Name: generation and culturing of high-grade serous ovarian cancer patient-derived organoids
Uploaded: 2023-01-06T14:50:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Generation and Culturing of High-Grade Serous Ovarian Cancer Patient-Derived Organoids at JoVE.com

Vi er takknemlige for veiledningen fra Ron Bose, MD, PhD, og hjelpen fra Barbara Blachut, MD, i etableringen av denne protokollen. Vi ønsker også å anerkjenne Washington University's School of Medicine i St. Louis Department of Obstetrics and Gynecology og Division of Gynecologic Oncology, Washington University's Dean's Scholar Program, og Reproductive Scientist Development Program for deres støtte til dette prosjektet.

Alle humane vevsprøver samlet for forskning ble oppnådd i henhold til Institutional Review Board (IRB) -godkjent protokoll. Protokollene som er skissert nedenfor ble utført i et sterilt humant vevskulturmiljø. Informert skriftlig samtykke ble innhentet fra mennesker. Kvalifiserte pasienter måtte ha en diagnose eller antatt diagnose av eggstokkreft, være villige og i stand til å signere informert samtykke, og være minst 18 år. Tumorvev (malign primærtumor eller metastaserende steder), ascites og pleuravæske ble...

<ol>
	<li>Bray, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Global+cancer+statistics+2018:+GLOBOCAN+estimates+of+incidence+and+mortality+worldwide+for+36+cancers+in+185+countries.">Global cancer statistics 2018: GLOBOCAN estimates of incidence and mortality worldwide for 36 cancers in 185 countries.</a> CA: A Cancer Journal for Clinicians. 68 (6), 394-424 (2018).</li><li>Drost, J., Clevers, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Organoids+in+cancer+research.">Organoids in cancer research.</a> Nature Reviews Cancer. 18 (7), 407-418 (2018).</li><li>Pauli, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Personalized+in+vitro+and+in+vivo+cancer+models+to+guide+precision+medicine.">Personalized in vitro and in vivo cancer models to guide precision medicine.</a> Cancer Discovery. 7 (5), 462-477 (2017).</li><li>Fujii, E., Kato, A., Suzuki, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Patient-derived+xenograft+(PDX)+models:+Characteristics+and+points+to+consider+for+the+process+of+establishment.">Patient-derived xenograft (PDX) models: Characteristics and points to consider for the process of establishment.</a> Journal of Toxicologic Pathology. 33 (3), 153-160 (2020).</li><li>Yang, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Application+of+ovarian+cancer+organoids+in+precision+medicine:+Key+challenges+and+current+opportunities.">Application of ovarian cancer organoids in precision medicine: Key challenges and current opportunities.</a> Frontiers in Cell and Developmental Biology. 9, 701429 (2021).</li><li>Yang, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Patient-derived+organoids:+A+promising+model+for+personalized+cancer+treatment.">Patient-derived organoids: A promising model for personalized cancer treatment.</a> Gastroenterology Report. 6 (4), 243-245 (2018).</li><li>Karakasheva, T. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+and+characterization+of+patient-derived+head+and+neck,+oral,+and+esophageal+cancer+organoids.">Generation and characterization of patient-derived head and neck, oral, and esophageal cancer organoids.</a> Current Protocols in Stem Cell Biology. 53 (1), 109 (2020).</li><li>Madison, B. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Let-7+represses+carcinogenesis+and+a+stem+cell+phenotype+in+the+intestine+via+regulation+of+Hmga2.">Let-7 represses carcinogenesis and a stem cell phenotype in the intestine via regulation of Hmga2.</a> PLoS Genetics. 11 (8), 1005408 (2015).