Name: generation and culturing of high-grade serous ovarian cancer patient-derived organoids
Uploaded: 2023-01-06T14:50:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Generation and Culturing of High-Grade Serous Ovarian Cancer Patient-Derived Organoids at JoVE.com

이 프로토콜을 수립하는 데 있어 Ron Bose, MD, PhD의 지도와 Barbara Blachut, MD의 도움에 감사드립니다. 또한 이 프로젝트를 지원해 주신 세인트루이스 산부인과 및 부인과 종양학과에 있는 워싱턴 대학교 의과대학, 워싱턴 대학교 학장 장학생 프로그램 및 생식 과학자 개발 프로그램에 감사드립니다.

연구를 위해 수집된 모든 인체 조직 표본은 IRB(Institutional Review Board) 승인 프로토콜에 따라 획득되었습니다. 아래에 요약된 프로토콜은 멸균 인체 조직 배양 환경에서 수행되었습니다. 정보에 입각한 서면 동의는 인간 피험자로부터 얻었습니다. 적격 환자는 난소암 진단 또는 추정 진단을 받았고, 정보에 입각한 동의서에 서명할 의지와 능력이 있어야 하며, 18세 이상이어야 했습니다. 종양 조직(악...

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	<li>Bray, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Global+cancer+statistics+2018:+GLOBOCAN+estimates+of+incidence+and+mortality+worldwide+for+36+cancers+in+185+countries.">Global cancer statistics 2018: GLOBOCAN estimates of incidence and mortality worldwide for 36 cancers in 185 countries.</a> CA: A Cancer Journal for Clinicians. 68 (6), 394-424 (2018).</li><li>Drost, J., Clevers, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Organoids+in+cancer+research.">Organoids in cancer research.</a> Nature Reviews Cancer. 18 (7), 407-418 (2018).</li><li>Pauli, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Personalized+in+vitro+and+in+vivo+cancer+models+to+guide+precision+medicine.">Personalized in vitro and in vivo cancer models to guide precision medicine.</a> Cancer Discovery. 7 (5), 462-477 (2017).</li><li>Fujii, E., Kato, A., Suzuki, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Patient-derived+xenograft+(PDX)+models:+Characteristics+and+points+to+consider+for+the+process+of+establishment.">Patient-derived xenograft (PDX) models: Characteristics and points to consider for the process of establishment.</a> Journal of Toxicologic Pathology. 33 (3), 153-160 (2020).</li><li>Yang, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Application+of+ovarian+cancer+organoids+in+precision+medicine:+Key+challenges+and+current+opportunities.">Application of ovarian cancer organoids in precision medicine: Key challenges and current opportunities.</a> Frontiers in Cell and Developmental Biology. 9, 701429 (2021).</li><li>Yang, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Patient-derived+organoids:+A+promising+model+for+personalized+cancer+treatment.">Patient-derived organoids: A promising model for personalized cancer treatment.</a> Gastroenterology Report. 6 (4), 243-245 (2018).</li><li>Karakasheva, T. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+and+characterization+of+patient-derived+head+and+neck,+oral,+and+esophageal+cancer+organoids.">Generation and characterization of patient-derived head and neck, oral, and esophageal cancer organoids.</a> Current Protocols in Stem Cell Biology. 53 (1), 109 (2020).</li><li>Madison, B. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Let-7+represses+carcinogenesis+and+a+stem+cell+phenotype+in+the+intestine+via+regulation+of+Hmga2.">Let-7 represses carcinogenesis and a stem cell phenotype in the intestine via regulation of Hmga2.</a> PLoS Genetics. 11 (8), 1005408 (2015).</li><li>Sato, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single+Lgr5+stem+cells+build+crypt-villus+structures+in+vitro+without+a+mesenchymal+niche.">Single Lgr5 stem cells build crypt-villus structures in vitro without a mesenchymal niche.</a> Nature. 459 (7244), 262-265 (2009).