Name: generation and culturing of high-grade serous ovarian cancer patient-derived organoids
Uploaded: 2023-01-06T14:50:00
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このプロトコルを確立する上で、ロン・ボーズ医学博士の指導とバーバラ・ブラクート医学博士の支援に感謝しています。また、セントルイスの産婦人科および婦人科腫瘍学部門のワシントン大学医学部、ワシントン大学の学部長の奨学生プログラム、および生殖科学者開発プログラムに、このプロジェクトを支援してくれたことに感謝します。

研究のために収集されたすべてのヒト組織標本は、治験審査委員会(IRB)が承認したプロトコルに従って取得されました。以下に概説するプロトコルは、無菌ヒト組織培養環境で実施した。インフォームド書面による同意は、ヒト被験者から得られた。適格な患者は、卵巣がんの診断または推定診断を受け、インフォームドコンセントに署名する意思と能力があり、18歳以上でなければなりませ...

<ol>
	<li>Bray, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Global+cancer+statistics+2018:+GLOBOCAN+estimates+of+incidence+and+mortality+worldwide+for+36+cancers+in+185+countries.">Global cancer statistics 2018: GLOBOCAN estimates of incidence and mortality worldwide for 36 cancers in 185 countries.</a> CA: A Cancer Journal for Clinicians. 68 (6), 394-424 (2018).</li><li>Drost, J., Clevers, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Organoids+in+cancer+research.">Organoids in cancer research.</a> Nature Reviews Cancer. 18 (7), 407-418 (2018).</li><li>Pauli, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Personalized+in+vitro+and+in+vivo+cancer+models+to+guide+precision+medicine.">Personalized in vitro and in vivo cancer models to guide precision medicine.</a> Cancer Discovery. 7 (5), 462-477 (2017).</li><li>Fujii, E., Kato, A., Suzuki, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Patient-derived+xenograft+(PDX)+models:+Characteristics+and+points+to+consider+for+the+process+of+establishment.">Patient-derived xenograft (PDX) models: Characteristics and points to consider for the process of establishment.</a> Journal of Toxicologic Pathology. 33 (3), 153-160 (2020).</li><li>Yang, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Application+of+ovarian+cancer+organoids+in+precision+medicine:+Key+challenges+and+current+opportunities.">Application of ovarian cancer organoids in precision medicine: Key challenges and current opportunities.</a> Frontiers in Cell and Developmental Biology. 9, 701429 (2021).</li><li>Yang, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Patient-derived+organoids:+A+promising+model+for+personalized+cancer+treatment.">Patient-derived organoids: A promising model for personalized cancer treatment.</a> Gastroenterology Report. 6 (4), 243-245 (2018).</li><li>Karakasheva, T. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+and+characterization+of+patient-derived+head+and+neck,+oral,+and+esophageal+cancer+organoids.">Generation and characterization of patient-derived head and neck, oral, and esophageal cancer organoids.</a> Current Protocols in Stem Cell Biology. 53 (1), 109 (2020).</li><li>Madison, B. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Let-7+represses+carcinogenesis+and+a+stem+cell+phenotype+in+the+intestine+via+regulation+of+Hmga2.">Let-7 represses carcinogenesis and a stem cell phenotype in the intestine via regulation of Hmga2.</a> PLoS Genetics. 11 (8), 1005408 (2015).</li><li>Sato, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single+Lgr5+stem+cells+build+crypt-villus+structures+in+vitro+without+a+mesenchymal+niche.">Single Lgr5 stem cells build crypt-villus structures in vitro without a mesenchymal niche.</a> Nature. 459 (7244), 262-265 (2009).