</li><li>Sato, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single+Lgr5+stem+cells+build+crypt-villus+structures+in+vitro+without+a+mesenchymal+niche.">Single Lgr5 stem cells build crypt-villus structures in vitro without a mesenchymal niche.</a> Nature. 459 (7244), 262-265 (2009).</li><li>Murray, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=HER2+and+APC+mutations+promote+altered+crypt-villus+morphology+and+marked+hyperplasia+in+the+intestinal+epithelium.">HER2 and APC mutations promote altered crypt-villus morphology and marked hyperplasia in the intestinal epithelium.</a> Cellular and Molecular Gastroenterology and Hepatology. 12 (3), 1105-1120 (2021).</li><li>Hill, S. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Prediction+of+DNA+repair+inhibitor+response+in+short-term+patient-derived+ovarian+cancer+organoids.">Prediction of DNA repair inhibitor response in short-term patient-derived ovarian cancer organoids.</a> Cancer Discovery. 8 (11), 1404-1421 (2018).</li><li>Passarelli, M. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Leucyl-tRNA+synthetase+is+a+tumour+suppressor+in+breast+cancer+and+regulates+codon-dependent+translation+dynamics.">Leucyl-tRNA synthetase is a tumour suppressor in breast cancer and regulates codon-dependent translation dynamics.</a> Nature Cell Biology. 24 (3), 307-315 (2022).</li><li>Pleguezuelos-Manzano, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Establishment+and+culture+of+human+intestinal+organoids+derived+from+adult+stem+cells.">Establishment and culture of human intestinal organoids derived from adult stem cells.</a> Current Protocols in Immunology. 130 (1), 106 (2020).</li><li>Stumm, M. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Validation+of+a+postfixation+tissue+storage+and+transport+medium+to+preserve+histopathology+and+molecular+pathology+analyses+(total+and+phosphoactivated+proteins,+and+FISH).">Validation of a postfixation tissue storage and transport medium to preserve histopathology and molecular pathology analyses (total and phosphoactivated proteins, and FISH).</a> American Journal of Clinical Pathology. 137 (3), 429-436 (2012).</li><li>Feldman, A. T., Wolfe, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tissue+processing+and+hematoxylin+and+eosin+staining.">Tissue processing and hematoxylin and eosin staining.</a> Methods in Molecular Biology. 1180, 31-43 (2014).</li><li>Ooft, S. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Patient-derived+organoids+can+predict+response+to+chemotherapy+in+metastatic+colorectal+cancer+patients.">Patient-derived organoids can predict response to chemotherapy in metastatic colorectal cancer patients.</a> Science Translational Medicine. 11 (513), (2019).</li><li>Aisenbrey, E. A., Murphy, W. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synthetic+alternatives+to+Matrigel.">Synthetic alternatives to Matrigel.</a> Nature Reviews Materials. 5 (7), 539-551 (2020).</li><li>Nanki, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Patient-derived+ovarian+cancer+organoids+capture+the+genomic+profiles+of+primary+tumours+applicable+for+drug+sensitivity+and+resistance+testing.">Patient-derived ovarian cancer organoids capture the genomic profiles of primary tumours applicable for drug sensitivity and resistance testing.</a> Scientific Reports. 10, 12581 (2020).</li><li>Mead, B. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Screening+for+modulators+of+the+cellular+composition+of+gut+epithelia+via+organoid+models+of+intestinal+stem+cell+differentiation.">Screening for modulators of the cellular composition of gut epithelia via organoid models of intestinal stem cell differentiation.</a> Nature Biomedical Engineering. 6 (4), 476-494 (2022).</li></ol>