</li><li>Murray, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=HER2+and+APC+mutations+promote+altered+crypt-villus+morphology+and+marked+hyperplasia+in+the+intestinal+epithelium.">HER2 and APC mutations promote altered crypt-villus morphology and marked hyperplasia in the intestinal epithelium.</a> Cellular and Molecular Gastroenterology and Hepatology. 12 (3), 1105-1120 (2021).</li><li>Hill, S. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Prediction+of+DNA+repair+inhibitor+response+in+short-term+patient-derived+ovarian+cancer+organoids.">Prediction of DNA repair inhibitor response in short-term patient-derived ovarian cancer organoids.</a> Cancer Discovery. 8 (11), 1404-1421 (2018).</li><li>Passarelli, M. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Leucyl-tRNA+synthetase+is+a+tumour+suppressor+in+breast+cancer+and+regulates+codon-dependent+translation+dynamics.">Leucyl-tRNA synthetase is a tumour suppressor in breast cancer and regulates codon-dependent translation dynamics.</a> Nature Cell Biology. 24 (3), 307-315 (2022).</li><li>Pleguezuelos-Manzano, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Establishment+and+culture+of+human+intestinal+organoids+derived+from+adult+stem+cells.">Establishment and culture of human intestinal organoids derived from adult stem cells.</a> Current Protocols in Immunology. 130 (1), 106 (2020).</li><li>Stumm, M. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Validation+of+a+postfixation+tissue+storage+and+transport+medium+to+preserve+histopathology+and+molecular+pathology+analyses+(total+and+phosphoactivated+proteins,+and+FISH).">Validation of a postfixation tissue storage and transport medium to preserve histopathology and molecular pathology analyses (total and phosphoactivated proteins, and FISH).</a> American Journal of Clinical Pathology. 137 (3), 429-436 (2012).</li><li>Feldman, A. T., Wolfe, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tissue+processing+and+hematoxylin+and+eosin+staining.">Tissue processing and hematoxylin and eosin staining.</a> Methods in Molecular Biology. 1180, 31-43 (2014).</li><li>Ooft, S. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Patient-derived+organoids+can+predict+response+to+chemotherapy+in+metastatic+colorectal+cancer+patients.">Patient-derived organoids can predict response to chemotherapy in metastatic colorectal cancer patients.</a> Science Translational Medicine. 11 (513), (2019).</li><li>Aisenbrey, E. A., Murphy, W. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synthetic+alternatives+to+Matrigel.">Synthetic alternatives to Matrigel.</a> Nature Reviews Materials. 5 (7), 539-551 (2020).</li><li>Nanki, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Patient-derived+ovarian+cancer+organoids+capture+the+genomic+profiles+of+primary+tumours+applicable+for+drug+sensitivity+and+resistance+testing.">Patient-derived ovarian cancer organoids capture the genomic profiles of primary tumours applicable for drug sensitivity and resistance testing.</a> Scientific Reports. 10, 12581 (2020).</li><li>Mead, B. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Screening+for+modulators+of+the+cellular+composition+of+gut+epithelia+via+organoid+models+of+intestinal+stem+cell+differentiation.">Screening for modulators of the cellular composition of gut epithelia via organoid models of intestinal stem cell differentiation.</a> Nature Biomedical Engineering. 6 (4), 476-494 (2022).</li></ol>

난소암은 진단 시 진행 단계와 화학 요법 내성의 일반적인 발달로 인해 매우 치명적입니다. 난소암 연구의 많은 발전은 암 세포주와 PDX 모델을 활용하여 이루어졌습니다. 그러나 보다 대표적이고 저렴한 시험관 내 모델에 대한 분명한 필요성이 있습니다. PDO는 원발성 종양의 종양 이질성, 종양 미세환경, 게놈 및 전사체적 특징을 정확하게 나타내는 것으로 입증되었으며, 따라서 약물 요법?...

