Name: generation and culturing of high-grade serous ovarian cancer patient-derived organoids
Uploaded: 2023-01-06T14:50:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Generation and Culturing of High-Grade Serous Ovarian Cancer Patient-Derived Organoids at JoVE.com

אנו אסירי תודה על הדרכתו של רון בוס, MD, PhD, ועל עזרתה של ברברה בלאחוט, MD, בביסוס פרוטוקול זה. ברצוננו גם להודות לבית הספר לרפואה של אוניברסיטת וושינגטון במחלקה למיילדות וגינקולוגיה בסנט לואיס ולמחלקה לאונקולוגיה גינקולוגית, לתוכנית מלגות הדיקן של אוניברסיטת וושינגטון ולתוכנית לפיתוח מדעני פוריות על תמיכתם בפרויקט זה.

כל דגימות הרקמה האנושית שנאספו למחקר התקבלו על פי פרוטוקול שאושר על ידי מועצת הביקורת המוסדית (IRB). הפרוטוקולים המתוארים להלן בוצעו בסביבת תרבית רקמה אנושית סטרילית. הסכמה מדעת בכתב התקבלה מנבדקים אנושיים. מטופלות זכאיות היו צריכות לקבל אבחנה או אבחנה משוערת של סרטן השחלות, להיות מוכנות ו?...