Eggstokkreft er ekstremt dødelig på grunn av sitt avanserte stadium ved diagnose, samt den vanlige utviklingen av kjemoterapiresistens. Mange fremskritt innen eggstokkreftforskning har blitt gjort ved å bruke kreftcellelinjer og PDX-modeller; Det er imidlertid et åpenbart behov for en mer representativ og rimelig in vitro-modell . PUD har vist seg å nøyaktig representere tumorheterogeniteten, tumormikromiljøet og de genomiske og transkriptomiske egenskapene til deres primære svulster, og er dermed ideell...

I 2021 ble omtrent 21,410 kvinner i USA nylig diagnostisert med epitelial eggstokkreft, og 12,940 kvinner døde av denne sykdommen1. Selv om det er gjort tilstrekkelige fremskritt innen kirurgi og kjemoterapi, utvikler over 70% av pasientene med avansert sykdom kjemoterapeutisk resistens og dør innen 5 år etter diagnose 2,3. Dermed er det behov for nye strategier for å behandle denne dødelige sykdommen og representative, pålitelige modeller for preklinisk forskning.
Kreftcellelinjer og pasientavledede xenotransplantater (PDX) opprettet fra primære eggstokktumorer er de viktigste instrumentene som brukes i eggstokkreftforskning. En stor fordel med kreftcellelinjer er deres raske ekspansjon. Imidlertid resulterer deres kontinuerlige kultur i fenotypiske og genotypiske endringer som får kreftcellelinjene til å avvike fra den opprinnelige primære krefttumorprøven. På grunn av de eksisterende forskjellene mellom kreftcellelinjen og primærtumoren, kan legemiddelanalyser som har positive effekter i cellelinjer ikke ha de samme effektene i kliniske studier2. For å overvinne disse begrensningene brukes PDX-modeller. Disse modellene er opprettet ved å implantere ferskt eggstokkreftvev i immundefekte mus. Som de er in vivo-modeller , ligner de mer nøyaktig menneskelige biologiske egenskaper og er i sin tur mer prediktive for legemiddelutfall. Disse modellene har imidlertid også betydelige begrensninger, inkludert kostnadene, tiden og ressursene som trengs for å generere dem4.
PUD tilbyr en alternativ modell for preklinisk forskning som overvinner begrensningene til både kreftcellelinjer og PDX-modeller. PUD rekapitulerer pasientens tumor- og tumormikromiljø og gir dermed en in vitro håndterbar modell ideell for preklinisk forskning 2,3,5. Disse 3D-modellene har selvorganiseringsfunksjoner som modellerer primærtumoren, som er en funksjon som deres todimensjonale (2D) cellelinje-kolleger ikke har. Videre har disse modellene vist seg å genetisk og funksjonelt representere deres foreldretumorer og er dermed pålitelige modeller for å studere nye terapier og biologiske prosesser. Kort sagt, de tilbyr langsiktige utvidelses- og lagringsmuligheter som ligner på cellelinjer, men omfatter også mikromiljøet og celle-celle-interaksjonene som ligger i musemodeller 4,6.
Den nåværende protokollen beskriver opprettelsen av PUD fra pasientavledede svulster, ascites og pleuravæskeprøver med en høyere enn 97% suksessrate. PUD-kulturene kan deretter utvides i flere generasjoner og brukes til å teste følsomhet for legemiddelbehandling og prediktive biomarkører. Denne metoden representerer en teknikk som kan brukes til å tilpasse behandlinger basert på terapeutiske responser fra PUD.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>1% HEPES</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>15630080</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1% Penicillin-Streptomycin</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>30002CI</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1.5 mL Eppendorf Tubes&#160;</td>
			<td>Genesee Scientific</td>
			<td>14125</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10 cm Tissue Culture Dish&#160;</td>
			<td>TPP</td>
			<td>93100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10 mL Serological Pipet</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>100 &#181;m Cell Filter</td>
			<td>MidSci</td>
			<td>100ICS</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>15 mL centrifuge tubes</td>
			<td>Corning</td>
			<td>430052</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2 mL Cryovial</td>
			<td>Simport Scientific</td>
			<td>T301-2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2% Paraformaldehyde Fixative</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>37 &#176;C water bath&#160;</td>
			<td>NEST</td>
			<td>602052</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3dGRO R-Spondin-1 Conditioned Media Supplement</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>SCM104</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>6 well plates</td>
			<td>TPP</td>
			<td>92006</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>70% Ethanol</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>R31541GA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>A83-01</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>SML0788</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Advanced DMEM/F12</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>12634028</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agar</td>
			<td>Lamda Biotech</td>
			<td>C121</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>B-27</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>17504044</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge&#160;</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cultrex Type 2</td>
			<td>R&#38;D Systems</td>
			<td>3533-010-02</td>
			<td>basement membrane extract</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNase I</td>
			<td>New England Bio Labs</td>
			<td>M0303S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNase I Reaction Buffer</td>
			<td>New England Bio Labs</td>
			<td>M0303S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EGF</td>
			<td>PeproTech</td>
			<td>AF-100-15</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FBS&#160;</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>F2442</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FGF-10</td>
			<td>PeproTech</td>
			<td>100-26</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FGF2</td>
			<td>PeproTech</td>
			<td>100-18B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>gentleMACS C Tubes</td>
			<td>Miltenyi BioTech</td>
			<td>130-096-334</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>gentleMACS Octo Dissociator with Heaters</td>
			<td>Miltenyi BioTech</td>
			<td>130-096-427</td>
			<td>We use the manufacturers protocol.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GlutaMAX</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>35050061</td>
			<td>dipeptide, L-alanyl-L-glutamine</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hematoxylin and Eosin Staining Kit</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>NC1470670</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Histoplast Paraffin Wax</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>22900700</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microcentrifuge&#160;</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mr. Frosty Freezing Container</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>07202363S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N-acetylcysteine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A9165</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nicotinamide</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>N0636</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>p1000 Pipette with Tips&#160;</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>p200 Pipette with Tips&#160;</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pasteur Pipettes 9&#34;</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>1367820D</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>MT21031CM</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipet Controller</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Prostaglandin E2</td>
			<td>R&#38;D Systems</td>
			<td>2296</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Puromycin&#160;</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>A1113802</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recombinant Murine Noggin</td>
			<td>PeproTech</td>
			<td>250-38</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recovery Cell Culture Freezing Medium</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>12648010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Red Blood Cell Lysis Buffer</td>
			<td>BioLegend</td>
			<td>420301</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ROCK Inhibitor (Y-27632)</td>
			<td>R&#38;D Systems</td>
			<td>1254/1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SB202190</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S7076</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T75 Flask</td>
			<td>MidSci</td>
			<td>TP90076</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue Culture Hood&#160;</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue Embedding Cassette</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TrypLE Express</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>12604013</td>
			<td>animal origin-free, recombinant enzyme</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Type II Collagenase</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>17101015</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vortex</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

