Name: generation and culturing of high-grade serous ovarian cancer patient-derived organoids
Uploaded: 2023-01-06T14:50:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Generation and Culturing of High-Grade Serous Ovarian Cancer Patient-Derived Organoids at JoVE.com

Siamo grati per la guida di Ron Bose, MD, PhD, e l'assistenza di Barbara Blachut, MD, nello stabilire questo protocollo. Vorremmo anche riconoscere la Scuola di Medicina della Washington University nel Dipartimento di Ostetricia e Ginecologia di St. Louis e la Divisione di Oncologia Ginecologica, il Dean's Scholar Program della Washington University e il Reproductive Scientist Development Program per il loro sostegno a questo progetto.

Tutti i campioni di tessuto umano raccolti per la ricerca sono stati ottenuti secondo il protocollo approvato dall'Institutional Review Board (IRB). I protocolli descritti di seguito sono stati eseguiti in un ambiente di coltura di tessuti umani sterili. Il consenso scritto informato è stato ottenuto da soggetti umani. Le pazienti eleggibili dovevano avere una diagnosi o una presunta diagnosi di cancro ovarico, essere disposte e in grado di firmare il consenso informato e avere almeno 18 anni di età. Il tessuto tumoral...

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	<li>Bray, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Global+cancer+statistics+2018:+GLOBOCAN+estimates+of+incidence+and+mortality+worldwide+for+36+cancers+in+185+countries.">Global cancer statistics 2018: GLOBOCAN estimates of incidence and mortality worldwide for 36 cancers in 185 countries.</a> CA: A Cancer Journal for Clinicians. 68 (6), 394-424 (2018).</li><li>Drost, J., Clevers, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Organoids+in+cancer+research.">Organoids in cancer research.</a> Nature Reviews Cancer. 18 (7), 407-418 (2018).</li><li>Pauli, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Personalized+in+vitro+and+in+vivo+cancer+models+to+guide+precision+medicine.">Personalized in vitro and in vivo cancer models to guide precision medicine.</a> Cancer Discovery. 7 (5), 462-477 (2017).</li><li>Fujii, E., Kato, A., Suzuki, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Patient-derived+xenograft+(PDX)+models:+Characteristics+and+points+to+consider+for+the+process+of+establishment.">Patient-derived xenograft (PDX) models: Characteristics and points to consider for the process of establishment.</a> Journal of Toxicologic Pathology. 33 (3), 153-160 (2020).</li><li>Yang, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Application+of+ovarian+cancer+organoids+in+precision+medicine:+Key+challenges+and+current+opportunities.">Application of ovarian cancer organoids in precision medicine: Key challenges and current opportunities.</a> Frontiers in Cell and Developmental Biology. 9, 701429 (2021).</li><li>Yang, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Patient-derived+organoids:+A+promising+model+for+personalized+cancer+treatment.">Patient-derived organoids: A promising model for personalized cancer treatment.</a> Gastroenterology Report. 6 (4), 243-245 (2018).</li><li>Karakasheva, T. 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M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Validation+of+a+postfixation+tissue+storage+and+transport+medium+to+preserve+histopathology+and+molecular+pathology+analyses+(total+and+phosphoactivated+proteins,+and+FISH).">Validation of a postfixation tissue storage and transport medium to preserve histopathology and molecular pathology analyses (total and phosphoactivated proteins, and FISH).</a> American Journal of Clinical Pathology. 137 (3), 429-436 (2012).</li><li>Feldman, A. T., Wolfe, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tissue+processing+and+hematoxylin+and+eosin+staining.">Tissue processing and hematoxylin and eosin staining.</a> Methods in Molecular Biology. 1180, 31-43 (2014).</li><li>Ooft, S. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Patient-derived+organoids+can+predict+response+to+chemotherapy+in+metastatic+colorectal+cancer+patients.">Patient-derived organoids can predict response to chemotherapy in metastatic colorectal cancer patients.</a> Science Translational Medicine. 11 (513), (2019).</li><li>Aisenbrey, E. A., Murphy, W. 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Il cancro ovarico è estremamente mortale a causa del suo stadio avanzato alla diagnosi, così come lo sviluppo comune della resistenza alla chemioterapia. Molti progressi nella ricerca sul cancro ovarico sono stati fatti utilizzando linee cellulari tumorali e modelli PDX; Tuttavia, vi è un'evidente necessità di un modello in vitro più rappresentativo e conveniente. Le PDO hanno dimostrato di rappresentare accuratamente l'eterogeneità del tumore, il microambiente tumorale e le caratteristiche genomiche e tra...