<ol>
	<li>Bray, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Global+cancer+statistics+2018:+GLOBOCAN+estimates+of+incidence+and+mortality+worldwide+for+36+cancers+in+185+countries.">Global cancer statistics 2018: GLOBOCAN estimates of incidence and mortality worldwide for 36 cancers in 185 countries.</a> CA: A Cancer Journal for Clinicians. 68 (6), 394-424 (2018).</li><li>Drost, J., Clevers, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Organoids+in+cancer+research.">Organoids in cancer research.</a> Nature Reviews Cancer. 18 (7), 407-418 (2018).</li><li>Pauli, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Personalized+in+vitro+and+in+vivo+cancer+models+to+guide+precision+medicine.">Personalized in vitro and in vivo cancer models to guide precision medicine.</a> Cancer Discovery. 7 (5), 462-477 (2017).</li><li>Fujii, E., Kato, A., Suzuki, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Patient-derived+xenograft+(PDX)+models:+Characteristics+and+points+to+consider+for+the+process+of+establishment.">Patient-derived xenograft (PDX) models: Characteristics and points to consider for the process of establishment.</a> Journal of Toxicologic Pathology. 33 (3), 153-160 (2020).</li><li>Yang, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Application+of+ovarian+cancer+organoids+in+precision+medicine:+Key+challenges+and+current+opportunities.">Application of ovarian cancer organoids in precision medicine: Key challenges and current opportunities.</a> Frontiers in Cell and Developmental Biology. 9, 701429 (2021).</li><li>Yang, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Patient-derived+organoids:+A+promising+model+for+personalized+cancer+treatment.">Patient-derived organoids: A promising model for personalized cancer treatment.</a> Gastroenterology Report. 6 (4), 243-245 (2018).</li><li>Karakasheva, T. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+and+characterization+of+patient-derived+head+and+neck,+oral,+and+esophageal+cancer+organoids.">Generation and characterization of patient-derived head and neck, oral, and esophageal cancer organoids.</a> Current Protocols in Stem Cell Biology. 53 (1), 109 (2020).</li><li>Madison, B. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Let-7+represses+carcinogenesis+and+a+stem+cell+phenotype+in+the+intestine+via+regulation+of+Hmga2.">Let-7 represses carcinogenesis and a stem cell phenotype in the intestine via regulation of Hmga2.</a> PLoS Genetics. 11 (8), 1005408 (2015).</li><li>Sato, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single+Lgr5+stem+cells+build+crypt-villus+structures+in+vitro+without+a+mesenchymal+niche.">Single Lgr5 stem cells build crypt-villus structures in vitro without a mesenchymal niche.</a> Nature. 459 (7244), 262-265 (2009).</li><li>Murray, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=HER2+and+APC+mutations+promote+altered+crypt-villus+morphology+and+marked+hyperplasia+in+the+intestinal+epithelium.">HER2 and APC mutations promote altered crypt-villus morphology and marked hyperplasia in the intestinal epithelium.</a> Cellular and Molecular Gastroenterology and Hepatology. 12 (3), 1105-1120 (2021).</li><li>Hill, S. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Prediction+of+DNA+repair+inhibitor+response+in+short-term+patient-derived+ovarian+cancer+organoids.">Prediction of DNA repair inhibitor response in short-term patient-derived ovarian cancer organoids.</a> Cancer Discovery. 8 (11), 1404-1421 (2018).</li><li>Passarelli, M. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Leucyl-tRNA+synthetase+is+a+tumour+suppressor+in+breast+cancer+and+regulates+codon-dependent+translation+dynamics.">Leucyl-tRNA synthetase is a tumour suppressor in breast cancer and regulates codon-dependent translation dynamics.</a> Nature Cell Biology. 24 (3), 307-315 (2022).</li><li>Pleguezuelos-Manzano, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Establishment+and+culture+of+human+intestinal+organoids+derived+from+adult+stem+cells.">Establishment and culture of human intestinal organoids derived from adult stem cells.</a> Current Protocols in Immunology. 130 (1), 106 (2020).</li><li>Stumm, M. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Validation+of+a+postfixation+tissue+storage+and+transport+medium+to+preserve+histopathology+and+molecular+pathology+analyses+(total+and+phosphoactivated+proteins,+and+FISH).">Validation of a postfixation tissue storage and transport medium to preserve histopathology and molecular pathology analyses (total and phosphoactivated proteins, and FISH).</a> American Journal of Clinical Pathology. 137 (3), 429-436 (2012).</li><li>Feldman, A. T., Wolfe, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tissue+processing+and+hematoxylin+and+eosin+staining.">Tissue processing and hematoxylin and eosin staining.</a> Methods in Molecular Biology. 1180, 31-43 (2014).</li><li>Ooft, S. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Patient-derived+organoids+can+predict+response+to+chemotherapy+in+metastatic+colorectal+cancer+patients.">Patient-derived organoids can predict response to chemotherapy in metastatic colorectal cancer patients.</a> Science Translational Medicine. 11 (513), (2019).</li><li>Aisenbrey, E. A., Murphy, W. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synthetic+alternatives+to+Matrigel.">Synthetic alternatives to Matrigel.</a> Nature Reviews Materials. 5 (7), 539-551 (2020).</li><li>Nanki, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Patient-derived+ovarian+cancer+organoids+capture+the+genomic+profiles+of+primary+tumours+applicable+for+drug+sensitivity+and+resistance+testing.">Patient-derived ovarian cancer organoids capture the genomic profiles of primary tumours applicable for drug sensitivity and resistance testing.</a> Scientific Reports. 10, 12581 (2020).</li><li>Mead, B. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Screening+for+modulators+of+the+cellular+composition+of+gut+epithelia+via+organoid+models+of+intestinal+stem+cell+differentiation.">Screening for modulators of the cellular composition of gut epithelia via organoid models of intestinal stem cell differentiation.</a> Nature Biomedical Engineering. 6 (4), 476-494 (2022).</li></ol>

סרטן השחלות קטלני ביותר בשל השלב המתקדם שלו באבחון, כמו גם ההתפתחות הנפוצה של עמידות לכימותרפיה. התקדמות רבה במחקר סרטן השחלות נעשתה על ידי שימוש בקווי תאים סרטניים ומודלים PDX; עם זאת, יש צורך ברור במודל ייצוגי יותר ובמחיר סביר יותר במבחנה . PDOs הוכיחו שהם מייצגים במדויק את ההטרוגניות ש?...

