Name: generation and culturing of high-grade serous ovarian cancer patient-derived organoids
Uploaded: 2023-01-06T14:50:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Generation and Culturing of High-Grade Serous Ovarian Cancer Patient-Derived Organoids at JoVE.com

We zijn dankbaar voor de begeleiding van Ron Bose, MD, PhD, en de hulp van Barbara Blachut, MD, bij het opstellen van dit protocol. We willen ook de Washington University's School of Medicine in St. Louis's Department of Obstetrics and Gynecology en Division of Gynecologic Oncology, Washington University's Dean's Scholar Program en het Reproductive Scientist Development Program erkennen voor hun steun aan dit project.

Alle menselijke weefselmonsters die voor onderzoek zijn verzameld, zijn verkregen volgens het door de Institutional Review Board (IRB) goedgekeurde protocol. De onderstaande protocollen werden uitgevoerd in een steriele menselijke weefselkweekomgeving. Geïnformeerde schriftelijke toestemming werd verkregen van menselijke proefpersonen. In aanmerking komende patiënten moesten een diagnose of vermoedelijke diagnose van eierstokkanker hebben, bereid en in staat zijn om geïnformeerde toestemming te ondertekenen en ten min...

<ol>
	<li>Bray, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Global+cancer+statistics+2018:+GLOBOCAN+estimates+of+incidence+and+mortality+worldwide+for+36+cancers+in+185+countries.">Global cancer statistics 2018: GLOBOCAN estimates of incidence and mortality worldwide for 36 cancers in 185 countries.</a> CA: A Cancer Journal for Clinicians. 68 (6), 394-424 (2018).</li><li>Drost, J., Clevers, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Organoids+in+cancer+research.">Organoids in cancer research.</a> Nature Reviews Cancer. 18 (7), 407-418 (2018).</li><li>Pauli, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Personalized+in+vitro+and+in+vivo+cancer+models+to+guide+precision+medicine.">Personalized in vitro and in vivo cancer models to guide precision medicine.</a> Cancer Discovery. 7 (5), 462-477 (2017).</li><li>Fujii, E., Kato, A., Suzuki, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Patient-derived+xenograft+(PDX)+models:+Characteristics+and+points+to+consider+for+the+process+of+establishment.">Patient-derived xenograft (PDX) models: Characteristics and points to consider for the process of establishment.</a> Journal of Toxicologic Pathology. 33 (3), 153-160 (2020).</li><li>Yang, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Application+of+ovarian+cancer+organoids+in+precision+medicine:+Key+challenges+and+current+opportunities.">Application of ovarian cancer organoids in precision medicine: Key challenges and current opportunities.</a> Frontiers in Cell and Developmental Biology. 9, 701429 (2021).</li><li>Yang, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Patient-derived+organoids:+A+promising+model+for+personalized+cancer+treatment.">Patient-derived organoids: A promising model for personalized cancer treatment.</a> Gastroenterology Report. 6 (4), 243-245 (2018).</li><li>Karakasheva, T. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+and+characterization+of+patient-derived+head+and+neck,+oral,+and+esophageal+cancer+organoids.">Generation and characterization of patient-derived head and neck, oral, and esophageal cancer organoids.</a> Current Protocols in Stem Cell Biology. 53 (1), 109 (2020).</li><li>Madison, B. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Let-7+represses+carcinogenesis+and+a+stem+cell+phenotype+in+the+intestine+via+regulation+of+Hmga2.">Let-7 represses carcinogenesis and a stem cell phenotype in the intestine via regulation of Hmga2.</a> PLoS Genetics. 11 (8), 1005408 (2015).</li><li>Sato, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single+Lgr5+stem+cells+build+crypt-villus+structures+in+vitro+without+a+mesenchymal+niche.">Single Lgr5 stem cells build crypt-villus structures in vitro without a mesenchymal niche.</a> Nature. 459 (7244), 262-265 (2009).