF-100-15</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FBS&#160;</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>F2442</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FGF-10</td>
			<td>PeproTech</td>
			<td>100-26</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FGF2</td>
			<td>PeproTech</td>
			<td>100-18B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>gentleMACS C Tubes</td>
			<td>Miltenyi BioTech</td>
			<td>130-096-334</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>gentleMACS Octo Dissociator with Heaters</td>
			<td>Miltenyi BioTech</td>
			<td>130-096-427</td>
			<td>We use the manufacturers protocol.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GlutaMAX</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>35050061</td>
			<td>dipeptide, L-alanyl-L-glutamine</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hematoxylin and Eosin Staining Kit</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>NC1470670</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Histoplast Paraffin Wax</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>22900700</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microcentrifuge&#160;</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mr. Frosty Freezing Container</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>07202363S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N-acetylcysteine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A9165</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nicotinamide</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>N0636</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>p1000 Pipette with Tips&#160;</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>p200 Pipette with Tips&#160;</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pasteur Pipettes 9&#34;</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>1367820D</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>MT21031CM</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipet Controller</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Prostaglandin E2</td>
			<td>R&#38;D Systems</td>
			<td>2296</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Puromycin&#160;</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>A1113802</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recombinant Murine Noggin</td>
			<td>PeproTech</td>
			<td>250-38</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recovery Cell Culture Freezing Medium</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>12648010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Red Blood Cell Lysis Buffer</td>
			<td>BioLegend</td>
			<td>420301</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ROCK Inhibitor (Y-27632)</td>
			<td>R&#38;D Systems</td>
			<td>1254/1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SB202190</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S7076</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T75 Flask</td>
			<td>MidSci</td>
			<td>TP90076</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue Culture Hood&#160;</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue Embedding Cassette</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TrypLE Express</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>12604013</td>
			<td>animal origin-free, recombinant enzyme</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Type II Collagenase</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>17101015</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vortex</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

generation and culturing of high-grade serous ovarian cancer patient-derived organoids

Organoider er 3D dynamiske tumormodeller, der kan dyrkes med succes fra patientafledt ovarietumorvæv, ascites eller pleurvæske og hjælpe med opdagelsen af nye terapeutiske og prædiktive biomarkører for kræft i æggestokkene. Disse modeller rekapitulerer klonal heterogenitet, tumormikromiljøet og celle-celle- og cellematrixinteraktioner. Derudover har de vist sig at matche den primære tumor morfologisk, cytologisk, immunhistokemisk og genetisk. Således letter organoider forskning på tumorceller og tumormikromiljøet og er bedre end cellelinjer. Denne protokol beskriver forskellige metoder til at generere patientafledte ovariecancerorganoider fra patienttumorer, ascites og pleurvæskeprøver med en succesrate på mere end 97%. Patientprøverne adskilles i cellulære suspensioner ved både mekanisk og enzymatisk fordøjelse. Cellerne belægges derefter ved hjælp af et kældermembranekstrakt (BME) og understøttes med optimerede vækstmedier, der indeholder kosttilskud, der er specifikke for dyrkning af højkvalitets serøs ovariecancer (HGSOC). Efter dannelse af indledende organoider kan BOB'erne opretholde langsigtet kultur, herunder passaging til ekspansion til efterfølgende eksperimenter.

For at generere BDO'er blev prøverne fordøjet mekanisk og enzymatisk i enkeltcellesuspensioner. Cellerne blev derefter resuspenderet i BME og suppleret med specifikt konstruerede medier (figur 3). Organoider etableres typisk over en tidsramme på 10 dage, hvorefter de demonstrerer diskrete organoider i kultur (figur 4).
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64878/64878f...

Watch this Scientific Journal Video about Generation and Culturing of High-Grade Serous Ovarian Cancer Patient-Derived Organoids at JoVE.com

Generation and Culturing of High-Grade Serous Ovarian Cancer Patient-Derived Organoids

Patientafledte organoider (PDO) er en tredimensionel (3D) kultur, der kan efterligne tumormiljøet in vitro. I højkvalitets serøs kræft i æggestokkene repræsenterer BDO'er en model til at studere nye biomarkører og terapi.

Generering og dyrkning af højkvalitets serøs ovariecancer patientafledte organoider

Organoids are 3D dynamic tumor models that can be grown successfully from patient-derived ovarian tumor tissue, ascites, or pleural fluid and aid in the ...

Patientdrevne organoidmodeller repræsenterer genetisk og funktionelt deres modertumorer og er således pålidelige modeller til undersøgelse af nye terapeutiske og komplekse biologiske processer i kræft i æggestokkene. Ved at rekapitulere klonal heterogenitet, tumormikromiljøet og in vitro celle til celle-interaktioner overvinder disse modeller begrænsningerne ved kræftcellelinjer og patientafledte xenotransplantater. Patientafledte organoider tilbyder langsigtet ekspansion og opbevaringskapacitet og efterligner tumorfysiologi.Som et resultat er de ideelle modeller til undersøgelse af nye terapeutiske og prædiktive biomarkører. Begynd høst af organoiderne ved at placere tumorprøverne i en 10 centimeter vævskulturskål og hakke vævet for at skabe en homogen blanding ved hjælp af en engangsskalpel. Anbring den homogene vævsblanding i et dissociationsrør ved hjælp af tang.For hver en til to milliliter homogeniseret væv tilsættes syv til otte milliliter af en milligram pr. milliliter type to kollagenaseopløsning i organoid basemedium og en milliliter DNase One-opløsning. Vortex opløsningen ved 458 G.Flydende vævet, mens det er i kollagenaseopløsningen ved hjælp af dissociationsmaskinen. Kør programmet 37 C understregning H understrege TDK tre en time, indtil det er en enkelt celle suspension.Når du er færdig, overføres den homogeniserede blanding til et nyt 50 ml konisk rør. Tilsæt 20 til 40 ml organoid basemedium og hvirvel opløsningen ved 458 G.Derefter filtreres opløsningen gennem en 100 mikrometer cellesil i et nyligt mærket 50 ml konisk rør. Derefter centrifugeres den filtrerede blanding ved 1.650 G i fem minutter ved fire grader Celsius og suges supernatanten ved hjælp af en glasgræspipette.Forbered 100 mikrogram pr. milliliter Dnase One og resuspender cellerne i en milliliter Dnase One-opløsning ved at tilføje dråbevis DNase One-opløsning. Efter 15 minutters inkubation ved stuetemperatur tilsættes 25 ml organoidbasemedium til cellerne og inverteres for at blande. Derefter centrifugeres cellerne ved 1.650 G i fem minutter ved fire grader Celsius og suges forsigtigt supernatanten ved hjælp af en glasgræspipette.Resuspender den nydannede cellepellet i fem ml forvarmede røde blodlegemer eller RBC-lysebuffer. Vortex opløsningerne i hvert konisk rør ved 458 G og inkuberes i fem minutter. Igen centrifugeres pelleten, der er suspenderet i RBC-lysebuffer, og supernatanten suges til ved hjælp af en glasgræspipette.Vask pelleten med 10 ml PBS og hvirvel cellerne før centrifugering af cellerne. For en stor cellepille aspireres PBS og tilsættes en milliliter af det organoide basemedium oven på pelleten. Efter hvirvelstrøm af opløsningen overføres 300 til 400 mikroliter af cellesuspensionen til et mikrocentrifugerør.Efter fem minutters centrifugering aspireres supernatanten og resuspenderes i kældermembranekstrakt eller BME og organoid basemedium ved hjælp af kolde spidser. Den opslæmmede celleopløsning anbringes i en plade med seks huller i 40 mikroliter alikvoter. Pladen op til fem alikvoter pr. hul.Placer straks brøndpladen i inkubatoren i 20 minutter, og efter inkubationen tilsættes forsigtigt to milliliter af det komplette organoidmedium i hver brønd. Tilsæt en milliliter organoid basemedium til hvert hul og pipette mediet op og ned direkte på organoidfanerne for dissociation. Opsaml alt mediet indeholdende de resuspenderede pellets i et 15 ml konisk rør.Derefter centrifugeres det 15 ml koniske rør indeholdende blandingen i fem minutter, før supernatanten suges op. Tilsæt en milliliter animalsk oprindelse frit rekombinant enzym til cellepelleten. Bland ved hvirvelstrøm og overfør suspensionen til et 1,5 ml mikrocentrifugerør.Efter 15 minutters inkubation i et vandbad på 37 grader Celsius og fem minutters centrifugering aspireres supernatanten. Pellet resuspenderes i BME og organoid basemedium og plade den opslæmmede celleopløsning i en seks-brøndplade i 40 mikroliter alikvoter. Pladen op til fem alikvoter pr. hul.Efter 20 minutters inkubation tilsættes forsigtigt to milliliter af det komplette organoidmedium i hver brønd. Resuspender passageorganoidcellepelleten i 0,5 til en milliliter Recovery Cell Culture Freezing Medium og overfør en milliliter til hvert cryo-hætteglas, før du overfører dem til minus 80 grader og flydende nitrogentank til langtidsopbevaring. Optø organoiderne ved at overføre de kryohætteglas, der opbevares i flydende nitrogen, til 37 grader Celsius vandbad.Når organoiderne er optøet, overføres de til et konisk rør på 15 ml, og de centrifugeres, inden supernatanten suges op. Derefter tilsættes en milliliter PBS til pelleten og overføres den resuspenderede pellet til et 1,5 ml mikrocentrifugerør Efter centrifugering ved 1.650 G i fem minutter ved fire grader Celsius suges forsigtigt supernatanten ved hjælp af en glasgræspipette. Resuspender pellet i BME og organoid basemedium og plade de resuspenderede celler på en seks-brøndplade i 40 mikroliter alikvoter.Anbring op til fem delprøver pr. hul. Placer straks pladen i inkubatoren i 20 minutter, før der tilsættes to ml komplet organoidmedium til brøndene. Organoider blev etableret over 10 dage, hvorefter de demonstrerede diskrete organoider i kultur.Patientafledte organoidkulturer blev vurderet ved at indlejre dem i agarose og evaluere dem med hæmatoxylin og eosinfarvning. Det er vigtigt at overveje udfordringerne ved at arbejde med BME. Resuspension af cellepillen og BME skal ske på is, hvilket sikrer, at der ikke dannes bobler i processen.Denne teknik giver mulighed for yderligere forskning i virkningen af kemoterapi på organoid generering og udvikling på grund af de problemer, som patienter, der har gennemgået neoadjuverende kemoterapi, støder på.

