Name: generation and culturing of high-grade serous ovarian cancer patient-derived organoids
Uploaded: 2023-01-06T14:50:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Generation and Culturing of High-Grade Serous Ovarian Cancer Patient-Derived Organoids at JoVE.com

Nous sommes reconnaissants des conseils de Ron Bose, MD, PhD, et de l’aide de Barbara Blachut, MD, dans l’établissement de ce protocole. Nous tenons également à remercier l’École de médecine du Département d’obstétrique et de gynécologie et la Division d’oncologie gynécologique de l’Université de Washington, le Dean’s Scholar Program de l’Université de Washington et le Reproductive Scientist Development Program pour leur soutien à ce projet.

Tous les échantillons de tissus humains prélevés pour la recherche ont été obtenus conformément au protocole approuvé par le Comité d’examen institutionnel (CISR). Les protocoles décrits ci-dessous ont été exécutés dans un environnement stérile de culture de tissus humains. Le consentement écrit éclairé a été obtenu de sujets humains. Les patientes admissibles devaient avoir un diagnostic ou un diagnostic présumé de cancer de l’ovaire, être disposées et capables de signer un consentement éclai...

<ol>
	<li>Bray, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Global+cancer+statistics+2018:+GLOBOCAN+estimates+of+incidence+and+mortality+worldwide+for+36+cancers+in+185+countries.">Global cancer statistics 2018: GLOBOCAN estimates of incidence and mortality worldwide for 36 cancers in 185 countries.</a> CA: A Cancer Journal for Clinicians. 68 (6), 394-424 (2018).</li><li>Drost, J., Clevers, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Organoids+in+cancer+research.">Organoids in cancer research.</a> Nature Reviews Cancer. 18 (7), 407-418 (2018).</li><li>Pauli, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Personalized+in+vitro+and+in+vivo+cancer+models+to+guide+precision+medicine.">Personalized in vitro and in vivo cancer models to guide precision medicine.</a> Cancer Discovery. 7 (5), 462-477 (2017).</li><li>Fujii, E., Kato, A., Suzuki, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Patient-derived+xenograft+(PDX)+models:+Characteristics+and+points+to+consider+for+the+process+of+establishment.">Patient-derived xenograft (PDX) models: Characteristics and points to consider for the process of establishment.</a> Journal of Toxicologic Pathology. 33 (3), 153-160 (2020).</li><li>Yang, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Application+of+ovarian+cancer+organoids+in+precision+medicine:+Key+challenges+and+current+opportunities.">Application of ovarian cancer organoids in precision medicine: Key challenges and current opportunities.</a> Frontiers in Cell and Developmental Biology. 9, 701429 (2021).</li><li>Yang, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Patient-derived+organoids:+A+promising+model+for+personalized+cancer+treatment.">Patient-derived organoids: A promising model for personalized cancer treatment.</a> Gastroenterology Report. 6 (4), 243-245 (2018).</li><li>Karakasheva, T. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+and+characterization+of+patient-derived+head+and+neck,+oral,+and+esophageal+cancer+organoids.">Generation and characterization of patient-derived head and neck, oral, and esophageal cancer organoids.</a> Current Protocols in Stem Cell Biology. 53 (1), 109 (2020).</li><li>Madison, B. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Let-7+represses+carcinogenesis+and+a+stem+cell+phenotype+in+the+intestine+via+regulation+of+Hmga2.">Let-7 represses carcinogenesis and a stem cell phenotype in the intestine via regulation of Hmga2.</a> PLoS Genetics. 11 (8), 1005408 (2015).</li><li>Sato, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single+Lgr5+stem+cells+build+crypt-villus+structures+in+vitro+without+a+mesenchymal+niche.">Single Lgr5 stem cells build crypt-villus structures in vitro without a mesenchymal niche.</a> Nature. 