בשנת 2021, כ-21,410 נשים בארה"ב אובחנו לאחרונה עם סרטן שחלות אפיתל, ו-12,940 נשים נפטרו ממחלה זו1. למרות התקדמות מספקת נעשו בניתוחים וכימותרפיה, מעל 70% מהחולים עם מחלה מתקדמת לפתח עמידות כימותרפית למות בתוך 5 שנים של אבחנה 2,3. לפיכך, יש צורך דחוף באסטרטגיות חדשות לטיפול במחלה קטלנית זו ובמודלים מייצגים ואמינים למחקר פרה-קליני.
קווי תאים סרטניים וקסנוגרפטים שמקורם במטופלות (PDX) שנוצרו מגידולים ראשוניים בשחלות הם המכשירים העיקריים המשמשים במחקר סרטן השחלות. יתרון מרכזי של קווי תאים סרטניים הוא ההתרחבות המהירה שלהם. עם זאת, התרבית המתמשכת שלהם גורמת לשינויים פנוטיפיים וגנוטיפיים הגורמים לקווי התאים הסרטניים לסטות מדגימת הגידול הסרטני הראשונית המקורית. בשל ההבדלים הקיימים בין קו התאים הסרטניים לבין הגידול הראשוני, בדיקות תרופות שיש להן השפעות חיוביות בשורות תאים אינן מצליחות להשיג את אותן השפעות בניסויים קליניים2. כדי להתגבר על מגבלות אלה, מודלים PDX משמשים. מודלים אלה נוצרים על ידי השתלת רקמת סרטן שחלה טרייה בעכברים מדוכאי חיסון. מכיוון שהם מודלים in vivo , הם דומים יותר למאפיינים ביולוגיים אנושיים, ובתורם, מנבאים יותר את תוצאות התרופות. עם זאת, למודלים אלה יש גם מגבלות משמעותיות, כולל העלות, הזמן והמשאבים הדרושים כדי לייצר אותם4.
PDOs מציעים מודל חלופי למחקר פרה-קליני המתגבר על המגבלות של קווי תאים סרטניים ומודלים של PDX. PDOs משחזרים את הגידול ואת המיקרו-סביבה של המטופל, ובכך מספקים מודל טרקטיבי במבחנה אידיאלי למחקר פרה-קליני 2,3,5. למודלים תלת-ממדיים אלה יש יכולות ארגון עצמי המדמים את הגידול הראשוני, תכונה שאין לעמיתיהם בקו התא הדו-ממדי (2D). יתר על כן, מודלים אלה הוכחו כמייצגים גנטית ותפקודית את גידולי האב שלהם, ולכן הם מודלים אמינים לחקר טיפולים חדשניים ותהליכים ביולוגיים. בקיצור, הם מציעים יכולות הרחבה ואחסון ארוכות טווח הדומות לקווי תאים, אך גם מקיפות את המיקרו-סביבה ואת אינטראקציות התא-תא הטבועות בדגמי עכברים 4,6.
הפרוטוקול הנוכחי מתאר את היצירה של PDOs מגידולים, מיימת ודגימות נוזל פלאורלי שמקורם במטופל עם שיעור הצלחה גבוה מ-97%. לאחר מכן ניתן להרחיב את תרביות ה-PDO למשך דורות רבים ולהשתמש בהן לבדיקת רגישות לטיפול תרופתי וסמנים ביולוגיים מנבאים. שיטה זו מייצגת טכניקה שניתן להשתמש בה כדי להתאים אישית טיפולים המבוססים על התגובות הטיפוליות של PDOs.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>1% HEPES</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>15630080</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1% Penicillin-Streptomycin</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>30002CI</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1.5 mL Eppendorf Tubes&#160;</td>
			<td>Genesee Scientific</td>
			<td>14125</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10 cm Tissue Culture Dish&#160;</td>
			<td>TPP</td>
			<td>93100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10 mL Serological Pipet</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>100 &#181;m Cell Filter</td>
			<td>MidSci</td>
			<td>100ICS</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>15 mL centrifuge tubes</td>
			<td>Corning</td>
			<td>430052</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2 mL Cryovial</td>
			<td>Simport Scientific</td>
			<td>T301-2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2% Paraformaldehyde Fixative</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>37 &#176;C water bath&#160;</td>
			<td>NEST</td>
			<td>602052</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3dGRO R-Spondin-1 Conditioned Media Supplement</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>SCM104</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>6 well plates</td>
			<td>TPP</td>
			<td>92006</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>70% Ethanol</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>R31541GA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>A83-01</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>SML0788</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Advanced DMEM/F12</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>12634028</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agar</td>
			<td>Lamda Biotech</td>
			<td>C121</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>B-27</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>17504044</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge&#160;</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cultrex Type 2</td>
			<td>R&#38;D Systems</td>
			<td>3533-010-02</td>
			<td>basement membrane extract</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNase I</td>
			<td>New England Bio Labs</td>
			<td>M0303S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNase I Reaction Buffer</td>
			<td>New England Bio Labs</td>
			<td>M0303S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EGF</td>
			<td>PeproTech</td>
			<td>AF-100-15</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FBS&#160;</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>F2442</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FGF-10</td>
			<td>PeproTech</td>
			<td>100-26</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FGF2</td>
			<td>PeproTech</td>
			<td>100-18B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>gentleMACS C Tubes</td>
			<td>Miltenyi BioTech</td>
			<td>130-096-334</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>gentleMACS Octo Dissociator with Heaters</td>
			<td>Miltenyi BioTech</td>
			<td>130-096-427</td>
			<td>We use the manufacturers protocol.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GlutaMAX</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>35050061</td>
			<td>dipeptide, L-alanyl-L-glutamine</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hematoxylin and Eosin Staining Kit</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>NC1470670</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Histoplast Paraffin Wax</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>22900700</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microcentrifuge&#160;</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mr. Frosty Freezing Container</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>07202363S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N-acetylcysteine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A9165</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nicotinamide</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>N0636</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>p1000 Pipette with Tips&#160;</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>p200 Pipette with Tips&#160;</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pasteur Pipettes 9&#34;</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>1367820D</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>MT21031CM</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipet Controller</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Prostaglandin E2</td>
			<td>R&#38;D Systems</td>
			<td>2296</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Puromycin&#160;</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>A1113802</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recombinant Murine Noggin</td>
			<td>PeproTech</td>
			<td>250-38</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recovery Cell Culture Freezing Medium</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>12648010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Red Blood Cell Lysis Buffer</td>
			<td>BioLegend</td>
			<td>420301</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ROCK Inhibitor (Y-27632)</td>
			<td>R&#38;D Systems</td>
			<td>1254/1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SB202190</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S7076</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T75 Flask</td>
			<td>MidSci</td>
			<td>TP90076</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue Culture Hood&#160;</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue Embedding Cassette</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TrypLE Express</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>12604013</td>
			<td>animal origin-free, recombinant enzyme</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Type II Collagenase</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>17101015</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vortex</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