</li><li>Murray, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=HER2+and+APC+mutations+promote+altered+crypt-villus+morphology+and+marked+hyperplasia+in+the+intestinal+epithelium.">HER2 and APC mutations promote altered crypt-villus morphology and marked hyperplasia in the intestinal epithelium.</a> Cellular and Molecular Gastroenterology and Hepatology. 12 (3), 1105-1120 (2021).</li><li>Hill, S. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Prediction+of+DNA+repair+inhibitor+response+in+short-term+patient-derived+ovarian+cancer+organoids.">Prediction of DNA repair inhibitor response in short-term patient-derived ovarian cancer organoids.</a> Cancer Discovery. 8 (11), 1404-1421 (2018).</li><li>Passarelli, M. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Leucyl-tRNA+synthetase+is+a+tumour+suppressor+in+breast+cancer+and+regulates+codon-dependent+translation+dynamics.">Leucyl-tRNA synthetase is a tumour suppressor in breast cancer and regulates codon-dependent translation dynamics.</a> Nature Cell Biology. 24 (3), 307-315 (2022).</li><li>Pleguezuelos-Manzano, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Establishment+and+culture+of+human+intestinal+organoids+derived+from+adult+stem+cells.">Establishment and culture of human intestinal organoids derived from adult stem cells.</a> Current Protocols in Immunology. 130 (1), 106 (2020).</li><li>Stumm, M. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Validation+of+a+postfixation+tissue+storage+and+transport+medium+to+preserve+histopathology+and+molecular+pathology+analyses+(total+and+phosphoactivated+proteins,+and+FISH).">Validation of a postfixation tissue storage and transport medium to preserve histopathology and molecular pathology analyses (total and phosphoactivated proteins, and FISH).</a> American Journal of Clinical Pathology. 137 (3), 429-436 (2012).</li><li>Feldman, A. T., Wolfe, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tissue+processing+and+hematoxylin+and+eosin+staining.">Tissue processing and hematoxylin and eosin staining.</a> Methods in Molecular Biology. 1180, 31-43 (2014).</li><li>Ooft, S. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Patient-derived+organoids+can+predict+response+to+chemotherapy+in+metastatic+colorectal+cancer+patients.">Patient-derived organoids can predict response to chemotherapy in metastatic colorectal cancer patients.</a> Science Translational Medicine. 11 (513), (2019).</li><li>Aisenbrey, E. A., Murphy, W. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synthetic+alternatives+to+Matrigel.">Synthetic alternatives to Matrigel.</a> Nature Reviews Materials. 5 (7), 539-551 (2020).</li><li>Nanki, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Patient-derived+ovarian+cancer+organoids+capture+the+genomic+profiles+of+primary+tumours+applicable+for+drug+sensitivity+and+resistance+testing.">Patient-derived ovarian cancer organoids capture the genomic profiles of primary tumours applicable for drug sensitivity and resistance testing.</a> Scientific Reports. 10, 12581 (2020).</li><li>Mead, B. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Screening+for+modulators+of+the+cellular+composition+of+gut+epithelia+via+organoid+models+of+intestinal+stem+cell+differentiation.">Screening for modulators of the cellular composition of gut epithelia via organoid models of intestinal stem cell differentiation.</a> Nature Biomedical Engineering. 6 (4), 476-494 (2022).</li></ol>