Nel 2021, circa 21.410 donne negli Stati Uniti sono state diagnosticate di recente con cancro ovarico epiteliale e 12.940 donne sono morte di questa malattia1. Sebbene siano stati fatti progressi sufficienti in chirurgia e chemioterapia, oltre il 70% dei pazienti con malattia avanzata sviluppa resistenza chemioterapica e muore entro 5 anni dalla diagnosi 2,3. Pertanto, sono urgentemente necessarie nuove strategie per trattare questa malattia mortale e modelli rappresentativi e affidabili per la ricerca preclinica.
Le linee cellulari tumorali e gli xenotrapianti derivati dal paziente (PDX) creati da tumori ovarici primari sono i principali strumenti utilizzati nella ricerca sul cancro ovarico. Uno dei principali vantaggi delle linee cellulari tumorali è la loro rapida espansione. Tuttavia, la loro coltura continua provoca alterazioni fenotipiche e genotipiche che causano le linee cellulari tumorali a deviare dal campione di tumore primario originale. A causa delle differenze esistenti tra la linea cellulare tumorale e il tumore primario, i test farmacologici che hanno effetti positivi nelle linee cellulari non riescono ad avere questi stessi effetti negli studi clinici2. Per superare queste limitazioni, vengono utilizzati i modelli PDX. Questi modelli sono creati impiantando tessuto fresco del cancro ovarico in topi immunodeficienti. Poiché sono modelli in vivo , assomigliano più accuratamente alle caratteristiche biologiche umane e, a loro volta, sono più predittivi dei risultati dei farmaci. Tuttavia, questi modelli hanno anche limitazioni significative, tra cui il costo, il tempo e le risorse necessarie per generarli4.
Le PDO offrono un modello alternativo per la ricerca preclinica che supera i limiti sia delle linee cellulari tumorali che dei modelli PDX. Le PDO ricapitolano il tumore e il microambiente tumorale di un paziente e, quindi, forniscono un modello trattabile in vitro ideale per la ricerca preclinica 2,3,5. Questi modelli 3D hanno capacità di auto-organizzazione che modellano il tumore primario, che è una caratteristica che le loro controparti bidimensionali (2D) della linea cellulare non possiedono. Inoltre, questi modelli hanno dimostrato di rappresentare geneticamente e funzionalmente i loro tumori genitori e, quindi, sono modelli affidabili per lo studio di nuove terapie e processi biologici. In breve, offrono capacità di espansione e stoccaggio a lungo termine simili alle linee cellulari, ma comprendono anche il microambiente e le interazioni cellula-cellula inerenti ai modelli murini 4,6.
Il presente protocollo descrive la creazione di DOP da tumori derivati dal paziente, ascite e campioni di liquido pleurico con un tasso di successo superiore al 97%. Le colture DOP possono quindi essere espanse per più generazioni e utilizzate per testare la sensibilità alla terapia farmacologica e i biomarcatori predittivi. Questo metodo rappresenta una tecnica che potrebbe essere utilizzata per personalizzare i trattamenti in base alle risposte terapeutiche delle DOP.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>1% HEPES</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>15630080</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1% Penicillin-Streptomycin</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>30002CI</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1.5 mL Eppendorf Tubes&#160;</td>
			<td>Genesee Scientific</td>
			<td>14125</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10 cm Tissue Culture Dish&#160;</td>
			<td>TPP</td>
			<td>93100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10 mL Serological Pipet</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>100 &#181;m Cell Filter</td>
			<td>MidSci</td>
			<td>100ICS</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>15 mL centrifuge tubes</td>
			<td>Corning</td>
			<td>430052</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2 mL Cryovial</td>
			<td>Simport Scientific</td>
			<td>T301-2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2% Paraformaldehyde Fixative</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>37 &#176;C water bath&#160;</td>
			<td>NEST</td>
			<td>602052</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3dGRO R-Spondin-1 Conditioned Media Supplement</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>SCM104</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>6 well plates</td>
			<td>TPP</td>
			<td>92006</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>70% Ethanol</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>R31541GA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>A83-01</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>SML0788</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Advanced DMEM/F12</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>12634028</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agar</td>
			<td>Lamda Biotech</td>
			<td>C121</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>B-27</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>17504044</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge&#160;</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cultrex Type 2</td>
			<td>R&#38;D Systems</td>
			<td>3533-010-02</td>
			<td>basement membrane extract</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNase I</td>
			<td>New England Bio Labs</td>
			<td>M0303S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNase I Reaction Buffer</td>
			<td>New England Bio Labs</td>
			<td>M0303S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EGF</td>
			<td>PeproTech</td>
			<td>AF-100-15</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FBS&#160;</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>F2442</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FGF-10</td>
			<td>PeproTech</td>
			<td>100-26</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FGF2</td>
			<td>PeproTech</td>
			<td>100-18B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>gentleMACS C Tubes</td>
			<td>Miltenyi BioTech</td>
			<td>130-096-334</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>gentleMACS Octo Dissociator with Heaters</td>
			<td>Miltenyi BioTech</td>
			<td>130-096-427</td>
			<td>We use the manufacturers protocol.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GlutaMAX</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>35050061</td>
			<td>dipeptide, L-alanyl-L-glutamine</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hematoxylin and Eosin Staining Kit</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>NC1470670</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Histoplast Paraffin Wax</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>22900700</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microcentrifuge&#160;</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mr. Frosty Freezing Container</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>07202363S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N-acetylcysteine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A9165</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nicotinamide</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>N0636</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>p1000 Pipette with Tips&#160;</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>p200 Pipette with Tips&#160;</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pasteur Pipettes 9&#34;</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>1367820D</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>MT21031CM</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipet Controller</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Prostaglandin E2</td>
			<td>R&#38;D Systems</td>
			<td>2296</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Puromycin&#160;</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>A1113802</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recombinant Murine Noggin</td>
			<td>PeproTech</td>
			<td>250-38</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recovery Cell Culture Freezing Medium</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>12648010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Red Blood Cell Lysis Buffer</td>
			<td>BioLegend</td>
			<td>420301</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ROCK Inhibitor (Y-27632)</td>
			<td>R&#38;D Systems</td>
			<td>1254/1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SB202190</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S7076</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T75 Flask</td>
			<td>MidSci</td>
			<td>TP90076</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue Culture Hood&#160;</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue Embedding Cassette</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TrypLE Express</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>12604013</td>
			<td>animal origin-free, recombinant enzyme</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Type II Collagenase</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>17101015</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vortex</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