</li><li>Murray, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=HER2+and+APC+mutations+promote+altered+crypt-villus+morphology+and+marked+hyperplasia+in+the+intestinal+epithelium.">HER2 and APC mutations promote altered crypt-villus morphology and marked hyperplasia in the intestinal epithelium.</a> Cellular and Molecular Gastroenterology and Hepatology. 12 (3), 1105-1120 (2021).</li><li>Hill, S. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Prediction+of+DNA+repair+inhibitor+response+in+short-term+patient-derived+ovarian+cancer+organoids.">Prediction of DNA repair inhibitor response in short-term patient-derived ovarian cancer organoids.</a> Cancer Discovery. 8 (11), 1404-1421 (2018).</li><li>Passarelli, M. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Leucyl-tRNA+synthetase+is+a+tumour+suppressor+in+breast+cancer+and+regulates+codon-dependent+translation+dynamics.">Leucyl-tRNA synthetase is a tumour suppressor in breast cancer and regulates codon-dependent translation dynamics.</a> Nature Cell Biology. 24 (3), 307-315 (2022).</li><li>Pleguezuelos-Manzano, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Establishment+and+culture+of+human+intestinal+organoids+derived+from+adult+stem+cells.">Establishment and culture of human intestinal organoids derived from adult stem cells.</a> Current Protocols in Immunology. 130 (1), 106 (2020).</li><li>Stumm, M. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Validation+of+a+postfixation+tissue+storage+and+transport+medium+to+preserve+histopathology+and+molecular+pathology+analyses+(total+and+phosphoactivated+proteins,+and+FISH).">Validation of a postfixation tissue storage and transport medium to preserve histopathology and molecular pathology analyses (total and phosphoactivated proteins, and FISH).</a> American Journal of Clinical Pathology. 137 (3), 429-436 (2012).</li><li>Feldman, A. T., Wolfe, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tissue+processing+and+hematoxylin+and+eosin+staining.">Tissue processing and hematoxylin and eosin staining.</a> Methods in Molecular Biology. 1180, 31-43 (2014).</li><li>Ooft, S. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Patient-derived+organoids+can+predict+response+to+chemotherapy+in+metastatic+colorectal+cancer+patients.">Patient-derived organoids can predict response to chemotherapy in metastatic colorectal cancer patients.</a> Science Translational Medicine. 11 (513), (2019).</li><li>Aisenbrey, E. A., Murphy, W. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synthetic+alternatives+to+Matrigel.">Synthetic alternatives to Matrigel.</a> Nature Reviews Materials. 5 (7), 539-551 (2020).</li><li>Nanki, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Patient-derived+ovarian+cancer+organoids+capture+the+genomic+profiles+of+primary+tumours+applicable+for+drug+sensitivity+and+resistance+testing.">Patient-derived ovarian cancer organoids capture the genomic profiles of primary tumours applicable for drug sensitivity and resistance testing.</a> Scientific Reports. 10, 12581 (2020).</li><li>Mead, B. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Screening+for+modulators+of+the+cellular+composition+of+gut+epithelia+via+organoid+models+of+intestinal+stem+cell+differentiation.">Screening for modulators of the cellular composition of gut epithelia via organoid models of intestinal stem cell differentiation.</a> Nature Biomedical Engineering. 6 (4), 476-494 (2022).</li></ol>

Eierstokkanker is uiterst dodelijk vanwege het gevorderde stadium bij de diagnose, evenals de gemeenschappelijke ontwikkeling van chemotherapieresistentie. Veel vooruitgang in het onderzoek naar eierstokkanker is gemaakt door gebruik te maken van kankercellijnen en PDX-modellen; Er is echter een duidelijke behoefte aan een representatiever en betaalbaarder in vitro model. BOB's hebben bewezen de tumorheterogeniteit, de tumormicro-omgeving en de genomische en transcriptomische kenmerken van hun primaire tumoren n...

In 2021 werden ongeveer 21.410 vrouwen in de Verenigde Staten nieuw gediagnosticeerd met epitheliale eierstokkanker en stierven 12.940 vrouwen aan deze ziekte1. Hoewel er voldoende vooruitgang is geboekt in chirurgie en chemotherapie, ontwikkelt meer dan 70% van de patiënten met een gevorderde ziekte chemotherapeutische resistentie en sterft binnen 5 jaar na diagnose 2,3. Daarom zijn nieuwe strategieën om deze dodelijke ziekte te behandelen en representatieve, betrouwbare modellen voor preklinisch onderzoek dringend nodig.
Kankercellijnen en patiënt-afgeleide xenografts (PDX) gemaakt van primaire eierstoktumoren zijn de belangrijkste instrumenten die worden gebruikt in onderzoek naar eierstokkanker. Een groot voordeel van kankercellijnen is hun snelle expansie. Hun voortdurende cultuur resulteert echter in fenotypische en genotypische veranderingen die ervoor zorgen dat de kankercellijnen afwijken van het oorspronkelijke primaire kankertumormonster. Vanwege de bestaande verschillen tussen de kankercellijn en de primaire tumor, hebben medicijntests met positieve effecten in cellijnen niet dezelfde effecten in klinische onderzoeken2. Om deze beperkingen te overwinnen, worden PDX-modellen gebruikt. Deze modellen worden gemaakt door vers eierstokkankerweefsel te implanteren in immunodeficiënte muizen. Omdat het in vivo modellen zijn, lijken ze nauwkeuriger op menselijke biologische kenmerken en zijn ze op hun beurt meer voorspellend voor de uitkomsten van geneesmiddelen. Deze modellen hebben echter ook aanzienlijke beperkingen, waaronder de kosten, tijd en middelen die nodig zijn om ze te genereren4.
BOB's bieden een alternatief model voor preklinisch onderzoek dat de beperkingen van zowel kankercellijnen als PDX-modellen overwint. BOB's recapituleren de tumor en tumormicro-omgeving van een patiënt en bieden zo een in vitro tracteerbaar model dat ideaal is voor preklinisch onderzoek 2,3,5. Deze 3D-modellen hebben zelforganisatiemogelijkheden die de primaire tumor modelleren, wat een kenmerk is dat hun tweedimensionale (2D) cellijn-tegenhangers niet bezitten. Verder is aangetoond dat deze modellen genetisch en functioneel hun oudertumoren vertegenwoordigen en dus betrouwbare modellen zijn voor het bestuderen van nieuwe therapieën en biologische processen. Kortom, ze bieden uitbreidings- en opslagmogelijkheden op lange termijn die vergelijkbaar zijn met cellijnen, maar omvatten ook de micro-omgeving en cel-celinteracties die inherent zijn aan muismodellen 4,6.
Het huidige protocol beschrijft de creatie van BOB's uit patiënt-afgeleide tumoren, ascites en pleuravloeistofmonsters met een succespercentage van meer dan 97%. De BOB-culturen kunnen vervolgens gedurende meerdere generaties worden uitgebreid en worden gebruikt om de gevoeligheid voor medicamenteuze therapie en voorspellende biomarkers te testen. Deze methode vertegenwoordigt een techniek die kan worden gebruikt om behandelingen te personaliseren op basis van de therapeutische reacties van BOB's.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>1% HEPES</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>15630080</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1% Penicillin-Streptomycin</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>30002CI</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1.5 mL Eppendorf Tubes&#160;</td>
			<td>Genesee Scientific</td>
			<td>14125</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10 cm Tissue Culture Dish&#160;</td>
			<td>TPP</td>
			<td>93100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10 mL Serological Pipet</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>100 &#181;m Cell Filter</td>
			<td>MidSci</td>
			<td>100ICS</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>15 mL centrifuge tubes</td>
			<td>Corning</td>
			<td>430052</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2 mL Cryovial</td>
			<td>Simport Scientific</td>
			<td>T301-2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2% Paraformaldehyde Fixative</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>37 &#176;C water bath&#160;</td>
			<td>NEST</td>
			<td>602052</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3dGRO R-Spondin-1 Conditioned Media Supplement</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>SCM104</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>6 well plates</td>
			<td>TPP</td>
			<td>92006</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>70% Ethanol</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>R31541GA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>A83-01</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>SML0788</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Advanced DMEM/F12</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>12634028</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agar</td>
			<td>Lamda Biotech</td>
			<td>C121</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>B-27</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>17504044</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge&#160;</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cultrex Type 2</td>
			<td>R&#38;D Systems</td>
			<td>3533-010-02</td>
			<td>basement membrane extract</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNase I</td>
			<td>New England Bio Labs</td>
			<td>M0303S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNase I Reaction Buffer</td>
			<td>New England Bio Labs</td>
			<td>M0303S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EGF</td>
			<td>PeproTech</td>
			<td>AF-100-15</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FBS&#160;</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>F2442</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FGF-10</td>
			<td>PeproTech</td>
			<td>100-26</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FGF2</td>
			<td>PeproTech</td>
			<td>100-18B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>gentleMACS C Tubes</td>
			<td>Miltenyi BioTech</td>
			<td>130-096-334</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>gentleMACS Octo Dissociator with Heaters</td>
			<td>Miltenyi BioTech</td>
			<td>130-096-427</td>
			<td>We use the manufacturers protocol.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GlutaMAX</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>35050061</td>
			<td>dipeptide, L-alanyl-L-glutamine</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hematoxylin and Eosin Staining Kit</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>NC1470670</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Histoplast Paraffin Wax</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>22900700</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microcentrifuge&#160;</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mr. Frosty Freezing Container</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>07202363S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N-acetylcysteine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A9165</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nicotinamide</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>N0636</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>p1000 Pipette with Tips&#160;</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>p200 Pipette with Tips&#160;</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pasteur Pipettes 9&#34;</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>1367820D</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>MT21031CM</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipet Controller</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Prostaglandin E2</td>
			<td>R&#38;D Systems</td>
			<td>2296</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Puromycin&#160;</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>A1113802</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recombinant Murine Noggin</td>
			<td>PeproTech</td>
			<td>250-38</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recovery Cell Culture Freezing Medium</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>12648010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Red Blood Cell Lysis Buffer</td>
			<td>BioLegend</td>
			<td>420301</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ROCK Inhibitor (Y-27632)</td>
			<td>R&#38;D Systems</td>
			<td>1254/1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SB202190</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S7076</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T75 Flask</td>
			<td>MidSci</td>
			<td>TP90076</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue Culture Hood&#160;</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue Embedding Cassette</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TrypLE Express</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>12604013</td>
			<td>animal origin-free, recombinant enzyme</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Type II Collagenase</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>17101015</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vortex</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

generation and culturing of high-grade serous ovarian cancer patient-derived organoids

Organoïden zijn 3D-dynamische tumormodellen die met succes kunnen worden gekweekt uit van de patiënt afgeleid ovariumtumorweefsel, ascites of pleuravocht en helpen bij de ontdekking van nieuwe therapieën en voorspellende biomarkers voor eierstokkanker. Deze modellen recapituleren klonale heterogeniteit, de tumormicro-omgeving en cel-cel- en cel-matrixinteracties. Bovendien is aangetoond dat ze morfologisch, cytologisch, immunohistochemisch en genetisch overeenkomen met de primaire tumor. Organoïden vergemakkelijken dus onderzoek naar tumorcellen en de micro-omgeving van de tumor en zijn superieur aan cellijnen. Het huidige protocol beschrijft verschillende methoden om patiënt-afgeleide eierstokkanker organoïden te genereren uit patiënttumoren, ascites en pleurale vloeistofmonsters met een succespercentage van meer dan 97%. De patiëntmonsters worden gescheiden in cellulaire suspensies door zowel mechanische als enzymatische spijsvertering. De cellen worden vervolgens verguld met behulp van een keldermembraanextract (BME) en worden ondersteund met geoptimaliseerde groeimedia die supplementen bevatten die specifiek zijn voor het kweken van hoogwaardige sereuze eierstokkanker (HGSOC). Na het vormen van initiële organoïden kunnen de BOB's een langdurige cultuur ondersteunen, inclusief het passeren voor uitbreiding voor volgende experimenten.