卵巣癌は、診断時の進行段階、および化学療法耐性の一般的な発達のために非常に致命的です。卵巣がん研究における多くの進歩は、がん細胞株とPDXモデルを利用することによってなされてきました。ただし、より代表的で手頃な価格の in vitro モデルが明らかに必要です。PDOは、腫瘍の不均一性、腫瘍微小環境、および原発腫瘍のゲノムおよびトランスクリプトームの特徴を正確に表...

2021年には、米国で約21,410人の女性が新たに上皮性卵巣がんと診断され、12,940人の女性がこの病気で死亡しました1。手術と化学療法は十分に進歩していますが、進行性疾患の患者の70%以上が化学療法耐性を発症し、診断から5年以内に死亡します2,3。したがって、この致命的な病気を治療するための新しい戦略と、前臨床研究のための代表的な信頼できるモデルが緊急に必要とされています。
原発性卵巣腫瘍から作製されたがん細胞株および患者由来異種移植片(PDX)は、卵巣がん研究で使用される主要な機器です。がん細胞株の主な利点は、その急速な拡大です。しかし、それらの継続的な培養は、表現型および遺伝子型の変化をもたらし、癌細胞株を元の原発癌腫瘍サンプルから逸脱させる。がん細胞株と原発腫瘍の間には既存の違いがあるため、細胞株でプラスの効果がある薬物アッセイは、臨床試験でこれらの同じ効果をもたらすことができません2。これらの制限を克服するために、PDXモデルが使用されます。これらのモデルは、免疫不全マウスに新鮮な卵巣癌組織を移植することによって作成されます。それらは in vivo モデルであるため、ヒトの生物学的特性により正確に似ており、薬物の結果をより予測します。ただし、これらのモデルには、モデルの生成に必要なコスト、時間、リソースなど、大きな制限もあります4。
PDOは、がん細胞株とPDXモデルの両方の限界を克服する前臨床研究の代替モデルを提供します。PDOは、患者の腫瘍および腫瘍微小環境を再現し、したがって、前臨床研究に理想的なin vitro扱い可能なモデルを提供します2,3,5。これらの3Dモデルは、原発腫瘍をモデル化する自己組織化機能を有しており、これはそれらの2次元(2D)細胞株の対応物にはない特徴である。さらに、これらのモデルは、それらの親腫瘍を遺伝的および機能的に表すことが示されており、したがって、新しい治療法および生物学的プロセスを研究するための信頼できるモデルである。要するに、それらは細胞株と同様の長期的な増殖および保存能力を提供するだけでなく、マウスモデルに固有の微小環境および細胞間相互作用も包含する4,6。
本プロトコルは、97%を超える成功率を有する患者由来の腫瘍、腹水、および胸水サンプルからのPDOの作成について説明しています。その後、PDO培養を複数世代にわたって拡張し、薬物療法の感受性と予測バイオマーカーをテストするために使用できます。この方法は、PDOの治療反応に基づいて治療をパーソナライズするために使用できる技術を表しています。

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>1% HEPES</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>15630080</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1% Penicillin-Streptomycin</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>30002CI</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1.5 mL Eppendorf Tubes&#160;</td>
			<td>Genesee Scientific</td>
			<td>14125</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10 cm Tissue Culture Dish&#160;</td>
			<td>TPP</td>
			<td>93100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10 mL Serological Pipet</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>100 &#181;m Cell Filter</td>
			<td>MidSci</td>
			<td>100ICS</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>15 mL centrifuge tubes</td>
			<td>Corning</td>
			<td>430052</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2 mL Cryovial</td>
			<td>Simport Scientific</td>
			<td>T301-2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2% Paraformaldehyde Fixative</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>37 &#176;C water bath&#160;</td>
			<td>NEST</td>
			<td>602052</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3dGRO R-Spondin-1 Conditioned Media Supplement</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>SCM104</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>6 well plates</td>
			<td>TPP</td>
			<td>92006</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>70% Ethanol</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>R31541GA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>A83-01</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>SML0788</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Advanced DMEM/F12</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>12634028</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agar</td>
			<td>Lamda Biotech</td>
			<td>C121</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>B-27</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>17504044</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge&#160;</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cultrex Type 2</td>
			<td>R&#38;D Systems</td>
			<td>3533-010-02</td>
			<td>basement membrane extract</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNase I</td>
			<td>New England Bio Labs</td>
			<td>M0303S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNase I Reaction Buffer</td>
			<td>New England Bio Labs</td>
			<td>M0303S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EGF</td>
			<td>PeproTech</td>
			<td>AF-100-15</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FBS&#160;</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>F2442</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FGF-10</td>
			<td>PeproTech</td>
			<td>100-26</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FGF2</td>
			<td>PeproTech</td>
			<td>100-18B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>gentleMACS C Tubes</td>
			<td>Miltenyi BioTech</td>
			<td>130-096-334</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>gentleMACS Octo Dissociator with Heaters</td>
			<td>Miltenyi BioTech</td>
			<td>130-096-427</td>
			<td>We use the manufacturers protocol.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GlutaMAX</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>35050061</td>
			<td>dipeptide, L-alanyl-L-glutamine</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hematoxylin and Eosin Staining Kit</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>NC1470670</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Histoplast Paraffin Wax</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>22900700</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microcentrifuge&#160;</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mr. Frosty Freezing Container</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>07202363S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N-acetylcysteine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A9165</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nicotinamide</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>N0636</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>p1000 Pipette with Tips&#160;</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>p200 Pipette with Tips&#160;</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pasteur Pipettes 9&#34;</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>1367820D</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>MT21031CM</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipet Controller</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Prostaglandin E2</td>
			<td>R&#38;D Systems</td>
			<td>2296</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Puromycin&#160;</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>A1113802</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recombinant Murine Noggin</td>
			<td>PeproTech</td>
			<td>250-38</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recovery Cell Culture Freezing Medium</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>12648010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Red Blood Cell Lysis Buffer</td>
			<td>BioLegend</td>
			<td>420301</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ROCK Inhibitor (Y-27632)</td>
			<td>R&#38;D Systems</td>
			<td>1254/1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SB202190</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S7076</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T75 Flask</td>
			<td>MidSci</td>
			<td>TP90076</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue Culture Hood&#160;</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue Embedding Cassette</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TrypLE Express</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>12604013</td>
			<td>animal origin-free, recombinant enzyme</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Type II Collagenase</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>17101015</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vortex</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