generation and culturing of high-grade serous ovarian cancer patient-derived organoids

Organoider er 3D-dynamiske tumormodeller som kan dyrkes vellykket fra pasientavledet ovarietumorvev, ascites eller pleuravæske og hjelpe til med oppdagelsen av nye terapier og prediktive biomarkører for eggstokkreft. Disse modellene rekapitulerer klonal heterogenitet, tumormikromiljøet og cellecelle- og cellematriseinteraksjoner. I tillegg har de vist seg å matche den primære svulsten morfologisk, cytologisk, immunhistokjemisk og genetisk. Dermed letter organoider forskning på tumorceller og tumormikromiljøet og er overlegne cellelinjer. Denne protokollen beskriver forskjellige metoder for å generere pasientavledede eggstokkreftorganoider fra pasienttumorer, ascites og pleuravæskeprøver med en høyere enn 97% suksessrate. Pasientprøvene separeres i cellulære suspensjoner ved både mekanisk og enzymatisk fordøyelse. Cellene blir deretter belagt ved hjelp av et kjellermembranekstrakt (BME) og støttes med optimaliserte vekstmedier som inneholder kosttilskudd som er spesifikke for dyrking av høyverdig serøs eggstokkreft (HGSOC). Etter å ha dannet innledende organoider, kan PUDene opprettholde langsiktig kultur, inkludert passasje for utvidelse for påfølgende eksperimenter.

For å generere PUD ble prøvene fordøyd mekanisk og enzymatisk til encellede suspensjoner. Cellene ble deretter resuspendert i BME og supplert med spesifikt konstruerte medier (figur 3). Organoider etableres typisk over en tidsramme på 10 dager, hvoretter de påviser diskrete organoider i kultur (figur 4).
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64878/64878fig03.jpg"><br...

Watch this Scientific Journal Video about Generation and Culturing of High-Grade Serous Ovarian Cancer Patient-Derived Organoids at JoVE.com

Generation and Culturing of High-Grade Serous Ovarian Cancer Patient-Derived Organoids

Pasientavledede organoider (PUD) er en tredimensjonal (3D) kultur som kan etterligne tumormiljøet in vitro. I høygradig serøs eggstokkreft representerer PUD en modell for å studere nye biomarkører og terapi.

Generering og dyrking av høygradig serøs eggstokkreft Pasientavledede organoider

Organoids are 3D dynamic tumor models that can be grown successfully from patient-derived ovarian tumor tissue, ascites, or pleural fluid and aid in the ...