2021년에 미국에서 약 21,410명의 여성이 상피성 난소암 진단을 받았고 12,940명의 여성이 이 질병으로 사망했습니다1. 수술과 화학요법이 충분히 발전했음에도 불구하고, 진행성 질환 환자의 70% 이상이 화학요법 내성이 나타나 진단 후 5년 이내에 사망한다 2,3. 따라서 이 치명적인 질병을 치료하기 위한 새로운 전략과 전임상 연구를 위한 대표적이고 신뢰할 수 있는 모델이 시급히 필요합니다.
원발성 난소 종양에서 생성된 암 세포주와 환자 유래 이종이식(PDX)은 난소암 연구에 사용되는 주요 도구입니다. 암 세포주의 주요 장점은 빠른 확장입니다. 그러나 이들의 지속적인 배양은 암 세포주가 원래의 원발성 암 종양 샘플에서 벗어나게 하는 표현형 및 유전형 변화를 초래합니다. 암 세포주와 원발성 종양 사이의 기존 차이로 인해, 세포주에서 긍정적인 영향을 미치는 약물 분석은 임상 시험에서 동일한 효과를 나타내지 못한다2. 이러한 한계를 극복하기 위해 PDX 모델이 사용됩니다. 이 모델은 신선한 난소암 조직을 면역 결핍 마우스에 이식하여 만들어집니다. 생체 내 모델이기 때문에 인간의 생물학적 특성과 더 정확하게 유사하고 약물 결과를 더 잘 예측할 수 있습니다. 그러나 이러한 모델에는 생성에 필요한 비용, 시간 및 자원을 포함하여 상당한 제한이 있습니다4.
PDO는 암 세포주와 PDX 모델 모두의 한계를 극복하는 전임상 연구를 위한 대안 모델을 제공합니다. PDO는 환자의 종양 및 종양 미세 환경을 요약하여 전임상 연구에 이상적인 시험관 내 다루기 쉬운 모델을 제공합니다 2,3,5. 이러한 3D 모델에는 원발성 종양을 모델링하는 자기 조직화 기능이 있으며, 이는 2차원(2D) 세포주에는 없는 기능입니다. 또한, 이러한 모델은 유전적으로 및 기능적으로 모 종양을 나타내는 것으로 나타났으며, 따라서 새로운 치료법 및 생물학적 과정을 연구하기 위한 신뢰할 수 있는 모델입니다. 요컨대, 이들은 세포주와 유사한 장기 확장 및 저장 기능을 제공할 뿐만 아니라 마우스 모델 4,6에 내재된 미세 환경 및 세포-세포 상호 작용도 포함합니다.
본 프로토콜은 97% 이상의 성공률로 환자 유래 종양, 복수 및 흉막액 샘플로부터 PDO의 생성을 설명합니다. 그런 다음 PDO 배양을 여러 세대에 걸쳐 확장하여 약물 요법 감수성 및 예측 바이오마커를 테스트하는 데 사용할 수 있습니다. 이 방법은 PDO의 치료 반응에 기초하여 치료를 개인화하는 데 사용될 수 있는 기술을 나타낸다.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>1% HEPES</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>15630080</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1% Penicillin-Streptomycin</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>30002CI</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1.5 mL Eppendorf Tubes&#160;</td>
			<td>Genesee Scientific</td>
			<td>14125</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10 cm Tissue Culture Dish&#160;</td>
			<td>TPP</td>
			<td>93100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10 mL Serological Pipet</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>100 &#181;m Cell Filter</td>
			<td>MidSci</td>
			<td>100ICS</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>15 mL centrifuge tubes</td>
			<td>Corning</td>
			<td>430052</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2 mL Cryovial</td>
			<td>Simport Scientific</td>
			<td>T301-2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2% Paraformaldehyde Fixative</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>37 &#176;C water bath&#160;</td>
			<td>NEST</td>
			<td>602052</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3dGRO R-Spondin-1 Conditioned Media Supplement</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>SCM104</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>6 well plates</td>
			<td>TPP</td>
			<td>92006</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>70% Ethanol</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>R31541GA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>A83-01</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>SML0788</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Advanced DMEM/F12</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>12634028</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agar</td>
			<td>Lamda Biotech</td>
			<td>C121</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>B-27</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>17504044</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge&#160;</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cultrex Type 2</td>
			<td>R&#38;D Systems</td>
			<td>3533-010-02</td>
			<td>basement membrane extract</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNase I</td>
			<td>New England Bio Labs</td>
			<td>M0303S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNase I Reaction Buffer</td>
			<td>New England Bio Labs</td>
			<td>M0303S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EGF</td>
			<td>PeproTech</td>
			<td>AF-100-15</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FBS&#160;</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>F2442</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FGF-10</td>
			<td>PeproTech</td>
			<td>100-26</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FGF2</td>
			<td>PeproTech</td>
			<td>100-18B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>gentleMACS C Tubes</td>
			<td>Miltenyi BioTech</td>
			<td>130-096-334</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>gentleMACS Octo Dissociator with Heaters</td>
			<td>Miltenyi BioTech</td>
			<td>130-096-427</td>
			<td>We use the manufacturers protocol.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GlutaMAX</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>35050061</td>
			<td>dipeptide, L-alanyl-L-glutamine</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hematoxylin and Eosin Staining Kit</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>NC1470670</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Histoplast Paraffin Wax</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>22900700</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microcentrifuge&#160;</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mr. Frosty Freezing Container</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>07202363S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N-acetylcysteine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A9165</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nicotinamide</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>N0636</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>p1000 Pipette with Tips&#160;</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>p200 Pipette with Tips&#160;</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pasteur Pipettes 9&#34;</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>1367820D</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>MT21031CM</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipet Controller</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Prostaglandin E2</td>
			<td>R&#38;D Systems</td>
			<td>2296</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Puromycin&#160;</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>A1113802</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recombinant Murine Noggin</td>
			<td>PeproTech</td>
			<td>250-38</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recovery Cell Culture Freezing Medium</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>12648010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Red Blood Cell Lysis Buffer</td>
			<td>BioLegend</td>
			<td>420301</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ROCK Inhibitor (Y-27632)</td>
			<td>R&#38;D Systems</td>
			<td>1254/1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SB202190</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S7076</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T75 Flask</td>
			<td>MidSci</td>
			<td>TP90076</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue Culture Hood&#160;</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue Embedding Cassette</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TrypLE Express</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>12604013</td>
			<td>animal origin-free, recombinant enzyme</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Type II Collagenase</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>17101015</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vortex</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