459 (7244), 262-265 (2009).</li><li>Murray, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=HER2+and+APC+mutations+promote+altered+crypt-villus+morphology+and+marked+hyperplasia+in+the+intestinal+epithelium.">HER2 and APC mutations promote altered crypt-villus morphology and marked hyperplasia in the intestinal epithelium.</a> Cellular and Molecular Gastroenterology and Hepatology. 12 (3), 1105-1120 (2021).</li><li>Hill, S. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Prediction+of+DNA+repair+inhibitor+response+in+short-term+patient-derived+ovarian+cancer+organoids.">Prediction of DNA repair inhibitor response in short-term patient-derived ovarian cancer organoids.</a> Cancer Discovery. 8 (11), 1404-1421 (2018).</li><li>Passarelli, M. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Leucyl-tRNA+synthetase+is+a+tumour+suppressor+in+breast+cancer+and+regulates+codon-dependent+translation+dynamics.">Leucyl-tRNA synthetase is a tumour suppressor in breast cancer and regulates codon-dependent translation dynamics.</a> Nature Cell Biology. 24 (3), 307-315 (2022).</li><li>Pleguezuelos-Manzano, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Establishment+and+culture+of+human+intestinal+organoids+derived+from+adult+stem+cells.">Establishment and culture of human intestinal organoids derived from adult stem cells.</a> Current Protocols in Immunology. 130 (1), 106 (2020).</li><li>Stumm, M. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Validation+of+a+postfixation+tissue+storage+and+transport+medium+to+preserve+histopathology+and+molecular+pathology+analyses+(total+and+phosphoactivated+proteins,+and+FISH).">Validation of a postfixation tissue storage and transport medium to preserve histopathology and molecular pathology analyses (total and phosphoactivated proteins, and FISH).</a> American Journal of Clinical Pathology. 137 (3), 429-436 (2012).</li><li>Feldman, A. T., Wolfe, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tissue+processing+and+hematoxylin+and+eosin+staining.">Tissue processing and hematoxylin and eosin staining.</a> Methods in Molecular Biology. 1180, 31-43 (2014).</li><li>Ooft, S. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Patient-derived+organoids+can+predict+response+to+chemotherapy+in+metastatic+colorectal+cancer+patients.">Patient-derived organoids can predict response to chemotherapy in metastatic colorectal cancer patients.</a> Science Translational Medicine. 11 (513), (2019).</li><li>Aisenbrey, E. A., Murphy, W. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synthetic+alternatives+to+Matrigel.">Synthetic alternatives to Matrigel.</a> Nature Reviews Materials. 5 (7), 539-551 (2020).</li><li>Nanki, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Patient-derived+ovarian+cancer+organoids+capture+the+genomic+profiles+of+primary+tumours+applicable+for+drug+sensitivity+and+resistance+testing.">Patient-derived ovarian cancer organoids capture the genomic profiles of primary tumours applicable for drug sensitivity and resistance testing.</a> Scientific Reports. 10, 12581 (2020).</li><li>Mead, B. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Screening+for+modulators+of+the+cellular+composition+of+gut+epithelia+via+organoid+models+of+intestinal+stem+cell+differentiation.">Screening for modulators of the cellular composition of gut epithelia via organoid models of intestinal stem cell differentiation.</a> Nature Biomedical Engineering. 6 (4), 476-494 (2022).</li></ol>

Le cancer de l’ovaire est extrêmement mortel en raison de son stade avancé au moment du diagnostic, ainsi que du développement courant de la résistance à la chimiothérapie. De nombreux progrès dans la recherche sur le cancer de l’ovaire ont été réalisés en utilisant des lignées cellulaires cancéreuses et des modèles PDX; Cependant, il existe un besoin évident d’un modèle in vitro plus représentatif et abordable. Les AOP se sont avérées représenter avec précision l’hétérogénéité ...

En 2021, environ 21 410 femmes aux États-Unis ont reçu un diagnostic de cancer épithélial de l’ovaire et 12 940 femmes sont décédées de cette maladie1. Bien que des progrès suffisants aient été réalisés en chirurgie et en chimiothérapie, plus de 70% des patients atteints d’une maladie avancée développent une résistance chimiothérapeutique et meurent dans les 5 ans suivant le diagnostic 2,3. Ainsi, de nouvelles stratégies pour traiter cette maladie mortelle et des modèles représentatifs et fiables pour la recherche préclinique sont nécessaires de toute urgence.
Les lignées cellulaires cancéreuses et les xénogreffes dérivées de patientes (PDX) créées à partir de tumeurs ovariennes primaires sont les principaux instruments utilisés dans la recherche sur le cancer de l’ovaire. Un avantage majeur des lignées cellulaires cancéreuses est leur expansion rapide. Cependant, leur culture continue entraîne des altérations phénotypiques et génotypiques qui font que les lignées cellulaires cancéreuses s’écartent de l’échantillon original de tumeur cancéreuse primaire. En raison des différences existantes entre la lignée cellulaire cancéreuse et la tumeur primaire, les tests de médicaments qui ont des effets positifs dans les lignées cellulaires ne parviennent pas à avoir ces mêmes effets dans les essais cliniques2. Pour surmonter ces limitations, des modèles PDX sont utilisés. Ces modèles sont créés en implantant du tissu frais de cancer de l’ovaire chez des souris immunodéficientes. Comme il s’agit de modèles in vivo , ils ressemblent plus précisément aux caractéristiques biologiques humaines et, à leur tour, sont plus prédictifs des résultats des médicaments. Cependant, ces modèles présentent également des limites importantes, notamment le coût, le temps et les ressources nécessaires pour les générer4.
Les AOP offrent un modèle alternatif pour la recherche préclinique qui surmonte les limites des lignées cellulaires cancéreuses et des modèles PDX. Les AOP récapitulent la tumeur et le microenvironnement tumoral d’un patient et, ainsi, fournissent un modèle traitable in vitro idéal pour la recherche préclinique 2,3,5. Ces modèles 3D ont des capacités d’auto-organisation qui modélisent la tumeur primaire, une caractéristique que leurs homologues de lignées cellulaires bidimensionnelles (2D) ne possèdent pas. En outre, il a été démontré que ces modèles représentent génétiquement et fonctionnellement leurs tumeurs parentes et, par conséquent, sont des modèles fiables pour l’étude de nouveaux processus thérapeutiques et biologiques. En bref, ils offrent des capacités d’expansion et de stockage à long terme similaires aux lignées cellulaires, mais englobent également le microenvironnement et les interactions cellule-cellule inhérents aux modèles murins 4,6.
Le présent protocole décrit la création d’AOP à partir de tumeurs dérivées de patients, d’ascite et d’échantillons de liquide pleural avec un taux de réussite supérieur à 97%. Les cultures AOP peuvent ensuite être étendues à plusieurs générations et utilisées pour tester la sensibilité au traitement médicamenteux et les biomarqueurs prédictifs. Cette méthode représente une technique qui pourrait être utilisée pour personnaliser les traitements en fonction des réponses thérapeutiques des AOP.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>1% HEPES</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>15630080</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1% Penicillin-Streptomycin</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>30002CI</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1.5 mL Eppendorf Tubes&#160;</td>
			<td>Genesee Scientific</td>
			<td>14125</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10 cm Tissue Culture Dish&#160;</td>
			<td>TPP</td>
			<td>93100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10 mL Serological Pipet</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>100 &#181;m Cell Filter</td>
			<td>MidSci</td>
			<td>100ICS</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>15 mL centrifuge tubes</td>
			<td>Corning</td>
			<td>430052</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2 mL Cryovial</td>
			<td>Simport Scientific</td>
			<td>T301-2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2% Paraformaldehyde Fixative</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>37 &#176;C water bath&#160;</td>
			<td>NEST</td>
			<td>602052</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3dGRO R-Spondin-1 Conditioned Media Supplement</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>SCM104</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>6 well plates</td>
			<td>TPP</td>
			<td>92006</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>70% Ethanol</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>R31541GA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>A83-01</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>SML0788</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Advanced DMEM/F12</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>12634028</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agar</td>
			<td>Lamda Biotech</td>
			<td>C121</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>B-27</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>17504044</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge&#160;</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cultrex Type 2</td>
			<td>R&#38;D Systems</td>
			<td>3533-010-02</td>
			<td>basement membrane extract</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNase I</td>
			<td>New England Bio Labs</td>
			<td>M0303S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNase I Reaction Buffer</td>
			<td>New England Bio Labs</td>
			<td>M0303S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EGF</td>
			<td>PeproTech</td>
			<td>AF-100-15</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FBS&#160;</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>F2442</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FGF-10</td>
			<td>PeproTech</td>
			<td>100-26</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FGF2</td>
			<td>PeproTech</td>
			<td>100-18B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>gentleMACS C Tubes</td>
			<td>Miltenyi BioTech</td>
			<td>130-096-334</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>gentleMACS Octo Dissociator with Heaters</td>
			<td>Miltenyi BioTech</td>
			<td>130-096-427</td>
			<td>We use the manufacturers protocol.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GlutaMAX</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>35050061</td>
			<td>dipeptide, L-alanyl-L-glutamine</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hematoxylin and Eosin Staining Kit</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>NC1470670</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Histoplast Paraffin Wax</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>22900700</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microcentrifuge&#160;</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mr. Frosty Freezing Container</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>07202363S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N-acetylcysteine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A9165</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nicotinamide</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>N0636</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>p1000 Pipette with Tips&#160;</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>p200 Pipette with Tips&#160;</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pasteur Pipettes 9&#34;</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>1367820D</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>MT21031CM</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipet Controller</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Prostaglandin E2</td>
			<td>R&#38;D Systems</td>
			<td>2296</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Puromycin&#160;</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>A1113802</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recombinant Murine Noggin</td>
			<td>PeproTech</td>
			<td>250-38</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recovery Cell Culture Freezing Medium</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>12648010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Red Blood Cell Lysis Buffer</td>
			<td>BioLegend</td>
			<td>420301</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ROCK Inhibitor (Y-27632)</td>
			<td>R&#38;D Systems</td>
			<td>1254/1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SB202190</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S7076</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T75 Flask</td>
			<td>MidSci</td>
			<td>TP90076</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue Culture Hood&#160;</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue Embedding Cassette</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TrypLE Express</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>12604013</td>
			<td>animal origin-free, recombinant enzyme</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Type II Collagenase</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>17101015</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vortex</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

generation and culturing of high-grade serous ovarian cancer patient-derived organoids

Les organoïdes sont des modèles tumoraux dynamiques 3D qui peuvent être cultivés avec succès à partir de tissus tumoraux ovariens dérivés de patients, d’ascites ou de liquide pleural et aident à la découverte de nouveaux traitements et biomarqueurs prédictifs du cancer de l’ovaire. Ces modèles récapitulent l’hétérogénéité clonale, le microenvironnement tumoral et les interactions cellule-cellule et cellule-matrice. De plus, il a été démontré qu’ils correspondent à la tumeur primaire morphologiquement, cytologiquement, immunohistochimiquement et génétiquement. Ainsi, les organoïdes facilitent la recherche sur les cellules tumorales et le microenvironnement tumoral et sont supérieurs aux lignées cellulaires. Le présent protocole décrit des méthodes distinctes pour générer des organoïdes du cancer de l’ovaire dérivés de patientes à partir de tumeurs de patientes, d’ascite et d’échantillons de liquide pleural avec un taux de réussite supérieur à 97%. Les échantillons de patients sont séparés en suspensions cellulaires par digestion mécanique et enzymatique. Les cellules sont ensuite plaquées à l’aide d’un extrait de membrane basale (EMB) et sont soutenues par des milieux de croissance optimisés contenant des suppléments spécifiques à la culture du cancer de l’ovaire séreux de haut grade (HGSOC). Après avoir formé les organoïdes initiaux, les AOP peuvent soutenir la culture à long terme, y compris le passage pour l’expansion pour des expériences ultérieures.

Pour générer des AOP, les échantillons ont été digérés mécaniquement et enzymatiquement en suspensions unicellulaires. Les cellules ont ensuite été remises en suspension dans des BME et complétées par des milieux spécialement conçus (Figure 3). Les organoïdes sont généralement établis sur une période de 10 jours, après quoi ils démontrent des organoïdes discrets en culture (Figure 4).
<p class="jove_content biglegend" fo:keep-together.w...

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Generation and Culturing of High-Grade Serous Ovarian Cancer Patient-Derived Organoids

Les organoïdes dérivés de patients (AOP) sont une culture tridimensionnelle (3D) qui peut imiter l’environnement tumoral in vitro. Dans le cancer séreux de l’ovaire de haut grade, les AOP représentent un modèle pour étudier de nouveaux biomarqueurs et thérapeutiques.

Génération et culture d’organoïdes dérivés de patients atteints d’un cancer de l’ovaire séreux de haut grade

Organoids are 3D dynamic tumor models that can be grown successfully from patient-derived ovarian tumor tissue, ascites, or pleural fluid and aid in the ...

Les modèles organoïdes de conduite de patients représentent génétiquement et fonctionnellement leurs tumeurs parentes et sont donc des modèles fiables pour l’étude de nouvelles thérapies et de processus biologiques complexes dans le cancer de l’ovaire. En récapitulant l’hétérogénéité clonale, le microenvironnement tumoral et les interactions in vitro de cellule à cellule, ces modèles surmontent les limites des lignées cellulaires cancéreuses et des xénogreffes dérivées de patients. Les organoïdes dérivés de patients offrent des capacités d’expansion et de stockage à long terme et imitent la physiologie tumorale.En conséquence, ils sont des modèles idéaux pour l’étude de nouveaux traitements et biomarqueurs prédictifs. Commencez la récolte des organoïdes en plaçant les échantillons tumoraux dans une boîte de culture tissulaire de 10 centimètres et en hachant le tissu pour créer un mélange homogène à l’aide d’un scalpel jetable. Placer le mélange tissulaire homogène dans un tube de dissociation à l’aide d’une pince.Pour chaque millilitre à deux millilitres de tissu homogénéisé, ajoutez sept à huit millilitres de solution de collagénase de type deux d’un milligramme par millilitre dans un milieu de base organoïde et un millilitre de solution de DNase One. Vortex la solution à 458 G.Liquéfier le tissu pendant qu’il est dans la solution de collagénase à l’aide de la machine de dissociation. Exécutez le programme 37 C underscore H underscore TDK trois une heure jusqu’à ce qu’il s’agisse d’une suspension à une seule cellule.Une fois cela fait, transférer le mélange homogénéisé dans un nouveau tube conique de 50 millilitres. Ajouter 20 à 40 millilitres de milieu de base organoïde et vortex la solution à 458 G.Puis filtrer la solution à travers une crépine cellulaire de 100 micromètres dans un tube conique de 50 millilitres nouvellement étiqueté. Ensuite, centrifuger le mélange filtré à 1 650 g pendant cinq minutes à quatre degrés Celsius et aspirer le surnageant à l’aide d’une pipette de pâturage en verre.Préparez 100 microgrammes par millilitre de Dnase One et remettez les cellules en suspension dans un millilitre de solution de Dnase One en ajoutant goutte à goutte DNase One solution. Après 15 minutes d’incubation à température ambiante, ajoutez 25 millilitres de milieu de base organoïde aux cellules et inversez pour mélanger. Ensuite, centrifugez les cellules à 1 650 g pendant cinq minutes à quatre degrés Celsius et aspirez soigneusement le surnageant à l’aide d’une pipette de pâturage en verre.Remettez en suspension la pastille cellulaire nouvellement formée dans cinq millilitres de globules rouges préchauffés ou de tampon de lyse des globules rouges. Vortex les solutions dans chaque tube conique à 458 G et incuber pendant cinq minutes. Encore une fois, centrifuger la pastille en suspension dans un tampon de lyse de globule rouge et aspirer le