Om BOB's te genereren, werden de monsters mechanisch en enzymatisch verteerd tot eencellige suspensies. De cellen werden vervolgens geresuspendeerd in BME en aangevuld met specifiek ontworpen media (figuur 3). Organoïden worden meestal vastgesteld over een tijdsbestek van 10 dagen, waarna ze discrete organoïden in cultuur vertonen (figuur 4).
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/...

Watch this Scientific Journal Video about Generation and Culturing of High-Grade Serous Ovarian Cancer Patient-Derived Organoids at JoVE.com

Generation and Culturing of High-Grade Serous Ovarian Cancer Patient-Derived Organoids

Patiënt-afgeleide organoïden (BOB) zijn een driedimensionale (3D) cultuur die de tumoromgeving in vitro kan nabootsen. Bij hooggradige sereuze eierstokkanker vertegenwoordigen BOB's een model om nieuwe biomarkers en therapieën te bestuderen.

Generatie en kweek van hoogwaardige sereuze eierstokkankerpatiënt-afgeleide organoïden

Organoids are 3D dynamic tumor models that can be grown successfully from patient-derived ovarian tumor tissue, ascites, or pleural fluid and aid in the ...

Patiëntgestuurde organoïde modellen vertegenwoordigen genetisch en functioneel hun oudertumoren en zijn dus betrouwbare modellen voor het bestuderen van nieuwe therapieën en complexe biologische processen bij eierstokkanker. Door klonale heterogeniteit, de micro-omgeving van de tumor en in vitro cel-tot-celinteracties samen te vatten, overwinnen deze modellen de beperkingen van kankercellijnen en van patiënten afgeleide xenografts. Van de patiënt afgeleide organoïden bieden langdurige uitbreidings- en opslagmogelijkheden en bootsen tumorfysiologie na.Als gevolg hiervan zijn het ideale modellen voor de studie van nieuwe therapieën en voorspellende biomarkers. Begin met het oogsten van de organoïden door de tumormonsters in een weefselkweekschaal van 10 centimeter te plaatsen en het weefsel te hakken om een homogeen mengsel te maken met behulp van een wegwerpscalpel. Plaats het homogene weefselmengsel met een tang in een dissociatiebuis.Voeg voor elke één tot twee milliliter gehomogeniseerd weefsel zeven tot acht milliliter van één milligram per milliliter type twee collagenase-oplossing in organoïde basismedium en één milliliter DNase One-oplossing toe. Vortex de oplossing bij 458 G.Maak het weefsel vloeibaar terwijl het zich in de collagenase-oplossing bevindt met behulp van de dissociatiemachine. Voer het programma 37 C underscore H underscore TDK drie een uur totdat het een enkele cel suspensie is.Als u klaar bent, brengt u het gehomogeniseerde mengsel over naar een nieuwe conische buis van 50 milliliter. Voeg 20 tot 40 milliliter organoïde basismedium toe en vortex de oplossing op 458 G.Filter vervolgens de oplossing door een 100 micrometer celzeef in een nieuw gelabelde 50 milliliter conische buis. Centrifugeer vervolgens het gefilterde mengsel op 1.650 G gedurende vijf minuten bij vier graden Celsius en zuig het supernatant op met behulp van een glazen weidepipet.Bereid 100 microgram per milliliter Dnase One en resuspensie de cellen in één milliliter Dnase One-oplossing door druppelsgewijze DNase One-oplossing toe te voegen. Voeg na 15 minuten incubatie bij kamertemperatuur 25 milliliter organoïde basismedium toe aan de cellen en keer om om te mengen. Centrifugeer vervolgens de cellen op 1.650 G gedurende vijf minuten bij vier graden Celsius en zuig het supernatant voorzichtig op met behulp van een glazen weidepipet.Resuspendeerde de nieuw gevormde celkorrel in vijf milliliter voorverwarmde rode bloedcel of RBC-lysisbuffer. Vortex de oplossingen in elke conische buis op 458 G en incubeer gedurende vijf minuten. Centrifugeer nogmaals