generation and culturing of high-grade serous ovarian cancer patient-derived organoids

오가노이드는 환자 유래 난소 종양 조직, 복수 또는 흉수에서 성공적으로 성장할 수 있는 3D 동적 종양 모델이며 난소암에 대한 새로운 치료법 및 예측 바이오마커의 발견을 돕습니다. 이 모델은 클론 이질성, 종양 미세 환경, 세포-세포 및 세포-기질 상호 작용을 요약합니다. 또한, 그들은 형태학적으로, 세포학적으로, 면역조직화학적으로, 유전적으로 원발성 종양과 일치하는 것으로 나타났습니다. 따라서 오가노이드는 종양 세포 및 종양 미세 환경에 대한 연구를 용이하게 하며 세포주보다 우수합니다. 현재 프로토콜은 97% 이상의 성공률로 환자 종양, 복수 및 흉막액 샘플에서 환자 유래 난소암 오가노이드를 생성하는 고유한 방법을 설명합니다. 환자 샘플은 기계적 및 효소 분해에 의해 세포 현탁액으로 분리됩니다. 그런 다음 기저막 추출물(BME)을 사용하여 세포를 도말하고 고급 장액성 난소암(HGSOC)의 배양에 특이적인 보충제를 포함하는 최적화된 성장 배지로 지지합니다. 초기 오가노이드를 형성한 후 PDO는 후속 실험을 위한 확장을 위한 계대배양을 포함하여 장기간 배양을 지속할 수 있습니다.

PDO를 생성하기 위해, 샘플을 기계적 및 효소적으로 단일 세포 현탁액으로 분해하였다. 그런 다음 세포를 BME에 재현탁하고 특별히 조작된 배지로 보충했습니다(그림 3). 오가노이드는 일반적으로 10일의 기간 동안 확립되며, 그 후 배양에서 개별 오가노이드를 입증합니다(그림 4).
<img alt="Figure 3" class="...