generation and culturing of high-grade serous ovarian cancer patient-derived organoids

オルガノイドは、患者由来の卵巣腫瘍組織、腹水、または胸水から正常に増殖できる3D動的腫瘍モデルであり、卵巣癌の新しい治療法と予測バイオマーカーの発見に役立ちます。 これらのモデルは、クローンの不均一性、腫瘍微小環境、および細胞間および細胞-マトリックス相互作用を再現しています。さらに、それらは形態学的、細胞学的、免疫組織化学的、および遺伝的に原発腫瘍と一致することが示されています。したがって、オルガノイドは腫瘍細胞および腫瘍微小環境に関する研究を容易にし、細胞株よりも優れています。本プロトコルは、97%を超える成功率で患者の腫瘍、腹水、および胸水サンプルから患者由来の卵巣癌オルガノイドを生成するための異なる方法について説明しています。患者サンプルは、機械的消化と酵素消化の両方によって細胞懸濁液に分離されます。次に、基底膜抽出物(BME)を利用して細胞を播種し、高悪性度漿液性卵巣癌(HGSOC)の培養に特異的なサプリメントを含む最適化された増殖培地でサポートします。最初のオルガノイドを形成した後、PDOは、その後の実験のための増殖のための継代を含む、長期間の培養を維持することができる。

PDOを生成するために、サンプルを機械的および酵素的に単一細胞懸濁液に消化しました。次に、細胞をBMEに再懸濁し、特別に操作された培地を添加しました(図3)。オルガノイドは通常、10日間の時間枠で樹立され、その後、培養中に個別のオルガノイドを示します(図4)。
<img alt="Figure 3" class="xfigi...

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Generation and Culturing of High-Grade Serous Ovarian Cancer Patient-Derived Organoids

患者由来オルガノイド(PDO)は、 in vitroで腫瘍環境を模倣できる3次元(3D)培養です。高悪性度漿液性卵巣がんにおいて、PDOは新しいバイオマーカーと治療法を研究するためのモデルです。

高悪性度漿液性卵巣癌患者由来オルガノイドの作製と培養

Organoids are 3D dynamic tumor models that can be grown successfully from patient-derived ovarian tumor tissue, ascites, or pleural fluid and aid in the ...