surnageant à l’aide d’une pipette de pâturage en verre.Lavez la pastille avec 10 millilitres de PBS et faites tourbillonner les cellules avant la centrifugation des cellules. Pour une pastille de grande cellule, aspirez le PBS et ajoutez un millilitre du milieu de base organoïde sur le dessus de la pastille. Après avoir vortex la solution, transférer 300 à 400 microlitres de la suspension cellulaire dans un tube microcentrifugé.Après cinq minutes de centrifugation, aspirer le surnageant et le remettre en suspension dans un extrait de membrane basale, ou BME, et un milieu de base organoïde à l’aide de pointes froides. Plaquer la solution cellulaire remise en suspension dans une plaque à six puits dans des aliquotes de 40 microlitres. Plaquer jusqu’à cinq aliquotes par puits.Placez immédiatement la plaque de puits dans l’incubateur pendant 20 minutes et, après l’incubation, ajoutez doucement deux millilitres du milieu organoïde complet dans chaque puits. Ajouter un millilitre de milieu de base organoïde à chaque puits et pipeter le média de haut en bas directement sur les languettes organoïdes pour la dissociation. Recueillir tout le milieu contenant les granulés remis en suspension dans un tube conique de 15 millilitres.Ensuite, centrifuger le tube conique de 15 millilitres contenant le mélange pendant cinq minutes avant d’aspirer le surnageant. Ajouter un millilitre d’enzyme recombinante libre d’origine animale à la pastille cellulaire. Mélanger par vortex et transférer la suspension dans un tube microcentrifuge de 1,5 millilitre.Après 15 minutes d’incubation dans un bain-marie de 37 degrés Celsius et cinq minutes de centrifugation, aspirez le surnageant. Remettez la pastille en suspension dans un milieu de base BME et organoïde et plaquez la solution cellulaire remise en suspension dans une plaque à six puits dans des aliquotes de 40 microlitres. Plaquer jusqu’à cinq aliquotes par puits.Après 20 minutes d’incubation, ajoutez doucement deux millilitres du milieu organoïde complet dans chaque puits. Remettez en suspension la pastille de cellule organoïde de passage dans 0,5 à un millilitre de milieu de congélation de culture cellulaire de récupération et transférez un millilitre dans chaque flacon cryogénique avant de les transférer à moins 80 degrés et réservoir d’azote liquide pour un stockage à long terme. Décongeler les organoïdes en transférant les flacons cryogéniques stockés dans de l’azote liquide au bain-marie de 37 degrés Celsius.Une fois décongelés, transférer les organoïdes dans un tube conique de 15 millilitres et les centrifuger avant d’aspirer le surnageant. Ensuite, ajoutez un millilitre de PBS à la pastille et transférez la pastille remise en suspension dans un tube microcentrifuge de 1,5 millilitre Après centrifugation à 1 650 G pendant cinq minutes à quatre degrés Celsius, aspirez soigneusement le surnageant à l’aide d’une pipette de pâturage en verre. Resuspendre la pastille dans un milieu de base BME et organoïde et plaquer les cellules en suspension sur une plaque à six puits dans des aliquotes de 40 microlitres.Placez jusqu’à cinq aliquotes par puits. Placez immédiatement la plaque dans l’incubateur pendant 20 minutes avant d’ajouter deux millilitres de milieu organoïde complet aux puits. Les organoïdes ont été établis en 10 jours, après quoi ils ont démontré des organoïdes discrets en culture.Les cultures organoïdes dérivées de patients ont été évaluées en les incorporant dans de l’agarose et en les évaluant avec une coloration à l’hématoxyline et à l’éosine. Il est important de tenir compte des défis liés à la collaboration avec BME. La remise en suspension de la pastille cellulaire et du BME doit être effectuée sur de la glace en veillant à ce qu’aucune bulle ne se forme au cours du processus.Cette technique permet d’approfondir les recherches sur l’impact de la chimiothérapie sur la génération et le développement des organoïdes en raison des problèmes rencontrés par les patients ayant subi une chimiothérapie néoadjuvante.