generation and culturing of high-grade serous ovarian cancer patient-derived organoids

אורגנואידים הם מודלים תלת-ממדיים של גידולים דינמיים שניתן לגדל בהצלחה מרקמת גידול שחלה שמקורה במטופלת, מיימת או נוזל פלאורלי ולסייע בגילוי טיפולים חדשניים וסמנים ביולוגיים מנבאים לסרטן השחלות. מודלים אלה משחזרים הטרוגניות שבטית (clonal heterogeneity), את המיקרו-סביבה של הגידול (tumor microenvironment) ואת האינטראקציות בין תאים לתאים ולמטריצות תאים. בנוסף, הם הוכחו כמתאימים לגידול הראשוני מבחינה מורפולוגית, ציטולוגית, אימונוהיסטוכימית וגנטית. לפיכך, אורגנואידים מאפשרים מחקר על תאי הגידול ועל המיקרו-סביבה של הגידול והם עדיפים על קווי תאים. הפרוטוקול הנוכחי מתאר שיטות שונות ליצירת אורגנואידים של סרטן השחלות שמקורם במטופלות מגידולים, מיימת ודגימות נוזל פלאורלי עם שיעור הצלחה גבוה מ-97%. דגימות המטופל מופרדות לתרחיפים תאיים על ידי עיכול מכני ואנזימטי כאחד. לאחר מכן התאים מצופים באמצעות תמצית קרום מרתף (BME) ונתמכים במצע גדילה אופטימלי המכיל תוספים ספציפיים לגידול סרטן שחלות סרוסי בדרגה גבוהה (HGSOC). לאחר יצירת אורגנואידים ראשוניים, PDOs יכולים לקיים תרבית ארוכת טווח, כולל מעבר להרחבה לניסויים הבאים.

כדי ליצור PDOs, הדגימות עוכלו באופן מכני ואנזימטי לתרחיפים חד-תאיים. התאים הושעו מחדש ב-BME ונוספו להם מדיה מהונדסת במיוחד (איור 3). אורגנואידים נוצרים בדרך כלל על פני מסגרת זמן של 10 ימים, שלאחריה הם מדגימים אורגנואידים נפרדים בתרבית (איור 4).
<p class="jove_content biglegend" ...