Research

JoVE Journal

Cancer Research

Establishment of Gastric Cancer Patient-derived Xenograft Models and Primary Cell Lines

Etablering af gastrisk Cancer patient afledte xenograft-modeller og primære cellelinjer

The use of preclinical models to advance our understanding of tumor biology and investigate the efficacy of therapeutic agents is key to cancer research. ...

High-Throughput In Vitro Assay using Patient-Derived Tumor Organoids

High-Throughput In Vitro Assay using Patient-Derived Tumor Organoids

High-Throughput In Vitro Assay ved hjælp af patient-afledte tumor organoider

Patient-derived tumor organoids (PDOs) are expected to be a preclinical cancer model with better reproducibility of disease than traditional cell culture ...

Profiling Sensitivity to Targeted Therapies in EGFR-Mutant NSCLC Patient-Derived Organoids

Profilering af følsomhed over for målrettede terapier i EGFR-mutant NSCLC-patientafledte organoider

Novel 3D cancer organoid cultures derived from clinical patient specimens represent an important model system to evaluate intratumor heterogeneity and ...

Orthotopic Implantation of Patient-Derived Cancer Cells in Mice Recapitulates Advanced Colorectal Cancer

Ortopisk implantation af patientafledte kræftceller hos mus rekapitulerer avanceret kolorektal cancer

Over the last decade, more sophisticated preclinical colorectal cancer (CRC) models have been established using patient-derived cancer cells and 3D ...

Establishment and Culture of Patient-Derived Breast Organoids

Etablering og kultur af patientafledte brystorganoider

Breast cancer is a complex disease that has been classified into several different histological and molecular subtypes. Patient-derived breast tumor ...

Visualizing DNA Damage Repair Proteins in Patient-Derived Ovarian Cancer Organoids via Immunofluorescence Assays

Visualizing DNA Damage Repair Proteins in Patient-Derived Ovarian Cancer Organoids via Immunofluorescence Assays

Visualisering af DNA-skadereparationsproteiner i patientafledte ovariecancerorganoider via immunofluorescensassays

Immunofluorescence is one of the most widely used techniques to visualize target antigens with high sensitivity and specificity, allowing for the accurate ...

Ovarian Cancer Patient-Derived Organoid Models for Pre-Clinical Drug Testing

Ovarian cancer is a fatal gynecologic cancer and the fifth leading cause of cancer death among women in the United States. Developing new drug treatments ...

Automated Kinetic Imaging for Drug Assessment in Patient-Derived Tumor Organoids

Multiplexed Live-Cell Imaging for Drug Responses in Patient-Derived Organoid Models of Cancer

Author Spotlight: Developing Multiplexed Kinetic Assays for Organoid-Based Drug Response Analysis

Patient-derived organoid (PDO) models of cancer are a multifunctional research system that better recapitulates human disease as compared to cancer cell ...

Derivation of 3D Glioma Organoids from Chopper-Processed Patient Tumors

Cultivating Ex Vivo Patient-Derived Glioma Organoids Using a Tissue Chopper

Author Spotlight: Enhanced Generation of Patient-Derived 3D Organoids for Glioblastoma and Glioma

Glioblastoma, IDH-wild type, CNS WHO grade 4 (GBM) is a primary brain tumor associated with poor patient survival despite aggressive treatment. Developing ...

Standardizing Ovarian Cancer Organoid Biobanking

Strategy for Biobanking of Ovarian Cancer Organoids: Addressing the Interpatient Heterogeneity across Histological Subtypes and Disease Stages

Author Spotlight: Advancing Personalized Medicine in Ovarian Cancer 

Strategi for biobanking af ovariecancerorganoider: adressering af interpatient heterogenitet på tværs af histologiske undertyper og sygdomsstadier

While the establishment of an ovarian cancer biobank from patient-derived organoids along with their clinical background information promises advances in ...