generation and culturing of high-grade serous ovarian cancer patient-derived organoids

Gli organoidi sono modelli tumorali dinamici 3D che possono essere coltivati con successo da tessuto tumorale ovarico derivato dal paziente, ascite o liquido pleurico e aiutano nella scoperta di nuove terapie e biomarcatori predittivi per il cancro ovarico. Questi modelli ricapitolano l'eterogeneità clonale, il microambiente tumorale e le interazioni cellula-cellula e cellula-matrice. Inoltre, hanno dimostrato di corrispondere al tumore primario morfologicamente, citologicamente, immunoistochimicamente e geneticamente. Pertanto, gli organoidi facilitano la ricerca sulle cellule tumorali e sul microambiente tumorale e sono superiori alle linee cellulari. Il presente protocollo descrive metodi distinti per generare organoidi di cancro ovarico derivati dal paziente da tumori del paziente, ascite e campioni di liquido pleurico con un tasso di successo superiore al 97%. I campioni del paziente vengono separati in sospensioni cellulari mediante digestione meccanica ed enzimatica. Le cellule vengono quindi placcate utilizzando un estratto di membrana basale (BME) e sono supportate con terreni di crescita ottimizzati contenenti integratori specifici per la coltura del carcinoma ovarico sieroso di alto grado (HGSOC). Dopo aver formato gli organoidi iniziali, le DOP possono sostenere la cultura a lungo termine, incluso il passaggio per l'espansione per esperimenti successivi.