Pasientdrevne organoidmodeller representerer genetisk og funksjonelt sine foreldretumorer og er dermed pålitelige modeller for å studere nye terapier og komplekse biologiske prosesser i eggstokkreft. Ved å rekapitulere klonal heterogenitet, tumormikromiljøet og in vitro-celle-til-celle-interaksjoner, overvinner disse modellene begrensningene i kreftcellelinjer og pasientavledede xenotransplantater. Pasientavledede organoider tilbyr langsiktig ekspansjon og lagringsmuligheter og etterligner tumorfysiologi.Som et resultat er de ideelle modeller for studier av nye terapier og prediktive biomarkører. Begynn høsting av organoider ved å plassere tumorprøvene i en 10 centimeter vevskulturskål og hakke vevet for å skape en homogen blanding ved hjelp av en engangs skalpell. Plasser den homogene vevsblandingen i et dissosiasjonsrør ved hjelp av tang.For hver og en til to milliliter homogenisert vev tilsett syv til åtte milliliter av ett milligram per milliliter type to kollagenaseoppløsning i organoid basemedium og en milliliter DNase One-løsning. Vortex løsningen ved 458 G.Fortynn vevet mens det er i kollagenaseoppløsningen ved hjelp av dissosiasjonsmaskinen. Kjør programmet 37 C understreke H understreke TDK tre en time til det er en enkelt celle suspensjon.Når du er ferdig, overfør den homogeniserte blandingen til et nytt 50 milliliter konisk rør. Tilsett 20 til 40 ml organoid basemedium og virvel løsningen ved 458 G.Filtrer deretter løsningen gjennom en 100 mikrometer cellesil i et nylig merket 50 milliliter konisk rør. Deretter sentrifugerer du den filtrerte blandingen ved 1.650 G i fem minutter ved fire grader Celsius og aspirerer supernatanten ved hjelp av en glasspastipipette.Forbered 100 mikrogram per milliliter Dnase One og resuspender cellene i en milliliter Dnase One-løsning ved å legge til dråpevis DNase One-løsning. Etter 15 minutters inkubasjon ved romtemperatur tilsett 25 ml organoid basemedium til cellene og inverter for å blande. Sentrifuger deretter cellene ved 1.650 G i fem minutter ved fire grader Celsius og aspirer supernatanten forsiktig ved hjelp av en glasspastipette.Resuspender den nydannede cellepelleten i fem milliliter forvarmet rød blodcelle eller RBC-lysebuffer. Vortex løsningene i hvert konisk rør ved 458 G og inkuber i fem minutter. Igjen, sentrifuger pelleten suspendert i RBC-lysisbuffer og aspirer supernatanten ved hjelp av en glassbeitepipette.Vask pelleten med 10 milliliter PBS og virvel cellene før sentrifugering av cellene. For en stor cellepellet, aspirer PBS og tilsett en milliliter av det organoide basemediet på toppen av pelleten. Etter vortexing av løsningen, overfør 300 til 400 mikroliter av cellesuspensjonen til et mikrosentrifugerør.Etter fem minutters sentrifugering, aspirer supernatanten og resuspender den i kjellermembranekstrakt, eller BME, og organoid basemedium ved hjelp av kalde tips. Plate den resuspenderte celleoppløsningen i en seks-brønnplate i 40 mikroliter alikoter. Plate opptil fem alikoter per brønn.Legg straks brønnplaten i inkubatoren i 20 minutter, og etter inkubasjonen tilsettes forsiktig to milliliter av det komplette organoidmediet i hver brønn. Tilsett en milliliter organoid basemedium til hver brønn og pipetter mediet opp og ned direkte på organoidfanene for dissosiasjon. Samle alt mediet som inneholder de resuspenderte pellets i et 15 milliliter konisk rør.Deretter sentrifugerer du det 15 milliliter koniske røret som inneholder blandingen i fem minutter før du aspirerer supernatanten. Tilsett en milliliter fritt rekombinant enzym av animalsk opprinnelse til cellepelleten. Bland ved vortexing og overfør suspensjonen til et 1,5 milliliter mikrosentrifugerør.Etter 15 minutters inkubasjon i et 37 graders vannbad og fem minutters sentrifugering, aspirer supernatanten. Resuspender pelleten i BME og organoid basemedium og plate den resuspenderte celleoppløsningen i en seksbrønnsplate i 40 mikroliter alikoter. Plate opptil fem alikoter per brønn.Etter 20 minutters inkubasjon, tilsett forsiktig to milliliter av det komplette organoidmediet i hver brønn. Resuspender passasjeorganoidcellepelleten i 0,5 til en milliliter frysemedium for gjenopprettingscellekultur og overfør en milliliter til hvert kryohetteglass før de overføres til minus 80 grader og flytende nitrogentank for langtidslagring. Tine organoidene ved å overføre kryoflaskene lagret i flytende nitrogen til 37 grader Celsius vannbad.Når de er tint, overfør organoidene til et 15 milliliter konisk rør og sentrifuge dem før du aspirerer supernatanten. Deretter tilsettes en milliliter PBS til pelleten og overfører den resuspenderte pelleten til et 1.5 milliliter mikrosentrifugerør Etter sentrifugering ved 1.650 G i fem minutter ved fire grader Celsius, aspirer supernatanten forsiktig ved hjelp av en glasspastipipette. Resuspender pelleten i BME og organoid basemedium og plate de resuspenderte cellene på en seksbrønnsplate i 40 mikroliters alikoter.Plasser opptil fem alikoter per brønn. Legg platen umiddelbart i inkubatoren i 20 minutter før du tilsetter to milliliter komplett organoid medium til brønnene. Organoider ble etablert over 10 dager, hvoretter de demonstrerte diskrete organoider i kultur.Pasientavledede organoidkulturer ble vurdert ved å legge dem inn i agarose og evaluere dem med hematoksylin- og eosinfarging. Det er viktig å vurdere utfordringene ved å jobbe med BME. Resuspensjonen av cellepelleten og BME må gjøres på is, slik at det ikke dannes bobler i prosessen.Denne teknikken tillater videre forskning på virkningen av kjemoterapi på organoid generering og utvikling på grunn av problemene som pasienter som har gjennomgått neoadjuvant kjemoterapi.

