Name: generation and culturing of high-grade serous ovarian cancer patient-derived organoids
Uploaded: 2023-01-06T14:50:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Generation and Culturing of High-Grade Serous Ovarian Cancer Patient-Derived Organoids at JoVE.com

Мы благодарны за руководство Рону Бозе, доктору медицины, доктору философии, и за помощь Барбары Блахут, доктора медицины, в создании этого протокола. Мы также хотели бы поблагодарить Медицинскую школу Вашингтонского университета в Сент-Луисе, кафедру акушерства и гинекологии и отделение гинекологической онкологии, Программу стипендий декана Вашингтонского университета и Программу развития репродуктологов за поддержку этого проекта.

Все образцы тканей человека, собранные для исследования, были получены в соответствии с протоколом, одобренным Институциональным наблюдательным советом (IRB). Протоколы, изложенные ниже, были выполнены в стерильной среде культивирования тканей человека. Информированное письменное сог?...

<ol>
	<li>Bray, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Global+cancer+statistics+2018:+GLOBOCAN+estimates+of+incidence+and+mortality+worldwide+for+36+cancers+in+185+countries.">Global cancer statistics 2018: GLOBOCAN estimates of incidence and mortality worldwide for 36 cancers in 185 countries.</a> CA: A Cancer Journal for Clinicians. 68 (6), 394-424 (2018).</li><li>Drost, J., Clevers, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Organoids+in+cancer+research.">Organoids in cancer research.</a> Nature Reviews Cancer. 18 (7), 407-418 (2018).</li><li>Pauli, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Personalized+in+vitro+and+in+vivo+cancer+models+to+guide+precision+medicine.">Personalized in vitro and in vivo cancer models to guide precision medicine.</a> Cancer Discovery. 7 (5), 462-477 (2017).</li><li>Fujii, E., Kato, A., Suzuki, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Patient-derived+xenograft+(PDX)+models:+Characteristics+and+points+to+consider+for+the+process+of+establishment.">Patient-derived xenograft (PDX) models: Characteristics and points to consider for the process of establishment.</a> Journal of Toxicologic Pathology. 33 (3), 153-160 (2020).</li><li>Yang, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Application+of+ovarian+cancer+organoids+in+precision+medicine:+Key+challenges+and+current+opportunities.">Application of ovarian cancer organoids in precision medicine: Key challenges and current opportunities.</a> Frontiers in Cell and Developmental Biology. 9, 701429 (2021).</li><li>Yang, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Patient-derived+organoids:+A+promising+model+for+personalized+cancer+treatment.">Patient-derived organoids: A promising model for personalized cancer treatment.</a> Gastroenterology Report. 6 (4), 243-245 (2018).</li><li>Karakasheva, T. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+and+characterization+of+patient-derived+head+and+neck,+oral,+and+esophageal+cancer+organoids.">Generation and characterization of patient-derived head and neck, oral, and esophageal cancer organoids.</a> Current Protocols in Stem Cell Biology. 53 (1), 109 (2020).</li><li>Madison, B. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Let-7+represses+carcinogenesis+and+a+stem+cell+phenotype+in+the+intestine+via+regulation+of+Hmga2.">Let-7 represses carcinogenesis and a stem cell phenotype in the intestine via regulation of Hmga2.</a> PLoS Genetics. 11 (8), 1005408 (2015).</li><li>Sato, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single+Lgr5+stem+cells+build+crypt-villus+structures+in+vitro+without+a+mesenchymal+niche.">Single Lgr5 stem cells build crypt-villus structures in vitro without a mesenchymal niche.</a> Nature. 459 (7244), 262-265 (2009).</li><li>Murray, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=HER2+and+APC+mutations+promote+altered+crypt-villus+morphology+and+marked+hyperplasia+in+the+intestinal+epithelium.">HER2 and APC mutations promote altered crypt-villus morphology and marked hyperplasia in the intestinal epithelium.</a> Cellular and Molecular Gastroenterology and Hepatology. 12 (3), 1105-1120 (2021).</li><li>Hill, S. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Prediction+of+DNA+repair+inhibitor+response+in+short-term+patient-derived+ovarian+cancer+organoids.">Prediction of DNA repair inhibitor response in short-term patient-derived ovarian cancer organoids.</a> Cancer Discovery. 8 (11), 1404-1421 (2018).</li><li>Passarelli, M. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Leucyl-tRNA+synthetase+is+a+tumour+suppressor+in+breast+cancer+and+regulates+codon-dependent+translation+dynamics.">Leucyl-tRNA synthetase is a tumour suppressor in breast cancer and regulates codon-dependent translation dynamics.</a> Nature Cell Biology. 24 (3), 307-315 (2022).</li><li>Pleguezuelos-Manzano, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Establishment+and+culture+of+human+intestinal+organoids+derived+from+adult+stem+cells.">Establishment and culture of human intestinal organoids derived from adult stem cells.</a> Current Protocols in Immunology. 130 (1), 106 (2020).</li><li>Stumm, M. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Validation+of+a+postfixation+tissue+storage+and+transport+medium+to+preserve+histopathology+and+molecular+pathology+analyses+(total+and+phosphoactivated+proteins,+and+FISH).">Validation of a postfixation tissue storage and transport medium to preserve histopathology and molecular pathology analyses (total and phosphoactivated proteins, and FISH).</a> American Journal of Clinical Pathology. 137 (3), 429-436 (2012).</li><li>Feldman, A. T., Wolfe, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tissue+processing+and+hematoxylin+and+eosin+staining.">Tissue processing and hematoxylin and eosin staining.</a> Methods in Molecular Biology. 1180, 31-43 (2014).</li><li>Ooft, S. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Patient-derived+organoids+can+predict+response+to+chemotherapy+in+metastatic+colorectal+cancer+patients.">Patient-derived organoids can predict response to chemotherapy in metastatic colorectal cancer patients.</a> Science Translational Medicine. 11 (513), (2019).</li><li>Aisenbrey, E. A., Murphy, W. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synthetic+alternatives+to+Matrigel.">Synthetic alternatives to Matrigel.</a> Nature Reviews Materials. 5 (7), 539-551 (2020).</li><li>Nanki, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Patient-derived+ovarian+cancer+organoids+capture+the+genomic+profiles+of+primary+tumours+applicable+for+drug+sensitivity+and+resistance+testing.">Patient-derived ovarian cancer organoids capture the genomic profiles of primary tumours applicable for drug sensitivity and resistance testing.</a> Scientific Reports. 10, 12581 (2020).</li><li>Mead, B. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Screening+for+modulators+of+the+cellular+composition+of+gut+epithelia+via+organoid+models+of+intestinal+stem+cell+differentiation.">Screening for modulators of the cellular composition of gut epithelia via organoid models of intestinal stem cell differentiation.</a> Nature Biomedical Engineering. 6 (4), 476-494 (2022).</li></ol>

Рак яичников чрезвычайно смертелен из-за его поздней стадии при постановке диагноза, а также из-за общего развития резистентности к химиотерапии. Многие успехи в исследованиях рака яичников были достигнуты за счет использования линий раковых клеток и моделей PDX; Тем не менее, существуе...

В 2021 году примерно у 21 410 женщин в Соединенных Штатах был впервые диагностирован эпителиальный рак яичников, и 12 940 женщин умерли от этого заболевания1. Несмотря на то, что в хирургии и химиотерапии были достигнуты достаточные успехи, более 70% пациентов с прогрессирующим заболеванием развивают химиотерапевтическую резистентность и умирают в течение 5 лет после постановки диагноза 2,3. Таким образом, срочно необходимы новые стратегии лечения этого смертельного заболевания и репрезентативные, надежные модели для доклинических исследований.
Линии раковых клеток и ксенотрансплантаты, полученные от пациентов (PDX), созданные из первичных опухолей яичников, являются основными инструментами, используемыми в исследованиях рака яичников. Основным преимуществом линий раковых клеток является их быстрое распространение. Однако их постоянное культивирование приводит к фенотипическим и генотипическим изменениям, которые заставляют линии раковых клеток отклоняться от исходного образца первичной раковой опухоли. Из-за существующих различий между линией раковых клеток и первичной опухолью анализы лекарств, которые оказывают положительное влияние на клеточные линии, не имеют таких же эффектов в клинических испытаниях2. Для преодоления этих ограничений используются модели PDX. Эти модели создаются путем имплантации свежей ткани рака яичников иммунодефицитным мышам. Поскольку они являются моделями in vivo , они более точно напоминают биологические характеристики человека и, в свою очередь, более предсказывают результаты приема лекарств. Однако эти модели также имеют существенные ограничения, включая стоимость, время и ресурсы, необходимые для их создания4.
PDO предлагают альтернативную модель для доклинических исследований, которая преодолевает ограничения как линий раковых клеток, так и моделей PDX. PDO повторяют опухоль пациента и микроокружение опухоли и, таким образом, обеспечивают управляемую модель in vitro, идеально подходящую для доклинических исследований 2,3,5. Эти 3D-модели обладают возможностями самоорганизации, которые моделируют первичную опухоль, что является особенностью, которой не обладают их двумерные (2D) аналоги клеточной линии. Кроме того, было показано, что эти модели генетически и функционально представляют свои родительские опухоли и, таким образом, являются надежными моделями для изучения новых терапевтических и биологических процессов. Короче говоря, они предлагают возможности долгосрочного расширения и хранения, аналогичные клеточным линиям, но также охватывают микроокружение и межклеточные взаимодействия, присущие мышиным моделям 4,6.
Настоящий протокол описывает создание PDO из образцов опухолей, асцита и плевральной жидкости, полученных от пациентов, с вероятностью успеха более 97%. Затем культуры PDO могут быть расширены для нескольких поколений и использованы для тестирования чувствительности лекарственной терапии и прогностических биомаркеров. Этот метод представляет собой технику, которая может быть использована для персонализации лечения на основе терапевтических реакций PDO.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>1% HEPES</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>15630080</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1% Penicillin-Streptomycin</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>30002CI</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1.5 mL Eppendorf Tubes&#160;</td>
			<td>Genesee Scientific</td>
			<td>14125</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10 cm Tissue Culture Dish&#160;</td>
			<td>TPP</td>
			<td>93100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10 mL Serological Pipet</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>100 &#181;m Cell Filter</td>
			<td>MidSci</td>
			<td>100ICS</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>15 mL centrifuge tubes</td>
			<td>Corning</td>
			<td>430052</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2 mL Cryovial</td>
			<td>Simport Scientific</td>
			<td>T301-2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2% Paraformaldehyde Fixative</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>37 &#176;C water bath&#160;</td>
			<td>NEST</td>
			<td>602052</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3dGRO R-Spondin-1 Conditioned Media Supplement</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>SCM104</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>6 well plates</td>
			<td>TPP</td>
			<td>92006</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>70% Ethanol</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>R31541GA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>A83-01</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>SML0788</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Advanced DMEM/F12</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>12634028</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agar</td>
			<td>Lamda Biotech</td>
			<td>C121</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>B-27</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>17504044</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge&#160;</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cultrex Type 2</td>
			<td>R&#38;D Systems</td>
			<td>3533-010-02</td>
			<td>basement membrane extract</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNase I</td>
			<td>New England Bio Labs</td>
			<td>M0303S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNase I Reaction Buffer</td>
			<td>New England Bio Labs</td>
			<td>M0303S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EGF</td>
			<td>PeproTech</td>
			<td>AF-100-15</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FBS&#160;</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>F2442</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FGF-10</td>
			<td>PeproTech</td>
			<td>100-26</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FGF2</td>
			<td>PeproTech</td>
			<td>100-18B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>gentleMACS C Tubes</td>
			<td>Miltenyi BioTech</td>
			<td>130-096-334</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>gentleMACS Octo Dissociator with Heaters</td>
			<td>Miltenyi BioTech</td>
			<td>130-096-427</td>
			<td>We use the manufacturers protocol.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GlutaMAX</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>35050061</td>
			<td>dipeptide, L-alanyl-L-glutamine</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hematoxylin and Eosin Staining Kit</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>NC1470670</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Histoplast Paraffin Wax</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>22900700</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microcentrifuge&#160;</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mr. Frosty Freezing Container</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>07202363S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N-acetylcysteine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A9165</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nicotinamide</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>N0636</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>p1000 Pipette with Tips&#160;</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>p200 Pipette with Tips&#160;</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pasteur Pipettes 9&#34;</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>1367820D</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>MT21031CM</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipet Controller</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Prostaglandin E2</td>
			<td>R&#38;D Systems</td>
			<td>2296</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Puromycin&#160;</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>A1113802</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recombinant Murine Noggin</td>
			<td>PeproTech</td>
			<td>250-38</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recovery Cell Culture Freezing Medium</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>12648010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Red Blood Cell Lysis Buffer</td>
			<td>BioLegend</td>
			<td>420301</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ROCK Inhibitor (Y-27632)</td>
			<td>R&#38;D Systems</td>
			<td>1254/1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SB202190</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S7076</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T75 Flask</td>
			<td>MidSci</td>
			<td>TP90076</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue Culture Hood&#160;</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue Embedding Cassette</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TrypLE Express</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>12604013</td>
			<td>animal origin-free, recombinant enzyme</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Type II Collagenase</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>17101015</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vortex</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

generation and culturing of high-grade serous ovarian cancer patient-derived organoids

Органоиды представляют собой 3D-динамические модели опухолей, которые могут быть успешно выращены из ткани опухоли яичников, асцита или плевральной жидкости пациента и помогают в открытии новых терапевтических средств и прогностических биомаркеров рака яичников. Эти модели повторяют клональную гетерогенность, микроокружение опухоли и взаимодействия между клетками и клетками и матриксом. Кроме того, было показано, что они соответствуют первичной опухоли морфологически, цитологически, иммуногистохимически и генетически. Таким образом, органоиды облегчают исследования опухолевых клеток и микроокружения опухоли и превосходят клеточные линии. Настоящий протокол описывает различные способы получения органоидов рака яичников пациента из образцов опухолей, асцита и плевральной жидкости пациента с вероятностью успеха более 97%. Образцы пациентов разделяются на клеточные суспензии путем механического и ферментативного сбраживания. Затем клетки покрываются с использованием экстракта базальной мембраны (BME) и поддерживаются оптимизированными питательными средами, содержащими добавки, специфичные для культивирования серозного рака яичников высокой степени злокачественности (HGSOC). После формирования исходных органоидов PDO могут поддерживать долгосрочную культуру, включая передачу для расширения для последующих экспериментов.

Для получения PDO образцы механически и ферментативно расщепляли в одноклеточные суспензии. Затем клетки ресуспендировали в BME и дополняли специально сконструированными средами (рис. 3). Органоиды обычно устанавливаются в течение 10 дней, после чего они демонстрируют дис?...

Watch this Scientific Journal Video about Generation and Culturing of High-Grade Serous Ovarian Cancer Patient-Derived Organoids at JoVE.com

Generation and Culturing of High-Grade Serous Ovarian Cancer Patient-Derived Organoids

Органоиды, полученные от пациента (PDO), представляют собой трехмерную (3D) культуру, которая может имитировать опухолевую среду in vitro. При серозном раке яичников высокой степени злокачественности PDO представляют собой модель для изучения новых биомаркеров и терапевтических средств.

Генерация и культивирование высокодифференцированных серозных органоидов, полученных от пациентов с раком яичников

Organoids are 3D dynamic tumor models that can be grown successfully from patient-derived ovarian tumor tissue, ascites, or pleural fluid and aid in the ...

Модели органоидов пациента генетически и функционально представляют их родительские опухоли и, таким образом, являются надежными моделями для изучения новых терапевтических средств и сложных биологических процессов при раке яичников. Повторяя клональную гетерогенность, микроокружение опухоли и межклеточные взаимодействия in vitro, эти модели преодолевают ограничения линий раковых клеток и ксенотрансплантатов, полученных от пациентов. Органоиды, полученные от пациентов, обеспечивают возможности долгосрочного расширения и хранения и имитируют физиологию опухоли.В результате они являются идеальными моделями для изучения новых терапевтических средств и прогностических биомаркеров. Начните сбор органоидов, поместив образцы опухоли в 10-сантиметровую чашку для культивирования тканей и измельчив ткань для создания однородной смеси с помощью одноразового скальпеля. Поместите однородную тканевую смесь в диссоциационную трубку с помощью щипцов.На каждые один-два миллилитра гомогенизированной ткани добавляют семь-восемь миллилитров одного миллиграмма на миллилитр раствора коллагеназы второго типа в органоидной базовой среде и один миллилитр раствора ДНКазы One. Вихревый раствор при 458 г. Разжижают ткань, пока она находится в растворе коллагеназы, с помощью диссоциационной машины. Запустите программу 37 C, подчеркните H, подчеркните TDK три, один час, пока не получится одноклеточная суспензия.После этого перелейте гомогенизированную смесь в новую коническую трубку объемом 50 миллилитров. Добавьте от 20 до 40 миллилитров органоидной основной среды и встряхните раствор при 458 г. Затем отфильтруйте раствор через 100-микрометровый сетчатый фильтр в недавно помеченную коническую трубку объемом 50 миллилитров. Затем центрифугируйте отфильтрованную смесь при температуре 1 650 г в течение пяти минут при четырех градусах Цельсия и аспирируйте надосадочную жидкость с помощью стеклянной пастбищной пипетки.Приготовьте 100 микрограммов на миллилитр Dnase One и ресуспендируйте клетки в одном миллилитре раствора Dnase One, добавив раствор DNase One по каплям. После 15 минут инкубации при комнатной температуре добавьте в клетки 25 миллилитров органоидной основной среды и перемешайте. Затем центрифугируйте клетки при 1 650 G в течение пяти минут при четырех градусах Цельсия и тщательно аспирируйте надосадочную жидкость с помощью стеклянной пастбищной пипетки.Ресуспендируйте вновь образованную клеточную гранулу в пяти миллилитрах предварительно подогретого эритроцита или буфера лизиса эритроцитов. Встряхните растворы в каждой конической трубке при 458 G и инкубируйте в течение пяти минут. Опять же, центрифугируйте гранулы, взвешенные в буфере лизиса эритроцитов, и аспирируйте надосадочную жидкость с помощью стеклянной пастбищной пипетки.Промойте гранулы 10-миллилитровым PBS и перемешайте ячейки перед центрифугированием ячеек. Для гранул с большими ячейками аспирируйте PBS и добавьте один миллилитр органоидной основной среды поверх гранулы. После вихтывания раствора перенесите от 300 до 400 микролитров клеточной суспензии в микроцентрифужную пробирку.После пяти минут центрифугирования аспирируйте надосадочную жидкость и ресуспендируйте ее в экстракте базальной мембраны, или BME, и среде органоидного основания с помощью холодных наконечников. Поместите ресуспендированный клеточный раствор в шестилуночную пластину в аликвоты объемом 40 микролитров. Пластина до пяти аликвот на лунку.Сразу же поместите луночную пластину в инкубатор на 20 минут, а после инкубации аккуратно добавьте в каждую лунку по два миллилитра полной органоидной среды. Добавьте по одному миллилитру органоидной основной среды в каждую лунку и нанесите питатель пипеткой вверх и вниз непосредственно на выступы органоидов для диссоциации. Соберите всю среду, содержащую ресуспендированные гранулы, в коническую трубку объемом 15 миллилитров.Затем центрифугируйте 15-миллилитровую коническую пробирку, содержащую смесь, в течение пяти минут перед аспирацией надосадочной жидкости. Добавьте один миллилитр свободного рекомбинантного фермента животного происхождения в клеточную гранулу. Перемешайте вихревым способом и перенесите суспензию в микроцентрифужную пробирку объемом 1,5 миллилитра.После 15 минут инкубации на водяной бане с температурой 37 градусов Цельсия и пяти минут центрифугирования аспирируйте надосадочную жидкость. Ресуспендируют гранулу в BME и среде органоидного основания и помещают ресуспендированный клеточный раствор в шестилуночную пластину в аликвотах объемом 40 микролитров. Пластина до пяти аликвот на лунку.После 20 минут инкубации аккуратно добавьте в каждую лунку по два миллилитра полной органоидной среды. Ресуспендируйте гранулы органоидных клеток в 0,5-один миллилитр замораживающей среды для восстановительных клеточных культур и перенесите по одному миллилитру в каждый криофлакон перед переносом их в минус 80 градусов и резервуар с жидким азотом для длительного хранения. Разморозьте органоиды, перенеся криофлаконы, хранящиеся в жидком азоте, на водяную баню с температурой 37 градусов Цельсия.После размораживания перенесите органоиды в коническую трубку объемом 15 миллилитров и центрифугируйте их перед аспирацией надосадочной жидкости. Затем добавьте один миллилитр PBS в гранулу и перенесите ресуспендированную гранулу в микроцентрифужную пробирку объемом 1,5 миллилитра. После центрифугирования при 1 650 г в течение пяти минут при четырех градусах Цельсия осторожно аспирируйте надосадочную жидкость с помощью стеклянной пастбищной пипетки. Ресуспендируют гранулу в BME и среде органоидного основания и помещают ресуспендированные клетки на шестилуночную пластину в аликвотах объемом 40 микролитров.Поместите до пяти аликвот на лунку. