Name: generation and culturing of high-grade serous ovarian cancer patient-derived organoids
Uploaded: 2023-01-06T14:50:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Generation and Culturing of High-Grade Serous Ovarian Cancer Patient-Derived Organoids at JoVE.com

Wir sind dankbar für die Anleitung von Ron Bose, MD, PhD, und die Unterstützung von Barbara Blachut, MD, bei der Erstellung dieses Protokolls. Wir möchten uns auch bei der School of Medicine der Washington University in der Abteilung für Geburtshilfe und Gynäkologie und der Abteilung für gynäkologische Onkologie, dem Dean's Scholar Program der Washington University und dem Reproductive Scientist Development Program für die Unterstützung dieses Projekts bedanken.

Alle menschlichen Gewebeproben, die für Forschungszwecke gesammelt wurden, wurden gemäß dem vom Institutional Review Board (IRB) genehmigten Protokoll gewonnen. Die unten beschriebenen Protokolle wurden in einer sterilen menschlichen Gewebekulturumgebung durchgeführt. Die schriftliche Einverständniserklärung wurde von menschlichen Probanden eingeholt. Geeignete Patienten mussten eine Diagnose oder vermutete Diagnose von Eierstockkrebs haben, bereit und in der Lage sein, eine Einverständniserklärung zu unterschrei...

<ol>
	<li>Bray, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Global+cancer+statistics+2018:+GLOBOCAN+estimates+of+incidence+and+mortality+worldwide+for+36+cancers+in+185+countries.">Global cancer statistics 2018: GLOBOCAN estimates of incidence and mortality worldwide for 36 cancers in 185 countries.</a> CA: A Cancer Journal for Clinicians. 68 (6), 394-424 (2018).</li><li>Drost, J., Clevers, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Organoids+in+cancer+research.">Organoids in cancer research.</a> Nature Reviews Cancer. 18 (7), 407-418 (2018).</li><li>Pauli, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Personalized+in+vitro+and+in+vivo+cancer+models+to+guide+precision+medicine.">Personalized in vitro and in vivo cancer models to guide precision medicine.</a> Cancer Discovery. 7 (5), 462-477 (2017).</li><li>Fujii, E., Kato, A., Suzuki, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Patient-derived+xenograft+(PDX)+models:+Characteristics+and+points+to+consider+for+the+process+of+establishment.">Patient-derived xenograft (PDX) models: Characteristics and points to consider for the process of establishment.</a> Journal of Toxicologic Pathology. 33 (3), 153-160 (2020).</li><li>Yang, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Application+of+ovarian+cancer+organoids+in+precision+medicine:+Key+challenges+and+current+opportunities.">Application of ovarian cancer organoids in precision medicine: Key challenges and current opportunities.</a> Frontiers in Cell and Developmental Biology. 9, 701429 (2021).</li><li>Yang, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Patient-derived+organoids:+A+promising+model+for+personalized+cancer+treatment.">Patient-derived organoids: A promising model for personalized cancer treatment.</a> Gastroenterology Report. 6 (4), 243-245 (2018).</li><li>Karakasheva, T. 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B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Let-7+represses+carcinogenesis+and+a+stem+cell+phenotype+in+the+intestine+via+regulation+of+Hmga2.">Let-7 represses carcinogenesis and a stem cell phenotype in the intestine via regulation of Hmga2.</a> PLoS Genetics. 11 (8), 1005408 (2015).</li><li>Sato, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single+Lgr5+stem+cells+build+crypt-villus+structures+in+vitro+without+a+mesenchymal+niche.">Single Lgr5 stem cells build crypt-villus structures in vitro without a mesenchymal niche.</a> Nature. 459 (7244), 262-265 (2009).</li><li>Murray, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=HER2+and+APC+mutations+promote+altered+crypt-villus+morphology+and+marked+hyperplasia+in+the+intestinal+epithelium.">HER2 and APC mutations promote altered crypt-villus morphology and marked hyperplasia in the intestinal epithelium.</a> Cellular and Molecular Gastroenterology and Hepatology. 12 (3), 1105-1120 (2021).</li><li>Hill, S. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Prediction+of+DNA+repair+inhibitor+response+in+short-term+patient-derived+ovarian+cancer+organoids.">Prediction of DNA repair inhibitor response in short-term patient-derived ovarian cancer organoids.</a> Cancer Discovery. 8 (11), 1404-1421 (2018).</li><li>Passarelli, M. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Leucyl-tRNA+synthetase+is+a+tumour+suppressor+in+breast+cancer+and+regulates+codon-dependent+translation+dynamics.">Leucyl-tRNA synthetase is a tumour suppressor in breast cancer and regulates codon-dependent translation dynamics.</a> Nature Cell Biology. 24 (3), 307-315 (2022).</li><li>Pleguezuelos-Manzano, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Establishment+and+culture+of+human+intestinal+organoids+derived+from+adult+stem+cells.">Establishment and culture of human intestinal organoids derived from adult stem cells.</a> Current Protocols in Immunology. 130 (1), 106 (2020).</li><li>Stumm, M. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Validation+of+a+postfixation+tissue+storage+and+transport+medium+to+preserve+histopathology+and+molecular+pathology+analyses+(total+and+phosphoactivated+proteins,+and+FISH).">Validation of a postfixation tissue storage and transport medium to preserve histopathology and molecular pathology analyses (total and phosphoactivated proteins, and FISH).</a> American Journal of Clinical Pathology. 137 (3), 429-436 (2012).</li><li>Feldman, A. T., Wolfe, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tissue+processing+and+hematoxylin+and+eosin+staining.">Tissue processing and hematoxylin and eosin staining.</a> Methods in Molecular Biology. 1180, 31-43 (2014).</li><li>Ooft, S. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Patient-derived+organoids+can+predict+response+to+chemotherapy+in+metastatic+colorectal+cancer+patients.">Patient-derived organoids can predict response to chemotherapy in metastatic colorectal cancer patients.</a> Science Translational Medicine. 11 (513), (2019).</li><li>Aisenbrey, E. A., Murphy, W. 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E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Screening+for+modulators+of+the+cellular+composition+of+gut+epithelia+via+organoid+models+of+intestinal+stem+cell+differentiation.">Screening for modulators of the cellular composition of gut epithelia via organoid models of intestinal stem cell differentiation.</a> Nature Biomedical Engineering. 6 (4), 476-494 (2022).</li></ol>

Eierstockkrebs ist aufgrund seines fortgeschrittenen Stadiums bei der Diagnose sowie der häufigen Entwicklung einer Chemotherapieresistenz extrem tödlich. Viele Fortschritte in der Eierstockkrebsforschung wurden durch die Verwendung von Krebszelllinien und PDX-Modellen erzielt. Es besteht jedoch ein offensichtlicher Bedarf an einem repräsentativeren und erschwinglicheren In-vitro-Modell . PDOs repräsentieren nachweislich die Tumorheterogenität, die Tumormikroumgebung sowie die genomischen und transkriptomis...

Im Jahr 2021 wurde bei etwa 21.410 Frauen in den Vereinigten Staaten neu epithelialer Eierstockkrebs diagnostiziert, und 12.940 Frauen starben an dieser Krankheit1. Obwohl in der Chirurgie und Chemotherapie ausreichende Fortschritte erzielt wurden, entwickeln über 70% der Patienten mit fortgeschrittener Erkrankung eine chemotherapeutische Resistenz und sterben innerhalb von 5 Jahren nach der Diagnose 2,3. Neue Strategien zur Behandlung dieser tödlichen Krankheit und repräsentative, verlässliche Modelle für die präklinische Forschung sind daher dringend erforderlich.
Krebszelllinien und patientenabgeleitete Xenotransplantate (PDX), die aus primären Ovarialtumoren hergestellt werden, sind die wichtigsten Instrumente, die in der Eierstockkrebsforschung verwendet werden. Ein großer Vorteil von Krebszelllinien ist ihre schnelle Expansion. Ihre kontinuierliche Kultur führt jedoch zu phänotypischen und genotypischen Veränderungen, die dazu führen, dass die Krebszelllinien von der ursprünglichen primären Krebstumorprobe abweichen. Aufgrund der bestehenden Unterschiede zwischen der Krebszelllinie und dem Primärtumor haben Arzneimittelassays, die positive Effekte in Zelllinien haben, inklinischen Studien nicht die gleichen Effekte 2. Um diese Einschränkungen zu überwinden, werden PDX-Modelle verwendet. Diese Modelle werden erstellt, indem frisches Eierstockkrebsgewebe in immundefiziente Mäuse implantiert wird. Da es sich um In-vivo-Modelle handelt, ähneln sie den biologischen Eigenschaften des Menschen genauer und sind wiederum prädiktiver für die Ergebnisse von Arzneimitteln. Diese Modelle weisen jedoch auch erhebliche Einschränkungen auf, einschließlich der Kosten, des Zeitaufwands und der Ressourcen, die für ihre Erstellung erforderlich sind4.
PDOs bieten ein alternatives Modell für die präklinische Forschung, das die Einschränkungen sowohl von Krebszelllinien als auch von PDX-Modellen überwindet. PDOs rekapitulieren den Tumor und die Tumormikroumgebung eines Patienten und bieten somit ein in vitro kontrollierbares Modell, das sich ideal für die präklinische Forschungeignet 2,3,5. Diese 3D-Modelle verfügen über Selbstorganisationsfähigkeiten, die den Primärtumor modellieren, was ein Merkmal ist, das ihre zweidimensionalen (2D) Zelllinien-Gegenstücke nicht besitzen. Darüber hinaus wurde gezeigt, dass diese Modelle genetisch und funktionell ihre Muttertumoren repräsentieren und somit zuverlässige Modelle für die Untersuchung neuartiger Therapeutika und biologischer Prozesse sind. Kurz gesagt, sie bieten langfristige Expansions- und Speicherfähigkeiten, die denen von Zelllinien ähneln, umfassen aber auch die Mikroumgebung und die Zell-Zell-Interaktionen, die Mausmodellen innewohnen 4,6.
Das vorliegende Protokoll beschreibt die Erstellung von PDOs aus patienteneigenen Tumoren, Aszites und Pleuraflüssigkeitsproben mit einer Erfolgsrate von mehr als 97%. Die PDO-Kulturen können dann über mehrere Generationen erweitert und zum Testen der Sensitivität der medikamentösen Therapie und prädiktiver Biomarker verwendet werden. Diese Methode stellt eine Technik dar, die verwendet werden könnte, um Behandlungen basierend auf den therapeutischen Reaktionen von PDOs zu personalisieren.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>1% HEPES</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>15630080</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1% Penicillin-Streptomycin</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>30002CI</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1.5 mL Eppendorf Tubes&#160;</td>
			<td>Genesee Scientific</td>
			<td>14125</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10 cm Tissue Culture Dish&#160;</td>
			<td>TPP</td>
			<td>93100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10 mL Serological Pipet</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>100 &#181;m Cell Filter</td>
			<td>MidSci</td>
			<td>100ICS</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>15 mL centrifuge tubes</td>
			<td>Corning</td>
			<td>430052</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2 mL Cryovial</td>
			<td>Simport Scientific</td>
			<td>T301-2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2% Paraformaldehyde Fixative</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>37 &#176;C water bath&#160;</td>
			<td>NEST</td>
			<td>602052</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3dGRO R-Spondin-1 Conditioned Media Supplement</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>SCM104</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>6 well plates</td>
			<td>TPP</td>
			<td>92006</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>70% Ethanol</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>R31541GA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>A83-01</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>SML0788</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Advanced DMEM/F12</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>12634028</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agar</td>
			<td>Lamda Biotech</td>
			<td>C121</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>B-27</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>17504044</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge&#160;</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cultrex Type 2</td>
			<td>R&#38;D Systems</td>
			<td>3533-010-02</td>
			<td>basement membrane extract</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNase I</td>
			<td>New England Bio Labs</td>
			<td>M0303S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNase I Reaction Buffer</td>
			<td>New England Bio Labs</td>
			<td>M0303S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EGF</td>
			<td>PeproTech</td>
			<td>AF-100-15</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FBS&#160;</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>F2442</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FGF-10</td>
			<td>PeproTech</td>
			<td>100-26</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FGF2</td>
			<td>PeproTech</td>
			<td>100-18B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>gentleMACS C Tubes</td>
			<td>Miltenyi BioTech</td>
			<td>130-096-334</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>gentleMACS Octo Dissociator with Heaters</td>
			<td>Miltenyi BioTech</td>
			<td>130-096-427</td>
			<td>We use the manufacturers protocol.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GlutaMAX</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>35050061</td>
			<td>dipeptide, L-alanyl-L-glutamine</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hematoxylin and Eosin Staining Kit</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>NC1470670</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Histoplast Paraffin Wax</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>22900700</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microcentrifuge&#160;</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mr. Frosty Freezing Container</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>07202363S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N-acetylcysteine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A9165</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nicotinamide</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>N0636</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>p1000 Pipette with Tips&#160;</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>p200 Pipette with Tips&#160;</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pasteur Pipettes 9&#34;</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>1367820D</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>MT21031CM</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipet Controller</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Prostaglandin E2</td>
			<td>R&#38;D Systems</td>
			<td>2296</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Puromycin&#160;</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>A1113802</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recombinant Murine Noggin</td>
			<td>PeproTech</td>
			<td>250-38</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recovery Cell Culture Freezing Medium</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>12648010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Red Blood Cell Lysis Buffer</td>
			<td>BioLegend</td>
			<td>420301</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ROCK Inhibitor (Y-27632)</td>
			<td>R&#38;D Systems</td>
			<td>1254/1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SB202190</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S7076</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T75 Flask</td>
			<td>MidSci</td>
			<td>TP90076</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue Culture Hood&#160;</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue Embedding Cassette</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TrypLE Express</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>12604013</td>
			<td>animal origin-free, recombinant enzyme</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Type II Collagenase</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>17101015</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vortex</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

generation and culturing of high-grade serous ovarian cancer patient-derived organoids

Organoide sind dynamische 3D-Tumormodelle, die erfolgreich aus patientischem Ovarialtumorgewebe, Aszites oder Pleuraflüssigkeit gezüchtet werden können und bei der Entdeckung neuartiger Therapeutika und prädiktiver Biomarker für Eierstockkrebs helfen. Diese Modelle rekapitulieren die klonale Heterogenität, die Tumormikroumgebung sowie Zell-Zell- und Zell-Matrix-Interaktionen. Darüber hinaus wurde gezeigt, dass sie morphologisch, zytologisch, immunhistochemisch und genetisch mit dem Primärtumor übereinstimmen. So erleichtern Organoide die Erforschung von Tumorzellen und der Tumormikroumgebung und sind Zelllinien überlegen. Das vorliegende Protokoll beschreibt verschiedene Methoden zur Erzeugung von von Patientinnen stammenden Ovarialkarzinom-Organoiden aus Patiententumoren, Aszites und Pleuraflüssigkeitsproben mit einer Erfolgsrate von mehr als 97%. Die Patientenproben werden sowohl durch mechanischen als auch durch enzymatischen Aufschluss in zelluläre Suspensionen getrennt. Die Zellen werden dann mit einem Basalmembranextrakt (BME) plattiert und mit optimierten Wachstumsmedien unterstützt, die Nahrungsergänzungsmittel enthalten, die spezifisch für die Kultivierung von hochgradigem serösem Ovarialkarzinom (HGSOC) sind. Nach der Bildung der ersten Organoide können die PDOs eine Langzeitkultur aufrechterhalten, einschließlich der Passage zur Expansion für nachfolgende Experimente.

Um PDOs zu erzeugen, wurden die Proben mechanisch und enzymatisch zu Einzelzellsuspensionen aufgeschlossen. Die Zellen wurden dann in BME resuspendiert und mit speziell hergestellten Medien ergänzt (Abbildung 3). Organoide werden in der Regel über einen Zeitraum von 10 Tagen etabliert, danach zeigen sie diskrete Organoide in Kultur (Abbildung 4).
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/fi...

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Generation and Culturing of High-Grade Serous Ovarian Cancer Patient-Derived Organoids

Patient-derived Organoids (PDO) sind eine dreidimensionale (3D) Kultur, die die Tumorumgebung in vitro nachahmen kann. Bei hochgradigem serösem Ovarialkarzinom stellen PDOs ein Modell zur Untersuchung neuartiger Biomarker und Therapeutika dar.

Erzeugung und Kultivierung von hochgradigen serösen Ovarialkarzinom-Organoiden, die von Patientinnen stammen

Organoids are 3D dynamic tumor models that can be grown successfully from patient-derived ovarian tumor tissue, ascites, or pleural fluid and aid in the ...

Patienten-Drive-Organoid-Modelle repräsentieren genetisch und funktionell ihre Muttertumoren und sind daher zuverlässige Modelle für die Untersuchung neuartiger Therapeutika und komplexer biologischer Prozesse bei Eierstockkrebs. Durch die Rekapitulation der klonalen Heterogenität, der Tumormikroumgebung und der In-vitro-Zell-zu-Zell-Interaktionen überwinden diese Modelle die Einschränkungen von Krebszelllinien und von Patienten stammenden Xenotransplantaten. Von Patienten abgeleitete Organoide bieten langfristige Expansions- und Speichermöglichkeiten und ahmen die Tumorphysiologie nach.Daher sind sie ideale Modelle für die Untersuchung neuartiger Therapeutika und prädiktiver Biomarker. Beginnen Sie mit der Ernte der Organoide, indem Sie die Tumorproben in eine 10-Zentimeter-Gewebekulturschale geben und das Gewebe mit einem Einwegskalpell zu einer homogenen Mischung zerkleinern. Legen Sie die homogene Gewebemischung mit einer Pinzette in ein Dissoziationsröhrchen.Für jeweils ein bis zwei Milliliter homogenisiertes Gewebe fügen Sie sieben bis acht Milliliter eines Milligramms pro Milliliter Kollagenaselösung vom Typ zwei in organoidem Basismedium und einen Milliliter DNase One-Lösung hinzu. Wirbeln Sie die Lösung bei 458 G.Verflüssigen Sie das Gewebe, während es sich in der Kollagenase-Lösung befindet, mit der Dissoziationsmaschine. Führen Sie das Programm 37 C Unterstrich H Unterstrich TDK drei eine Stunde lang aus, bis es sich um eine Einzelzellsuspension handelt.Wenn Sie fertig sind, geben Sie die homogenisierte Mischung in ein neues konisches 50-Milliliter-Röhrchen. Fügen Sie 20 bis 40 Milliliter organoides Basismedium hinzu und wirbeln Sie die Lösung bei 458 G.Dann filtrieren Sie die Lösung durch ein 100-Mikrometer-Zellsieb in ein neu beschriftetes konisches 50-Milliliter-Röhrchen. Anschließend wird die filtrierte Mischung bei 1.650 G fünf Minuten lang bei vier Grad Celsius zentrifugiert und der Überstand mit einer Weidepipette aus Glas abgesaugt.Bereiten Sie 100 Mikrogramm pro Milliliter Dnase One vor und resuspendieren Sie die Zellen in einem Milliliter Dnase One-Lösung, indem Sie tropfenweise DNase One-Lösung hinzufügen. Nach 15 Minuten Inkubation bei Raumtemperatur 25 Milliliter organoides Basismedium in die Zellen geben und umdrehen, um sich zu vermischen. Zentrifugieren Sie dann die Zellen bei 1.650 G fünf Minuten lang bei vier Grad Celsius und saugen Sie den Überstand vorsichtig mit einer Glasweidepipette ab.Resuspendieren Sie das neu gebildete Zellpellet in fünf Millilitern vorgewärmten roten Blutkörperchen oder Erythrozyten-Lysepuffer. Die Lösungen in jedem konischen Röhrchen bei 458 G wirbeln und fünf Minuten inkubieren. Das in Erythrozyten-Lysepuffer suspendierte Pellet wird erneut zentrifugiert und der Überstand mit einer Weidepipette aus Glas abgesaugt.Waschen Sie das Pellet mit 10 Milliliter PBS und wirbeln Sie die Zellen vor dem Zentrifugieren der Zellen. Für ein großzelliges Pellet saugen Sie das PBS ab und geben Sie einen Milliliter des organoiden Basismediums auf das Pellet. Nach dem Vortexen der Lösung werden 300 bis 400 Mikroliter der Zellsuspension in ein Mikrozentrifugenröhrchen überführt.Nach fünfminütiger Zentrifugation wird der Überstand abgesaugt und mit kalten Spitzen in Basalmembranextrakt (BME) und organoidem Basismedium resuspendiert. Die resuspendierte Zelllösung wird in eine Platte mit sechs Vertiefungen in 40-Mikroliter-Aliquoten gefüllt. Platten mit bis zu fünf Aliquoten pro Vertiefung.Legen Sie die Well-Platte sofort für 20 Minuten in den Inkubator und geben Sie nach der Inkubation vorsichtig zwei Milliliter des gesamten organoiden Mediums in jede Vertiefung. Geben Sie einen Milliliter Organoid-Basismedium in jede Vertiefung und pipettieren Sie das Medium zur Dissoziation direkt auf die Organoid-Tabs. Sammeln Sie das gesamte Medium, das die resuspendierten Pellets enthält, in einem konischen 15-Milliliter-Röhrchen.Zentrifugieren Sie dann das konische 15-Milliliter-Röhrchen mit der Mischung fünf Minuten lang, bevor Sie den Überstand absaugen. Fügen Sie dem Zellpellet einen Milliliter freies rekombinantes Enzym tierischen Ursprungs hinzu. Durch Vortexen mischen und die Suspension in ein 1,5-Milliliter-Mikrozentrifugenröhrchen überführen.Nach 15 Minuten Inkubation in einem Wasserbad bei 37 Grad Celsius und fünf Minuten Zentrifugation den Überstand absaugen. Resuspendieren Sie das Pellet in BME und organoidem Basismedium und füllen Sie die resuspendierte Zelllösung in eine Sechs-Well-Platte in 40-Mikroliter-Aliquots. Platten mit bis zu fünf Aliquoten pro Vertiefung.Geben Sie nach 20 Minuten Inkubation vorsichtig zwei Milliliter des gesamten organoiden Mediums in jede Vertiefung. Resuspendieren Sie das Passage-Organoid-Zellpellet in 0,5 bis einem Milliliter Recovery Cell Culture Freezing Medium und geben Sie einen Milliliter in jedes Kryofläschchen, bevor Sie es zur Langzeitlagerung auf minus 80 Grad und Flüssigstickstofftank überführen. Tauen Sie die Organoide auf, indem Sie die in flüssigem Stickstoff gelagerten Kryofläschchen in ein 37 Grad Celsius warmes Wasserbad überführen.Nach dem Auftauen werden die Organoide in ein konisches 15-Milliliter-Röhrchen überführt und zentrifugiert, bevor der Überstand abgesaugt wird. Als nächstes geben Sie einen Milliliter PBS in das Pellet und überführen das resuspendierte Pellet in ein 1,5-Milliliter-Mikrozentrifugenröhrchen. Nach der Zentrifugation bei 1.650 G für fünf Minuten bei vier Grad Celsius saugen Sie den Überstand vorsichtig mit einer Glasweidepipette ab. Resuspendieren Sie das Pellet in BME und organoidem Basismedium und plattieren Sie die resuspendierten Zellen in 40-Mikroliter-Aliquoten auf eine Platte mit sechs Vertiefungen.Platzieren Sie bis zu fünf Aliquote pro Vertiefung. Legen Sie die Platte sofort für 20 Minuten in den Inkubator, bevor Sie zwei Milliliter vollständiges organoides Medium in die Vertiefungen geben. Organoide wurden über 10 Tage etabliert, danach zeigten sie diskrete Organoide in Kultur.Von Patienten stammende Organoidkulturen wurden bewertet, indem sie in Agarose eingebettet und mit Hämatoxylin- und Eosinfärbung bewertet wurden. Es ist wichtig, die Herausforderungen der Zusammenarbeit mit BME zu berücksichtigen. Die Resuspension des Zellpellets und des BME muss auf Eis erfolgen, um sicherzustellen, dass sich dabei keine Blasen bilden.Diese Technik ermöglicht weitere Untersuchungen zu den Auswirkungen der Chemotherapie auf die Erzeugung und Entwicklung von Organoiden aufgrund der Probleme, mit denen Patienten konfrontiert sind, die sich einer neoadjuvanten Chemotherapie unterzogen haben.