Research

JoVE Journal

Cancer Research

Establishment of Gastric Cancer Patient-derived Xenograft Models and Primary Cell Lines

Etablering av magekreft pasient-avledet Xenograft modeller og primær celle Lines

The use of preclinical models to advance our understanding of tumor biology and investigate the efficacy of therapeutic agents is key to cancer research. ...

High-Throughput In Vitro Assay using Patient-Derived Tumor Organoids

High-Throughput In Vitro Assay using Patient-Derived Tumor Organoids

High-Throughput In Vitro Assay ved bruk av pasientavledede tumororganoider

Patient-derived tumor organoids (PDOs) are expected to be a preclinical cancer model with better reproducibility of disease than traditional cell culture ...

Profiling Sensitivity to Targeted Therapies in EGFR-Mutant NSCLC Patient-Derived Organoids

Profilering av følsomhet for målrettede terapier i EGFR-mutant NSCLC pasientavledede organoider

Novel 3D cancer organoid cultures derived from clinical patient specimens represent an important model system to evaluate intratumor heterogeneity and ...

Orthotopic Implantation of Patient-Derived Cancer Cells in Mice Recapitulates Advanced Colorectal Cancer

Ortotopisk implantasjon av pasientavledede kreftceller hos mus rekapitulerer avansert kolorektal kreft

Over the last decade, more sophisticated preclinical colorectal cancer (CRC) models have been established using patient-derived cancer cells and 3D ...

Establishment and Culture of Patient-Derived Breast Organoids

Etablering og kultur av pasientavledede brystorganoider

Breast cancer is a complex disease that has been classified into several different histological and molecular subtypes. Patient-derived breast tumor ...

Visualizing DNA Damage Repair Proteins in Patient-Derived Ovarian Cancer Organoids via Immunofluorescence Assays

Visualizing DNA Damage Repair Proteins in Patient-Derived Ovarian Cancer Organoids via Immunofluorescence Assays

Visualisering av DNA-skadereparasjonsproteiner i pasientavledede eggstokkreftorganoider via immunfluorescensanalyser

Immunofluorescence is one of the most widely used techniques to visualize target antigens with high sensitivity and specificity, allowing for the accurate ...

Ovarian Cancer Patient-Derived Organoid Models for Pre-Clinical Drug Testing

Ovarian cancer is a fatal gynecologic cancer and the fifth leading cause of cancer death among women in the United States. Developing new drug treatments ...

Automated Kinetic Imaging for Drug Assessment in Patient-Derived Tumor Organoids

Multiplexed Live-Cell Imaging for Drug Responses in Patient-Derived Organoid Models of Cancer

Author Spotlight: Developing Multiplexed Kinetic Assays for Organoid-Based Drug Response Analysis

Patient-derived organoid (PDO) models of cancer are a multifunctional research system that better recapitulates human disease as compared to cancer cell ...

Derivation of 3D Glioma Organoids from Chopper-Processed Patient Tumors

Cultivating Ex Vivo Patient-Derived Glioma Organoids Using a Tissue Chopper

Author Spotlight: Enhanced Generation of Patient-Derived 3D Organoids for Glioblastoma and Glioma

Glioblastoma, IDH-wild type, CNS WHO grade 4 (GBM) is a primary brain tumor associated with poor patient survival despite aggressive treatment. Developing ...

Standardizing Ovarian Cancer Organoid Biobanking

Strategy for Biobanking of Ovarian Cancer Organoids: Addressing the Interpatient Heterogeneity across Histological Subtypes and Disease Stages

Author Spotlight: Advancing Personalized Medicine in Ovarian Cancer 

Strategi for biobanking av ovariecancer organoider: adressering interpatient heterogenitet på tvers av histologiske subtyper og sykdomsstadier

While the establishment of an ovarian cancer biobank from patient-derived organoids along with their clinical background information promises advances in ...