Watch this Scientific Journal Video about Generation and Culturing of High-Grade Serous Ovarian Cancer Patient-Derived Organoids at JoVE.com

Generation and Culturing of High-Grade Serous Ovarian Cancer Patient-Derived Organoids

אורגנואידים שמקורם בחולה (PDO) הם תרבית תלת ממדית (3D) שיכולה לחקות את סביבת הגידול במבחנה. בסרטן שחלות סרוסי בדרגה גבוהה, PDOs מייצגים מודל לחקר סמנים ביולוגיים וטיפולים חדשים.

יצירה וטיפוח של אורגנואידים שמקורם בסרטן השחלות הסרוסי ברמה גבוהה

Organoids are 3D dynamic tumor models that can be grown successfully from patient-derived ovarian tumor tissue, ascites, or pleural fluid and aid in the ...

מודלים אורגנואידים מניעים של מטופלים מייצגים גנטית ותפקודית את גידולי האב שלהם ולכן הם מודלים אמינים לחקר טיפולים חדשניים ותהליכים ביולוגיים מורכבים בסרטן השחלות. על ידי שחזור הטרוגניות שבטית (clonal heterogeneity), המיקרו-סביבה של הגידול ואינטראקציות בין תאים במבחנה לתאים, מודלים אלה מתגברים על המגבלות של קווי תאים סרטניים ושל קסנוגרפטים שמקורם במטופלים. אורגנואידים שמקורם במטופל מציעים יכולות הרחבה ואחסון ארוכות טווח ומחקים את הפיזיולוגיה של הגידול.כתוצאה מכך, הם מודלים אידיאליים לחקר טיפולים חדשניים וסמנים ביולוגיים מנבאים. התחל לקצור את האורגנואידים על ידי הנחת דגימות הגידול בצלחת תרבית רקמה של 10 ס"מ וטחינת הרקמה ליצירת תערובת הומוגנית באמצעות אזמל חד פעמי. מניחים את תערובת הרקמה ההומוגנית לתוך צינור דיסוציאציה באמצעות מלקחיים.עבור כל מיליליטר עד שני מיליליטר של רקמה הומוגנית, הוסף שבעה עד שמונה מיליליטר של מיליגרם אחד למיליליטר מסוג שני תמיסת קולגנאז בתווך בסיס אורגנואיד ומיליליטר אחד של תמיסת DNase One. מערבלים את התמיסה ב 458 G.Liquefy הרקמה בזמן שהיא בתמיסת collagenase באמצעות מכונת דיסוציאציה. הפעל את התוכנית 37 C קו תחתון H קו תחתון TDK שלוש שעה אחת עד שהוא השעיה תא יחיד.לאחר שתסיים, העבר את התערובת ההומוגנית לצינור חרוטי חדש של 50 מיליליטר. הוסף 20 עד 40 מיליליטר של תווך בסיס אורגנואיד ומערבל את התמיסה ב 458 G.לאחר מכן סנן את התמיסה דרך מסננת תאים 100 מיקרומטר לתוך צינור חרוטי 50 מיליליטר שכותרתו לאחרונה. לאחר מכן, צנטריפוגו את התערובת המסוננת ב 1, 650 גרם במשך חמש דקות בארבע מעלות צלזיוס ושאפו את supernatant באמצעות פיפטה מרעה זכוכית.הכינו 100 מיקרוגרם למיליליטר Dnase One והשהו מחדש את התאים במיליליטר אחד של תמיסת Dnase One על ידי הוספת תמיסת DNase One חכמה טיפה. לאחר 15 דקות של דגירה בטמפרטורת החדר להוסיף 25 מיליליטר של תווך בסיס אורגנואיד לתאים ולהפוך כדי לערבב. לאחר מכן צנטריפוגו את התאים ב 1, 650 גרם במשך חמש דקות בארבע מעלות צלזיוס בזהירות לשאוף את supernatant באמצעות פיפטה מרעה זכוכית.השהה מחדש את גלולת התא החדשה שנוצרה בחמישה מיליליטר של תאי דם אדומים שחוממו מראש או חיץ ליזיס RBC. מערבבים את התמיסות בכל צינור חרוטי ב 458 G ודגרים במשך חמש דקות. שוב, צנטריפוגו את הגלולה התלויה בחיץ הליזיס RBC ושאפו את הסופרנאטנט באמצעות פיפטת מרעה זכוכית.