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Generation and Culturing of High-Grade Serous Ovarian Cancer Patient-Derived Organoids

환자 유래 오가노이드(PDO)는 시험관 내에서 종양 환경을 모방할 수 있는 3차원(3D) 배양물입니다. 고급 장액성 난소암에서 PDO는 새로운 바이오마커 및 치료제를 연구하기 위한 모델을 나타냅니다.

고급 장액성 난소암 환자 유래 오가노이드의 생성 및 배양

Organoids are 3D dynamic tumor models that can be grown successfully from patient-derived ovarian tumor tissue, ascites, or pleural fluid and aid in the ...

환자 드라이브 오가노이드 모델은 유전적 및 기능적으로 모 종양을 나타내므로 난소암에서 새로운 치료법 및 복잡한 생물학적 과정을 연구하기 위한 신뢰할 수 있는 모델입니다. 클론 이질성, 종양 미세 환경 및 시험관 내 세포 대 세포 상호 작용을 요약함으로써 이러한 모델은 암 세포주 및 환자 유래 이종 이식편의 한계를 극복합니다. 환자 유래 오가노이드는 장기 확장 및 저장 기능을 제공하고 종양 생리학을 모방합니다.결과적으로 새로운 치료법 및 예측 바이오마커 연구에 이상적인 모델입니다. 종양 샘플을 10cm 조직 배양 접시에 넣고 조직을 다져서 일회용 메스를 사용하여 균질한 혼합물을 만들어 오가노이드 수확을 시작합니다. 집게를 사용하여 균질 조직 혼합물을 해리 튜브에 넣습니다.균질화된 조직 1 내지 2밀리리터마다 오가노이드 염기 배지에 밀리리터당 1밀리그램의 2형 콜라게나제 용액 7 내지 8밀리리터와 DNase 1 용액 1밀리리터를 첨가한다. 458 G.Lique에 있는 458 G.Liquidy에 있는 해결책에 소용돌이 모양 조직은 해리 기계를 사용하여 collagenase 해결책에 있는 동안 합니다. 37C 밑줄, H 밑줄, TDK 3이 단일 세포 현탁액이 될 때까지 1시간 동안 프로그램을 실행한다.완료되면 균질화된 혼합물을 새로운 50밀리리터 원뿔형 튜브로 옮깁니다. 20 내지 40 밀리리터의 오가노이드 베이스 배지를 첨가하고 458 G에서 용액을 와동시킨 다음 100 마이크로미터 셀 스트레이너를 통해 용액을 새로 라벨이 붙은 50 밀리리터 원뿔형 튜브로 여과한다. 다음으로, 여과된 혼합물을 섭씨 4도에서 5분 동안 1, 650 G에서 원심분리하고, 유리 목초지 피펫을 이용하여 상층액을 흡인한다.밀리리터당 100마이크로그램의 Dnase One을 준비하고 드롭 와이즈 DNase One 용액을 추가하여 1밀리리터의 Dnase One 용액에 세포를 재현탁합니다. 실온에서 15분 동안 배양한 후 25밀리리터의 오가노이드 염기 배지를 세포에 첨가하고 뒤집어 혼합합니다. 그런 다음 세포를 섭씨 4도에서 5 분 동안 1, 650 G에서 원심 분리하고 유리 목초지 피펫을 사용하여 상청액을 조심스럽게 흡인합니다.새로 형성된 세포 펠릿을 5밀리리터의 미리 데워진 적혈구 또는 RBC 용해 완충액에 재현탁합니다. 각 원뿔형 튜브의 용액을 458G에서 소용돌이 치고 5 분 동안 배양합니다. 다시, 펠릿을 RBC 용해 완충액에 현탁하여 원심분리하고, 유리 목초지 피펫을 사용하여 상청액을 흡인한다.펠렛을 10 밀리리터 PBS로 세척하고 세포를 원심분리하기 전에 세포를 와동시킨다. 큰 세포 펠릿의 경우 PBS를 흡인하고 펠릿 위에 오가노이드 기본 배지 1밀리리터를 추가합니다. 용액을 와동시킨 후, 300 내지 400 마이크로리터의 세포 현탁액을 마이크로원심분리 튜브로 옮긴다.5분 동안 원심분리한 후 상층액을 흡인하고 기저막 추출물(BME)과 콜드 팁을 사용하여 오가노이드 기본 배지에 재현탁합니다. 재현탁된 세포 용액을 40 마이크로리터 분취량의 6웰 플레이트에 플레이트합니다. 웰 당 최대 5 개의 부분 표본을 플레이트합니다.즉시 웰 플레이트를 인큐베이터에 20 분 동안 넣고 인큐베이션 후 2 밀리리터의 완전한 오가노이드 배지를 각 웰에 부드럽게 첨가한다. 각 웰에 1밀리리터의 오가노이드 기본 배지를 추가하고 해리를 위해 배지를 오가노이드 탭에 직접 위아래로 피펫팅합니다. 15 밀리리터 원뿔형 튜브에 재현 탁 된 펠릿을 포함하는 모든 매체를 수집하십시오.이어서, 상층액을 흡인하기 전에 혼합물을 함유하는 15 밀리리터 원뿔형 튜브를 5분 동안 원심분리한다. 1 밀리리터의 동물 유래 유리 재조합 효소를 세포 펠릿에 첨가하십시오. 와동으로 혼합하고 현탁액을 1.5 밀리리터 마이크로 원심 분리기 튜브로 옮깁니다.섭씨 37도의 수조에서 15분간 배양하고 5분간 원심분리한 후 상층액을 흡인합니다. 펠릿을 BME 및 오가노이드 기본 배지에 재현탁하고 재현탁된 세포 용액을 40마이크로리터 분취량으로 6웰 플레이트에 플레이트합니다. 웰 당 최대 5 개의 부분 표본을 플레이트합니다.20 분 배양 후, 2 밀리리터의 완전한 오가노이드 배지를 각 웰에 부드럽게 첨가한다. 통과 오가노이드 세포 펠릿을 0.5-1밀리리터의 회수 세포 배양 냉동 배지에 재현탁하고 각 극저온 바이알에 1밀리리터를 옮긴 후 영하 80도로 옮기고 장기 보관을 위해 액체 질소 탱크에 옮깁니다. 액체 질소에 보관된 극저온 바이알을 섭씨 37도 수조로 옮겨 오가노이드를 해동합니다.해동되면 오가노이드를 15밀리리터 원뿔형 튜브로 옮기고 원심분리한 후 상층액을 흡인합니다. 다음으로, 펠렛에 PBS 1 밀리리터를 첨가하고, 재현탁된 펠렛을 1.5 밀리리터 미세원심분리 튜브에 옮기고, 섭씨 4도에서 5분 동안 1, 650 G에서 원심분리한 후, 유리 목초지 피펫을 이용하여 상층액을 조심스럽게 흡인한다. 펠릿을 BME 및 오가노이드 기본 배지에 재현탁하고 재현탁된 세포를 40마이크로리터 분취량으로 6웰 플레이트에 플레이트합니다.웰 당 최대 5 개의 부분 표본을 배치하십시오. 즉시 플레이트를 인큐베이터에 20분 동안 넣은 후 2밀리리터의 완전한 오가노이드 배지를 웰에 추가합니다. 오가노이드는 10일 후에 확립된 후 배양에서 분리된 오가노이드를 입증했습니다.환자 유래 오가노이드 배양은 이들을 아가로스에 내장하고 헤마톡실린 및 에오신 염색으로 평가하여 평가했습니다. BME 작업의 어려움을 고려하는 것이 중요합니다. 세포 펠릿과 BME의 재현탁은 얼음 위에서 이루어져야 공정에서 기포가 형성되지 않습니다.이 기술은 신보강 화학요법을 받은 환자가 직면하는 문제로 인해 오가노이드 생성 및 발달에 대한 화학요법의 영향에 대한 추가 연구를 가능하게 합니다.