Research

JoVE Journal

Cancer Research

Establishment of Gastric Cancer Patient-derived Xenograft Models and Primary Cell Lines

Établissement de modèles de xénogreffe dérivés du cancer gastrique et de lignées cellulaires primaires

The use of preclinical models to advance our understanding of tumor biology and investigate the efficacy of therapeutic agents is key to cancer research. ...

Recherche

Recherche en cancérologie

High-Throughput In Vitro Assay using Patient-Derived Tumor Organoids

High-Throughput In Vitro Assay using Patient-Derived Tumor Organoids

Test in vitro à haut débit utilisant des organoïdes tumoraux dérivés du patient

Patient-derived tumor organoids (PDOs) are expected to be a preclinical cancer model with better reproducibility of disease than traditional cell culture ...

Profiling Sensitivity to Targeted Therapies in EGFR-Mutant NSCLC Patient-Derived Organoids

Profilage de la sensibilité aux thérapies ciblées dans les organoïdes dérivés de patients atteints de CPNPC mutants EGFR

Novel 3D cancer organoid cultures derived from clinical patient specimens represent an important model system to evaluate intratumor heterogeneity and ...

Orthotopic Implantation of Patient-Derived Cancer Cells in Mice Recapitulates Advanced Colorectal Cancer

L’implantation orthotopique de cellules cancéreuses dérivées de patients chez la souris récapitule le cancer colorectal avancé

Over the last decade, more sophisticated preclinical colorectal cancer (CRC) models have been established using patient-derived cancer cells and 3D ...

Establishment and Culture of Patient-Derived Breast Organoids

Établissement et culture d’organoïdes mammaires dérivés de patientes

Breast cancer is a complex disease that has been classified into several different histological and molecular subtypes. Patient-derived breast tumor ...

Visualizing DNA Damage Repair Proteins in Patient-Derived Ovarian Cancer Organoids via Immunofluorescence Assays

Visualizing DNA Damage Repair Proteins in Patient-Derived Ovarian Cancer Organoids via Immunofluorescence Assays

Visualisation des protéines de réparation des dommages à l’ADN dans les organoïdes du cancer de l’ovaire dérivés de patients par des tests d’immunofluorescence

Immunofluorescence is one of the most widely used techniques to visualize target antigens with high sensitivity and specificity, allowing for the accurate ...

Ovarian Cancer Patient-Derived Organoid Models for Pre-Clinical Drug Testing

Ovarian cancer is a fatal gynecologic cancer and the fifth leading cause of cancer death among women in the United States. Developing new drug treatments ...

Automated Kinetic Imaging for Drug Assessment in Patient-Derived Tumor Organoids

Multiplexed Live-Cell Imaging for Drug Responses in Patient-Derived Organoid Models of Cancer

Author Spotlight: Developing Multiplexed Kinetic Assays for Organoid-Based Drug Response Analysis

Patient-derived organoid (PDO) models of cancer are a multifunctional research system that better recapitulates human disease as compared to cancer cell ...

Derivation of 3D Glioma Organoids from Chopper-Processed Patient Tumors

Cultivating Ex Vivo Patient-Derived Glioma Organoids Using a Tissue Chopper

Author Spotlight: Enhanced Generation of Patient-Derived 3D Organoids for Glioblastoma and Glioma

Glioblastoma, IDH-wild type, CNS WHO grade 4 (GBM) is a primary brain tumor associated with poor patient survival despite aggressive treatment. Developing ...

Standardizing Ovarian Cancer Organoid Biobanking

Strategy for Biobanking of Ovarian Cancer Organoids: Addressing the Interpatient Heterogeneity across Histological Subtypes and Disease Stages

Author Spotlight: Advancing Personalized Medicine in Ovarian Cancer 

Stratégie de mise en banque d’organoïdes du cancer de l’ovaire : Aborder l’hétérogénéité interpatiente entre les sous-types histologiques et les stades de la maladie

While the establishment of an ovarian cancer biobank from patient-derived organoids along with their clinical background information promises advances in ...