Per generare PDO, i campioni sono stati digeriti meccanicamente ed enzimaticamente in sospensioni monocellulari. Le cellule sono state quindi risospese in BME e integrate con mezzi specificamente ingegnerizzati (Figura 3). Gli organoidi sono tipicamente stabiliti in un arco di tempo di 10 giorni, dopo di che dimostrano organoidi discreti in coltura (Figura 4).
<img alt="Figure 3" class="xfigi...

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Generation and Culturing of High-Grade Serous Ovarian Cancer Patient-Derived Organoids

Gli organoidi derivati dal paziente (PDO) sono una coltura tridimensionale (3D) che può imitare l'ambiente tumorale in vitro. Nel carcinoma ovarico sieroso di alto grado, le DOP rappresentano un modello per studiare nuovi biomarcatori e terapie.

Generazione e coltura di organoidi di alto grado derivati da pazienti con carcinoma ovarico sieroso

Organoids are 3D dynamic tumor models that can be grown successfully from patient-derived ovarian tumor tissue, ascites, or pleural fluid and aid in the ...

I modelli organoidi guidati dal paziente rappresentano geneticamente e funzionalmente i loro tumori genitori e quindi sono modelli affidabili per lo studio di nuove terapie e processi biologici complessi nel cancro ovarico. Ricapitolando l'eterogeneità clonale, il microambiente tumorale e le interazioni cellula-cellula in vitro, questi modelli superano i limiti delle linee cellulari tumorali e degli xenotrapianti derivati dai pazienti. Gli organoidi derivati dal paziente offrono capacità di espansione e stoccaggio a lungo termine e imitano la fisiologia del tumore.Di conseguenza, sono modelli ideali per lo studio di nuove terapie e biomarcatori predittivi. Iniziare la raccolta degli organoidi posizionando i campioni tumorali in un piatto di coltura tissutale di 10 centimetri e tritando il tessuto per creare una miscela omogenea usando un bisturi usa e getta. Posizionare la miscela di tessuto omogeneo in un tubo di dissociazione usando una pinza.Per ogni uno o due millilitri di tessuto omogeneizzato aggiungere da sette a otto millilitri di un milligrammo per millilitro di soluzione di collagenasi di tipo due in mezzo base organoide e un millilitro di soluzione DNase One. Vortice la soluzione a 458 G.Liquefare il tessuto mentre è nella soluzione di collagenasi usando la macchina di dissociazione. Eseguire il programma 37 C underscore H underscore TDK tre un'ora fino a quando non è una sospensione a cella singola.Una volta fatto, trasferire la miscela omogeneizzata in un nuovo tubo conico da 50 millilitri. Aggiungere da 20 a 40 millilitri di terreno base organoide e vortice la soluzione a 458 G.Quindi filtrare la soluzione attraverso un filtro cellulare da 100 micrometri in un tubo conico da 50 millilitri appena etichettato. Quindi, centrifugare la miscela filtrata a 1.650 G per cinque minuti a quattro gradi Celsius e aspirare il surnatante usando una pipetta di pascolo di vetro.Preparare 100 microgrammi per millilitro di Dnase One e risospendere le cellule in un millilitro di soluzione di Dnase One aggiungendo una soluzione di DNase One a goccia. Dopo 15 minuti di incubazione a temperatura ambiente aggiungere 25 millilitri di mezzo base organoide alle cellule e invertire per mescolare. Quindi centrifugare le cellule a 1.650 G per cinque minuti a quattro gradi Celsius e aspirare accuratamente il surnatante usando una pipetta di pascolo di vetro.Risospendere il pellet cellulare appena formato in cinque millilitri di globuli rossi preriscaldati o tampone di lisi RBC. Vortice le soluzioni in ciascun tubo conico a 458 G e incubare per cinque minuti. Anche in questo caso, centrifugare il pellet sospeso in tampone di lisi RBC e aspirare il surnatante