לשטוף את הגלולה עם PBS 10 מיליליטר ולסובב את התאים לפני צנטריפוגה של התאים. עבור כדורית תא גדול, שאפו את PBS והוסיפו מיליליטר אחד של תווך בסיס האורגנואיד על גבי הכדורית. לאחר ערבול התמיסה, מעבירים 300 עד 400 מיקרוליטר של תרחיף התא לצינור מיקרוצנטריפוגה.לאחר חמש דקות של צנטריפוגה, שאפו את הסופרנאטנט והשעו אותו מחדש בתמצית קרום מרתף, או BME, ומדיום בסיס אורגנואידי באמצעות קצוות קרים. צלחת את תמיסת התא resuspended לתוך צלחת שש בארות ב 40 microliter aliquots. צלחת עד חמישה aliquots לכל באר.מניחים מיד את צלחת הבאר באינקובטור למשך 20 דקות, ולאחר הדגירה, מוסיפים בעדינות שני מיליליטר של מדיום אורגנואיד שלם לכל באר. הוסף מיליליטר אחד של מדיום בסיס אורגנואיד לכל באר ופיפט את המדיה למעלה ולמטה ישירות על לשוניות האורגנואידים לדיסוציאציה. לאסוף את כל המדיום המכיל את כדורי resuspended בצינור חרוטי 15 מיליליטר.לאחר מכן, צנטריפוגו את הצינור החרוטי 15 מיליליטר המכיל את התערובת במשך חמש דקות לפני שואפים את הסופרנטנט. הוסף מיליליטר אחד של אנזים רקומביננטי חופשי מן החי לכדורית התא. מערבבים על ידי מערבולות ומעבירים את המתלה לצינור מיקרוצנטריפוגה 1.5 מיליליטר.לאחר 15 דקות של דגירה באמבט מים של 37 מעלות צלזיוס וחמש דקות של צנטריפוגה, שאפו את הסופרנטנט. השהה מחדש את הגלולה בתווך בסיס BME ואורגנואיד וצלחת את תמיסת התא המרחף מחדש לתוך צלחת שש בארות ב 40 מיקרוליטר aliquots. צלחת עד חמישה aliquots לכל באר.לאחר 20 דקות של דגירה, להוסיף בעדינות שני מיליליטר של מדיום אורגנואיד שלם לתוך כל באר. השהה מחדש את כדורי תא אורגנואיד המעבר ב 0.5 עד מיליליטר אחד של תרבית תאי התאוששות הקפאה בינונית ולהעביר מיליליטר אחד לכל בקבוקון קריו לפני העברתם למינוס 80 מעלות ומיכל חנקן נוזלי לאחסון לטווח ארוך. הפשירו את האורגנואידים על ידי העברת בקבוקוני הקריו המאוחסנים בחנקן נוזלי לאמבט מים של 37 מעלות צלזיוס.לאחר ההפשרה, מעבירים את האורגנואידים לצינור חרוטי של 15 מיליליטר וצנטריפוגות אותם לפני שאיפת הסופרנטנט. לאחר מכן, להוסיף מיליליטר אחד של PBS לגלולה ולהעביר את הגלולה resuspended לצינור מיקרוצנטריפוגה 1.5 מיליליטר לאחר צנטריפוגה ב 1, 650 גרם במשך חמש דקות בארבע מעלות צלזיוס, בזהירות לשאוף את supernatant באמצעות פיפטה מרעה זכוכית. השהה מחדש את הגלולה בתווך בסיס BME ואורגנואיד וצלחת את התאים המרחפים מחדש על צלחת שש בארות ב 40 מיקרוליטר aliquots.מניחים עד חמישה aliquots לכל באר. מניחים מיד את הצלחת באינקובטור למשך 20 דקות לפני הוספת שני מיליליטר של מדיום אורגנואיד שלם לבארות. אורגנואידים הוקמו במשך 10 ימים ולאחר מכן הם הדגימו אורגנואידים בדידים בתרבית.תרביות אורגנואידים שמקורן במטופלים הוערכו על ידי הטמעתם באגרוז והערכתם עם המטוקסילין וכתמי אאוזין. חשוב לשקול את האתגרים של עבודה עם BME. ההשעיה של גלולת התא וה-BME חייבת להיעשות על קרח ולהבטיח שלא ייווצרו בועות בתהליך.טכניקה זו מאפשרת מחקר נוסף על השפעת הכימותרפיה על ייצור והתפתחות אורגנואידים בשל הבעיות בהן נתקלים חולים שעברו כימותרפיה ניאו-אדג'ובנטית.