患者駆動型オルガノイドモデルは、遺伝的および機能的に親腫瘍を表すため、卵巣癌における新しい治療法および複雑な生物学的プロセスを研究するための信頼できるモデルです。これらのモデルは、クローンの不均一性、腫瘍微小環境、およびin vitro細胞間相互作用を再現することにより、癌細胞株および患者由来の異種移植片の限界を克服します。患者由来のオルガノイドは、長期的な拡張および保存機能を提供し、腫瘍生理機能を模倣します。その結果、それらは新しい治療法や予測バイオマーカーの研究に理想的なモデルです。腫瘍サンプルを10センチメートルの組織培養皿に入れ、組織を細かく刻んで使い捨てメスを使用して均質な混合物を作成することにより、オルガノイドの採取を開始します。均質な組織混合物を鉗子を使用して解離チューブに入れる。1〜2ミリリットルの均質化組織ごとに、オルガノイドベース培地中の1ミリリットルあたり1ミリグラムのタイプ2コラゲナーゼ溶液と1ミリリットルのDNase One溶液1ミリリットルを7〜8ミリリットル加えます。溶液を458 Gでボルテックスし、解離機を使用してコラゲナーゼ溶液中に組織を液化します。プログラム37CアンダースコアHアンダースコアTDKを1時間3回実行し、単一セル懸濁液となるまで実行する。完了したら、均質化した混合物を新しい50ミリリットルの円錐管に移します。20〜40ミリリットルのオルガノイドベース培地を加え、458 Gで溶液をボルテックスし、100マイクロメートルのセルストレーナーを通して溶液をろ過して、新しくラベル付けされた50ミリリットルのコニカルチューブに入れます。次に、濾過した混合物を1,650Gで摂氏4度で5分間遠心分離し、ガラス製牧草ピペットを用いて上清を吸引する。1ミリリットルあたり100マイクログラムのDnase Oneを調製し、滴下賢明なDNase One溶液を加えて、1ミリリットルのDnase One溶液に細胞を再懸濁します。室温で15分間インキュベートした後、25ミリリットルのオルガノイドベース培地を細胞に加え、転覆させて混合します。次に、細胞を摂氏4度で5分間1, 650 Gで遠心分離し、ガラス製牧草地ピペットを使用して上清を注意深く吸引します。新しく形成された細胞ペレットを、5ミリリットルの予熱した赤血球またはRBC溶解バッファーに再懸濁します。各円錐管内の溶液を458 Gでボルテックスし、5分間インキュベートします。再度、RBC溶解緩衝液に懸濁したペレットを遠心分離し、ガラス製牧草ピペットを用いて上清を吸引する。ペレットを10ミリリットルのPBSで洗浄し、細胞を遠心分離する前に細胞をボルテックスします。大きな細胞ペレットの場合は、PBSを吸引し、ペレットの上に1ミリリットルのオルガノイドベース培地を追加します。溶液をボルテックスした後、300〜400マイクロリットルの細胞懸濁液を微小遠心チューブに移します。5分間の遠心分離後、上清を吸引し、コールドチップを使用して基底膜抽出物(BME)およびオルガノイドベース培地に再懸濁します。再懸濁した細胞溶液を40マイクロリットルのアリコートで6ウェルプレートにプレートします。ウェルあたり最大5つのアリコートをプレートします。直ちにウェルプレートをインキュベーターに20分間置き、インキュベーション後、2ミリリットルの完全オルガノイド培地を各ウェルに静かに加えます。各ウェルに1ミリリットルのオルガノイドベース培地を加え、培地を上下にピペットでオルガノイドタブ上に直接ピペットで入れて解離させます。再懸濁したペレットを含むすべての培地を15ミリリットルのコニカルチューブに集めます。次いで、混合物を入れた15ミリリットルのコニカルチューブを5分間遠心分離してから上清を吸引する。1ミリリットルの動物由来の遊離組換え酵素を細胞ペレットに加える。ボルテックスによって混合し、懸濁液を1.5ミリリットルの微量遠心チューブに移します。摂氏37度のウォーターバス中で15分間インキュベートし、5分間遠心分離した後、上清を吸引する。ペレットをBMEおよびオルガノイドベース培地に再懸濁し、再懸濁した細胞溶液を40マイクロリットルのアリコートで6ウェルプレートにプレートします。ウェルあたり最大5つのアリコートをプレートします。20分間のインキュベーション後、2ミリリットルの完全オルガノイド培地を各ウェルに静かに加えます。継代オルガノイド細胞ペレットを0.5〜1ミリリットルの回収細胞培養凍結培地に再懸濁し、各クライオバイアルに1ミリリットルを移してから、マイナス80度と液体窒素タンクに移して長期保存します。液体窒素に保存されたクライオバイアルを摂氏37度の水浴に移してオルガノイドを解凍します。解凍したら、オルガノイドを15ミリリットルのコニカルチューブに移し、遠心分離してから上清を吸引します。次に、ペレットに1ミリリットルのPBSを加え、再懸濁したペレットを1.5ミリリットルの微量遠心チューブに移し、摂氏4度で1,650Gで5分間遠心分離した後、ガラス製牧草ピペットを用いて上清を注意深く吸引する。ペレットをBMEおよびオルガノイドベース培地に再懸濁し、再懸濁した細胞を40マイクロリットルのアリコートで6ウェルプレートにプレートします。ウェルごとに最大5つのアリコートを配置します。プレートを直ちにインキュベーターに20分間入れてから、2ミリリットルの完全オルガノイド培地をウェルに加えます。オルガノイドは10日間にわたって樹立され、その後、培養において個別のオルガノイドが示されました。患者由来のオルガノイド培養は、それらをアガロースに包埋し、ヘマトキシリンおよびエオジン染色で評価することによって評価されました。BMEと協力する際の課題を考慮することが重要です。セルペレットとBMEの再懸濁は、プロセスで気泡が形成されないように氷上で行う必要があります。この技術により、ネオアジュバント化学療法を受けた患者が直面する問題によるオルガノイドの生成と発達に対する化学療法の影響に関するさらなる研究が可能になります。