usando una pipetta da pascolo di vetro.Lavare il pellet con 10 millilitri di PBS e vortice le celle prima della centrifugazione delle cellule. Per un pellet a celle grandi, aspirare il PBS e aggiungere un millilitro del mezzo base organoide sopra il pellet. Dopo aver vorticolato la soluzione, trasferire da 300 a 400 microlitri della sospensione cellulare in un tubo di microcentrifuga.Dopo cinque minuti di centrifugazione, aspirare il surnatante e risospenderlo nell'estratto di membrana basale, o BME, e nel mezzo base organoide utilizzando punte fredde. Placcare la soluzione cellulare risospesa in una piastra a sei pozzetti in aliquote da 40 microlitri. Impiattare fino a cinque aliquote per pozzetto.Posizionare immediatamente la piastra del pozzetto nell'incubatore per 20 minuti e, dopo l'incubazione, aggiungere delicatamente due millilitri del mezzo organoide completo in ciascun pozzetto. Aggiungere un millilitro di terreno base organoide a ciascun pozzetto e pipettare il mezzo su e giù direttamente sulle linguette organoidi per la dissociazione. Raccogliere tutto il mezzo contenente il pellet risospeso in un tubo conico da 15 millilitri.Quindi, centrifugare il tubo conico da 15 millilitri contenente la miscela per cinque minuti prima di aspirare il surnatante. Aggiungere un millilitro di enzima ricombinante libero di origine animale al pellet cellulare. Mescolare a vortice e trasferire la sospensione in un tubo da microcentrifuga da 1,5 millilitri.Dopo 15 minuti di incubazione in bagnomaria a 37 gradi Celsius e cinque minuti di centrifugazione, aspirare il surnatante. Risospendere il pellet in BME e mezzo base organoide e placcare la soluzione cellulare risospesa in una piastra a sei pozzetti in aliquote da 40 microlitri. Impiattare fino a cinque aliquote per pozzetto.Dopo 20 minuti di incubazione, aggiungere delicatamente due millilitri del mezzo organoide completo in ciascun pozzetto. Risospendere il pellet di cellule organoidi di passaggio in 0,5-un millilitro di terreno di congelamento della coltura cellulare di recupero e trasferire un millilitro in ciascuna fiala di criofila prima di trasferirli a meno 80 gradi e serbatoio di azoto liquido per la conservazione a lungo termine. Scongelare gli organoidi trasferendo le fiale criogeniche conservate in azoto liquido a 37 gradi Celsius a bagnomaria.Una volta scongelati, trasferire gli organoidi in un tubo conico da 15 millilitri e centrifugarli prima di aspirare il surnatante. Quindi, aggiungere un millilitro di PBS al pellet e trasferire il pellet risospeso in un tubo di microcentrifuga da 1,5 millilitri Dopo la centrifugazione a 1.650 G per cinque minuti a quattro gradi Celsius, aspirare con cura il surnatante usando una pipetta di pascolo di vetro. Risospendere il pellet in BME e mezzo base organoide e placcare le celle risospese su una piastra a sei pozzetti in aliquote da 40 microlitri.Posizionare fino a cinque aliquote per pozzetto. Posizionare immediatamente la piastra nell'incubatore per 20 minuti prima di aggiungere due millilitri di mezzo organoide completo ai pozzetti. Gli organoidi sono stati stabiliti in 10 giorni dopo di che hanno dimostrato organoidi discreti in coltura.Le colture organoidi derivate dai pazienti sono state valutate incorporandole nell'agarosio e valutandole con colorazione con ematossilina ed eosina. È importante considerare le sfide di lavorare con BME. La risospensione del pellet cellulare e del BME deve essere effettuata su ghiaccio assicurandosi che non si formino bolle nel processo.Questa tecnica consente ulteriori ricerche sull'impatto della chemioterapia sulla generazione e lo sviluppo di organoidi a causa dei problemi incontrati dai pazienti sottoposti a chemioterapia neoadiuvante.