Research

JoVE Journal

Cancer Research

Establishment of Gastric Cancer Patient-derived Xenograft Models and Primary Cell Lines

위암 환자 유래 이종이식 모델 및 1차 세포주 구축

The use of preclinical models to advance our understanding of tumor biology and investigate the efficacy of therapeutic agents is key to cancer research. ...

연구

암 연구학

High-Throughput In Vitro Assay using Patient-Derived Tumor Organoids

High-Throughput In Vitro Assay using Patient-Derived Tumor Organoids

환자 유래 종양 오르가노이드를 사용하여 시험관 분석에서 높은 처리량

Patient-derived tumor organoids (PDOs) are expected to be a preclinical cancer model with better reproducibility of disease than traditional cell culture ...

Profiling Sensitivity to Targeted Therapies in EGFR-Mutant NSCLC Patient-Derived Organoids

EGFR 돌연변이 NSCLC 환자 유래 오가노이드에서 표적 치료법에 대한 민감도 프로파일링

Novel 3D cancer organoid cultures derived from clinical patient specimens represent an important model system to evaluate intratumor heterogeneity and ...

Orthotopic Implantation of Patient-Derived Cancer Cells in Mice Recapitulates Advanced Colorectal Cancer

생쥐에서 환자 유래 암세포의 정형외피 이식은 진행성 대장암을 재현합니다.

Over the last decade, more sophisticated preclinical colorectal cancer (CRC) models have been established using patient-derived cancer cells and 3D ...

Establishment and Culture of Patient-Derived Breast Organoids

환자 유래 유방 오가노이드의 확립 및 배양

Breast cancer is a complex disease that has been classified into several different histological and molecular subtypes. Patient-derived breast tumor ...

Visualizing DNA Damage Repair Proteins in Patient-Derived Ovarian Cancer Organoids via Immunofluorescence Assays

Visualizing DNA Damage Repair Proteins in Patient-Derived Ovarian Cancer Organoids via Immunofluorescence Assays

면역형광 분석을 통한 환자 유래 난소암 오가노이드의 DNA 손상 복구 단백질 시각화

Immunofluorescence is one of the most widely used techniques to visualize target antigens with high sensitivity and specificity, allowing for the accurate ...

Ovarian Cancer Patient-Derived Organoid Models for Pre-Clinical Drug Testing

Ovarian cancer is a fatal gynecologic cancer and the fifth leading cause of cancer death among women in the United States. Developing new drug treatments ...

Automated Kinetic Imaging for Drug Assessment in Patient-Derived Tumor Organoids

Multiplexed Live-Cell Imaging for Drug Responses in Patient-Derived Organoid Models of Cancer

Author Spotlight: Developing Multiplexed Kinetic Assays for Organoid-Based Drug Response Analysis

Patient-derived organoid (PDO) models of cancer are a multifunctional research system that better recapitulates human disease as compared to cancer cell ...

Derivation of 3D Glioma Organoids from Chopper-Processed Patient Tumors

Cultivating Ex Vivo Patient-Derived Glioma Organoids Using a Tissue Chopper

Author Spotlight: Enhanced Generation of Patient-Derived 3D Organoids for Glioblastoma and Glioma

Glioblastoma, IDH-wild type, CNS WHO grade 4 (GBM) is a primary brain tumor associated with poor patient survival despite aggressive treatment. Developing ...

Standardizing Ovarian Cancer Organoid Biobanking

Strategy for Biobanking of Ovarian Cancer Organoids: Addressing the Interpatient Heterogeneity across Histological Subtypes and Disease Stages

Author Spotlight: Advancing Personalized Medicine in Ovarian Cancer 

난소암 오가노이드의 바이오뱅킹 전략: 조직학적 아형 및 질병 단계에 걸친 환자 간 이질성 해결

While the establishment of an ovarian cancer biobank from patient-derived organoids along with their clinical background information promises advances in ...