Research

JoVE Journal

Cancer Research

Establishment of Gastric Cancer Patient-derived Xenograft Models and Primary Cell Lines

הקמת החולה סרטן קיבה-מודלים נגזרים הנגזרות וקווי התא הראשי

The use of preclinical models to advance our understanding of tumor biology and investigate the efficacy of therapeutic agents is key to cancer research. ...

High-Throughput In Vitro Assay using Patient-Derived Tumor Organoids

High-Throughput In Vitro Assay using Patient-Derived Tumor Organoids

תפוקה גבוהה במבחנה במבחנה באמצעות organoids גידול נגזר המטופל

Patient-derived tumor organoids (PDOs) are expected to be a preclinical cancer model with better reproducibility of disease than traditional cell culture ...

Profiling Sensitivity to Targeted Therapies in EGFR-Mutant NSCLC Patient-Derived Organoids

רגישות ליצירת פרופילים לטיפולים ממוקדים באורגנוידים שמקורם ב-EGFR-Mutant NSCLC

Novel 3D cancer organoid cultures derived from clinical patient specimens represent an important model system to evaluate intratumor heterogeneity and ...

Orthotopic Implantation of Patient-Derived Cancer Cells in Mice Recapitulates Advanced Colorectal Cancer

השתלה אורתוטופית של תאים סרטניים שמקורם בחולה בעכברים משחזרת סרטן מעי גס מתקדם

Over the last decade, more sophisticated preclinical colorectal cancer (CRC) models have been established using patient-derived cancer cells and 3D ...

Establishment and Culture of Patient-Derived Breast Organoids

הקמה ותרבות של אורגנואידי שד שמקורם במטופל

Breast cancer is a complex disease that has been classified into several different histological and molecular subtypes. Patient-derived breast tumor ...

Visualizing DNA Damage Repair Proteins in Patient-Derived Ovarian Cancer Organoids via Immunofluorescence Assays

Visualizing DNA Damage Repair Proteins in Patient-Derived Ovarian Cancer Organoids via Immunofluorescence Assays

הדמיה של חלבונים לתיקון נזקי DNA באורגנואידים של סרטן השחלות שמקורם במטופל באמצעות בדיקות אימונופלואורסנציה

Immunofluorescence is one of the most widely used techniques to visualize target antigens with high sensitivity and specificity, allowing for the accurate ...

Ovarian Cancer Patient-Derived Organoid Models for Pre-Clinical Drug Testing

Ovarian cancer is a fatal gynecologic cancer and the fifth leading cause of cancer death among women in the United States. Developing new drug treatments ...

Automated Kinetic Imaging for Drug Assessment in Patient-Derived Tumor Organoids

Multiplexed Live-Cell Imaging for Drug Responses in Patient-Derived Organoid Models of Cancer

Author Spotlight: Developing Multiplexed Kinetic Assays for Organoid-Based Drug Response Analysis

Patient-derived organoid (PDO) models of cancer are a multifunctional research system that better recapitulates human disease as compared to cancer cell ...

Derivation of 3D Glioma Organoids from Chopper-Processed Patient Tumors

Cultivating Ex Vivo Patient-Derived Glioma Organoids Using a Tissue Chopper

Author Spotlight: Enhanced Generation of Patient-Derived 3D Organoids for Glioblastoma and Glioma

Glioblastoma, IDH-wild type, CNS WHO grade 4 (GBM) is a primary brain tumor associated with poor patient survival despite aggressive treatment. Developing ...

Standardizing Ovarian Cancer Organoid Biobanking

Strategy for Biobanking of Ovarian Cancer Organoids: Addressing the Interpatient Heterogeneity across Histological Subtypes and Disease Stages

Author Spotlight: Advancing Personalized Medicine in Ovarian Cancer 

אסטרטגיה לביו-בנקאות של אורגנואידים של סרטן השחלות: טיפול בהטרוגניות הבין-אשפוזית על פני תת-סוגים היסטולוגיים ושלבי מחלה

While the establishment of an ovarian cancer biobank from patient-derived organoids along with their clinical background information promises advances in ...