Research

JoVE Journal

Cancer Research

Establishment of Gastric Cancer Patient-derived Xenograft Models and Primary Cell Lines

Stabilimento di modelli Xenograft derivati dal paziente derivato dal paziente e linee cellulari primarie

The use of preclinical models to advance our understanding of tumor biology and investigate the efficacy of therapeutic agents is key to cancer research. ...

Ricerca

Ricerca sul cancro

High-Throughput In Vitro Assay using Patient-Derived Tumor Organoids

High-Throughput In Vitro Assay using Patient-Derived Tumor Organoids

Test in vitro ad alto rendimento utilizzando organoidi tumorali derivati dal paziente

Patient-derived tumor organoids (PDOs) are expected to be a preclinical cancer model with better reproducibility of disease than traditional cell culture ...

Profiling Sensitivity to Targeted Therapies in EGFR-Mutant NSCLC Patient-Derived Organoids

Profilazione della sensibilità alle terapie mirate negli organoidi derivati dal paziente NSCLC EGFR-Mutant

Novel 3D cancer organoid cultures derived from clinical patient specimens represent an important model system to evaluate intratumor heterogeneity and ...

Orthotopic Implantation of Patient-Derived Cancer Cells in Mice Recapitulates Advanced Colorectal Cancer

L'impianto ortotopico di cellule tumorali derivate dal paziente nei topi ricapitola il cancro colorettale avanzato

Over the last decade, more sophisticated preclinical colorectal cancer (CRC) models have been established using patient-derived cancer cells and 3D ...

Establishment and Culture of Patient-Derived Breast Organoids

Istituzione e coltura di organoidi mammari derivati da pazienti

Breast cancer is a complex disease that has been classified into several different histological and molecular subtypes. Patient-derived breast tumor ...

Visualizing DNA Damage Repair Proteins in Patient-Derived Ovarian Cancer Organoids via Immunofluorescence Assays

Visualizing DNA Damage Repair Proteins in Patient-Derived Ovarian Cancer Organoids via Immunofluorescence Assays

Visualizzazione delle proteine di riparazione del danno al DNA negli organoidi del cancro ovarico derivati dal paziente tramite saggi di immunofluorescenza

Immunofluorescence is one of the most widely used techniques to visualize target antigens with high sensitivity and specificity, allowing for the accurate ...

Ovarian Cancer Patient-Derived Organoid Models for Pre-Clinical Drug Testing

Ovarian cancer is a fatal gynecologic cancer and the fifth leading cause of cancer death among women in the United States. Developing new drug treatments ...

Automated Kinetic Imaging for Drug Assessment in Patient-Derived Tumor Organoids

Multiplexed Live-Cell Imaging for Drug Responses in Patient-Derived Organoid Models of Cancer

Author Spotlight: Developing Multiplexed Kinetic Assays for Organoid-Based Drug Response Analysis

Patient-derived organoid (PDO) models of cancer are a multifunctional research system that better recapitulates human disease as compared to cancer cell ...

Derivation of 3D Glioma Organoids from Chopper-Processed Patient Tumors

Cultivating Ex Vivo Patient-Derived Glioma Organoids Using a Tissue Chopper

Author Spotlight: Enhanced Generation of Patient-Derived 3D Organoids for Glioblastoma and Glioma

Glioblastoma, IDH-wild type, CNS WHO grade 4 (GBM) is a primary brain tumor associated with poor patient survival despite aggressive treatment. Developing ...

Standardizing Ovarian Cancer Organoid Biobanking

Strategy for Biobanking of Ovarian Cancer Organoids: Addressing the Interpatient Heterogeneity across Histological Subtypes and Disease Stages

Author Spotlight: Advancing Personalized Medicine in Ovarian Cancer 

Strategia per la biobanca degli organoidi del carcinoma ovarico: affrontare l'eterogeneità interpaziente tra sottotipi istologici e stadi di malattia

While the establishment of an ovarian cancer biobank from patient-derived organoids along with their clinical background information promises advances in ...