Research

JoVE Journal

Cancer Research

Establishment of Gastric Cancer Patient-derived Xenograft Models and Primary Cell Lines

Etablierung von vom Magenkrebs abgeleiteten Xenograft-Modellen und Primärzelllinien

The use of preclinical models to advance our understanding of tumor biology and investigate the efficacy of therapeutic agents is key to cancer research. ...

Forschung

Krebsforschung

High-Throughput In Vitro Assay using Patient-Derived Tumor Organoids

High-Throughput In Vitro Assay using Patient-Derived Tumor Organoids

Hochdurchsatz-In-vitro-Assay mit patientenabgeleiteten Tumororganoiden

Patient-derived tumor organoids (PDOs) are expected to be a preclinical cancer model with better reproducibility of disease than traditional cell culture ...

Profiling Sensitivity to Targeted Therapies in EGFR-Mutant NSCLC Patient-Derived Organoids

Profiling der Sensitivität gegenüber zielgerichteten Therapien in EGFR-mutierten NSCLC-patientenabgeleiteten Organoiden

Novel 3D cancer organoid cultures derived from clinical patient specimens represent an important model system to evaluate intratumor heterogeneity and ...

Orthotopic Implantation of Patient-Derived Cancer Cells in Mice Recapitulates Advanced Colorectal Cancer

Orthotope Implantation von patienteneigenen Krebszellen in Mäusen rekapituliert fortgeschrittenen Darmkrebs

Over the last decade, more sophisticated preclinical colorectal cancer (CRC) models have been established using patient-derived cancer cells and 3D ...

Establishment and Culture of Patient-Derived Breast Organoids

Etablierung und Kultivierung von patienteneigenen Brustorganoiden

Breast cancer is a complex disease that has been classified into several different histological and molecular subtypes. Patient-derived breast tumor ...

Visualizing DNA Damage Repair Proteins in Patient-Derived Ovarian Cancer Organoids via Immunofluorescence Assays

Visualizing DNA Damage Repair Proteins in Patient-Derived Ovarian Cancer Organoids via Immunofluorescence Assays

Visualisierung von Proteinen zur Reparatur von DNA-Schäden in patienteneigenen Ovarialkarzinom-Organoiden mittels Immunfluoreszenz-Assays

Immunofluorescence is one of the most widely used techniques to visualize target antigens with high sensitivity and specificity, allowing for the accurate ...

Ovarian Cancer Patient-Derived Organoid Models for Pre-Clinical Drug Testing

Ovarian cancer is a fatal gynecologic cancer and the fifth leading cause of cancer death among women in the United States. Developing new drug treatments ...

Automated Kinetic Imaging for Drug Assessment in Patient-Derived Tumor Organoids

Multiplexed Live-Cell Imaging for Drug Responses in Patient-Derived Organoid Models of Cancer

Author Spotlight: Developing Multiplexed Kinetic Assays for Organoid-Based Drug Response Analysis

Patient-derived organoid (PDO) models of cancer are a multifunctional research system that better recapitulates human disease as compared to cancer cell ...

Derivation of 3D Glioma Organoids from Chopper-Processed Patient Tumors

Cultivating Ex Vivo Patient-Derived Glioma Organoids Using a Tissue Chopper

Author Spotlight: Enhanced Generation of Patient-Derived 3D Organoids for Glioblastoma and Glioma

Glioblastoma, IDH-wild type, CNS WHO grade 4 (GBM) is a primary brain tumor associated with poor patient survival despite aggressive treatment. Developing ...

Standardizing Ovarian Cancer Organoid Biobanking

Strategy for Biobanking of Ovarian Cancer Organoids: Addressing the Interpatient Heterogeneity across Histological Subtypes and Disease Stages

Author Spotlight: Advancing Personalized Medicine in Ovarian Cancer 

Strategie für das Biobanking von Ovarialkarzinom-Organoiden: Berücksichtigung der Heterogenität zwischen Patienten über histologische Subtypen und Krankheitsstadien hinweg

While the establishment of an ovarian cancer biobank from patient-derived organoids along with their clinical background information promises advances in ...