Research

JoVE Journal

Cancer Research

Establishment of Gastric Cancer Patient-derived Xenograft Models and Primary Cell Lines

胃癌患者由来異種移植片モデルおよび原発細胞株の確立

The use of preclinical models to advance our understanding of tumor biology and investigate the efficacy of therapeutic agents is key to cancer research. ...

High-Throughput In Vitro Assay using Patient-Derived Tumor Organoids

High-Throughput In Vitro Assay using Patient-Derived Tumor Organoids

患者由来腫瘍オルガノイドを用いたイン ビトロ アッセイのハイスループット

Patient-derived tumor organoids (PDOs) are expected to be a preclinical cancer model with better reproducibility of disease than traditional cell culture ...

Profiling Sensitivity to Targeted Therapies in EGFR-Mutant NSCLC Patient-Derived Organoids

EGFR変異型NSCLC患者由来オルガノイドにおける標的療法に対する感受性のプロファイリング

Novel 3D cancer organoid cultures derived from clinical patient specimens represent an important model system to evaluate intratumor heterogeneity and ...

Orthotopic Implantation of Patient-Derived Cancer Cells in Mice Recapitulates Advanced Colorectal Cancer

進行性大腸癌を再現するマウスへの患者由来癌細胞の同所性移植

Over the last decade, more sophisticated preclinical colorectal cancer (CRC) models have been established using patient-derived cancer cells and 3D ...

Establishment and Culture of Patient-Derived Breast Organoids

患者由来乳房オルガノイドの確立と培養

Breast cancer is a complex disease that has been classified into several different histological and molecular subtypes. Patient-derived breast tumor ...

Visualizing DNA Damage Repair Proteins in Patient-Derived Ovarian Cancer Organoids via Immunofluorescence Assays

Visualizing DNA Damage Repair Proteins in Patient-Derived Ovarian Cancer Organoids via Immunofluorescence Assays

免疫蛍光アッセイ による 患者由来卵巣がんオルガノイド中のDNA損傷修復タンパク質の可視化(英語)

Immunofluorescence is one of the most widely used techniques to visualize target antigens with high sensitivity and specificity, allowing for the accurate ...

Ovarian Cancer Patient-Derived Organoid Models for Pre-Clinical Drug Testing

Ovarian cancer is a fatal gynecologic cancer and the fifth leading cause of cancer death among women in the United States. Developing new drug treatments ...

Automated Kinetic Imaging for Drug Assessment in Patient-Derived Tumor Organoids

Multiplexed Live-Cell Imaging for Drug Responses in Patient-Derived Organoid Models of Cancer

Author Spotlight: Developing Multiplexed Kinetic Assays for Organoid-Based Drug Response Analysis

Patient-derived organoid (PDO) models of cancer are a multifunctional research system that better recapitulates human disease as compared to cancer cell ...

Derivation of 3D Glioma Organoids from Chopper-Processed Patient Tumors

Cultivating Ex Vivo Patient-Derived Glioma Organoids Using a Tissue Chopper

Author Spotlight: Enhanced Generation of Patient-Derived 3D Organoids for Glioblastoma and Glioma

Glioblastoma, IDH-wild type, CNS WHO grade 4 (GBM) is a primary brain tumor associated with poor patient survival despite aggressive treatment. Developing ...

Standardizing Ovarian Cancer Organoid Biobanking

Strategy for Biobanking of Ovarian Cancer Organoids: Addressing the Interpatient Heterogeneity across Histological Subtypes and Disease Stages

Author Spotlight: Advancing Personalized Medicine in Ovarian Cancer 

卵巣がんオルガノイドのバイオバンキング戦略:組織学的サブタイプと疾患病期にわたる患者間の不均一性への対処

While the establishment of an ovarian cancer biobank from patient-derived organoids along with their clinical background information promises advances in ...