de pellet gesuspendeerd in RBC-lysisbuffer en zuig het supernatant op met behulp van een glazen weidepipet.Was de pellet met 10 milliliter PBS en draai de cellen voor het centrifugeren van de cellen. Voor een grote celkorrel zuigt u de PBS op en voegt u een milliliter van het organoïde basismedium toe aan de pellet. Breng na het vortexen van de oplossing 300 tot 400 microliter van de celsuspensie over naar een microcentrifugebuis.Na vijf minuten centrifugeren, zuig het supernatant op en resuspendeer het in keldermembraanextract, of BME, en organoïde basismedium met behulp van koude tips. Plaats de geresuspendeerde celoplossing in een zesputplaat in aliquots van 40 microliter. Plaat maximaal vijf aliquots per put.Plaats de putplaat onmiddellijk gedurende 20 minuten in de incubator en voeg na de incubatie voorzichtig twee milliliter van het volledige organoïde medium toe aan elke put. Voeg een milliliter organoïde basismedium toe aan elke put en pipetteer de media op en neer direct op de organoïde tabbladen voor dissociatie. Verzamel al het medium met de geresuspendeerde pellets in een conische buis van 15 milliliter.Centrifugeer vervolgens de conische buis van 15 milliliter met het mengsel gedurende vijf minuten voordat u het supernatant aanzuigt. Voeg een milliliter vrij recombinant enzym van dierlijke oorsprong toe aan de celpellet. Meng door vortexing en breng de suspensie over in een microcentrifugebuis van 1,5 milliliter.Na 15 minuten incubatie in een waterbad van 37 graden Celsius en vijf minuten centrifugeren, zuig je het supernatant op. Resuspendeerde de pellet in BME en organoïde basismedium en plak de geresuspendeerde celoplossing in een zesputplaat in aliquots van 40 microliter. Plaat maximaal vijf aliquots per put.Voeg na 20 minuten incubatie voorzichtig twee milliliter van het volledige organoïde medium toe aan elk putje. Resuspendeer de passage organoïde celpellet in 0,5 tot één milliliter herstelcelkweekvriesmedium en breng één milliliter over naar elke cryo-injectieflacon voordat ze worden overgebracht naar minus 80 graden en vloeibare stikstoftank voor langdurige opslag. Ontdooi de organoïden door de cryoflacons opgeslagen in vloeibare stikstof over te brengen naar een waterbad van 37 graden Celsius.Eenmaal ontdooid, breng de organoïden over naar een conische buis van 15 milliliter en centrifugeer ze voordat het supernatant wordt aangezogen. Voeg vervolgens een milliliter PBS toe aan de pellet en breng de geresuspendeerde pellet over naar een microcentrifugebuis van 1,5 milliliter Na centrifugeren bij 1.650 G gedurende vijf minuten bij vier graden Celsius, zuig het supernatant voorzichtig op met behulp van een glazen weidepipet. Resuspendeerde de pellet in BME en organoïde basismedium en plaatste de geresuspendeerde cellen op een zesputplaat in aliquots van 40 microliter.Plaats maximaal vijf aliquots per put. Plaats de plaat onmiddellijk gedurende 20 minuten in de incubator voordat u twee milliliter volledig organoïde medium aan de putjes toevoegt. Organoïden werden gedurende 10 dagen vastgesteld, waarna ze discrete organoïden in cultuur vertoonden.Van de patiënt afgeleide organoïde culturen werden beoordeeld door ze in agarose in te bedden en ze te evalueren met hematoxyline- en eosinekleuring. Het is belangrijk om rekening te houden met de uitdagingen van het werken met BME. De resuspensie van de celpellet en BME moet op ijs worden gedaan, zodat er tijdens het proces geen bellen worden gevormd.Deze techniek maakt verder onderzoek mogelijk naar de impact van chemotherapie op de productie en ontwikkeling van organoïden als gevolg van de problemen die patiënten ondervinden die neoadjuvante chemotherapie hebben ondergaan.

Research

JoVE Journal

Cancer Research

Establishment of Gastric Cancer Patient-derived Xenograft Models and Primary Cell Lines

Oprichting van maagkanker patiënten afgeleide xenograft modellen en primaire cellijnen

The use of preclinical models to advance our understanding of tumor biology and investigate the efficacy of therapeutic agents is key to cancer research. ...

High-Throughput In Vitro Assay using Patient-Derived Tumor Organoids

High-Throughput In Vitro Assay using Patient-Derived Tumor Organoids

High-Throughput In Vitro Assay met behulp van patiënt-afgeleide tumor organoïden

Patient-derived tumor organoids (PDOs) are expected to be a preclinical cancer model with better reproducibility of disease than traditional cell culture ...

Profiling Sensitivity to Targeted Therapies in EGFR-Mutant NSCLC Patient-Derived Organoids

Profileringsgevoeligheid voor gerichte therapieën in EGFR-mutante NSCLC-patiënt-afgeleide organoïden

Novel 3D cancer organoid cultures derived from clinical patient specimens represent an important model system to evaluate intratumor heterogeneity and ...

Orthotopic Implantation of Patient-Derived Cancer Cells in Mice Recapitulates Advanced Colorectal Cancer

Orthotope implantatie van patiënt-afgeleide kankercellen bij muizen recapituleert gevorderde colorectale kanker

Over the last decade, more sophisticated preclinical colorectal cancer (CRC) models have been established using patient-derived cancer cells and 3D ...

Establishment and Culture of Patient-Derived Breast Organoids

Oprichting en kweek van van de patiënt afgeleide borstorganoïden

Breast cancer is a complex disease that has been classified into several different histological and molecular subtypes. Patient-derived breast tumor ...

Visualizing DNA Damage Repair Proteins in Patient-Derived Ovarian Cancer Organoids via Immunofluorescence Assays

Visualizing DNA Damage Repair Proteins in Patient-Derived Ovarian Cancer Organoids via Immunofluorescence Assays

Het visualiseren van DNA-schadehersteleiwitten in patiënt-afgeleide eierstokkanker organoïden via immunofluorescentietests

Immunofluorescence is one of the most widely used techniques to visualize target antigens with high sensitivity and specificity, allowing for the accurate ...

Ovarian Cancer Patient-Derived Organoid Models for Pre-Clinical Drug Testing

Ovarian cancer is a fatal gynecologic cancer and the fifth leading cause of cancer death among women in the United States. Developing new drug treatments ...

Automated Kinetic Imaging for Drug Assessment in Patient-Derived Tumor Organoids

Multiplexed Live-Cell Imaging for Drug Responses in Patient-Derived Organoid Models of Cancer

Author Spotlight: Developing Multiplexed Kinetic Assays for Organoid-Based Drug Response Analysis

Patient-derived organoid (PDO) models of cancer are a multifunctional research system that better recapitulates human disease as compared to cancer cell ...

Derivation of 3D Glioma Organoids from Chopper-Processed Patient Tumors

Cultivating Ex Vivo Patient-Derived Glioma Organoids Using a Tissue Chopper

Author Spotlight: Enhanced Generation of Patient-Derived 3D Organoids for Glioblastoma and Glioma

Glioblastoma, IDH-wild type, CNS WHO grade 4 (GBM) is a primary brain tumor associated with poor patient survival despite aggressive treatment. Developing ...

Standardizing Ovarian Cancer Organoid Biobanking

Strategy for Biobanking of Ovarian Cancer Organoids: Addressing the Interpatient Heterogeneity across Histological Subtypes and Disease Stages

Author Spotlight: Advancing Personalized Medicine in Ovarian Cancer 

Strategie voor biobanking van organoïden van eierstokkanker: aanpak van de heterogeniteit tussen patiënten tussen histologische subtypes en ziektestadia

While the establishment of an ovarian cancer biobank from patient-derived organoids along with their clinical background information promises advances in ...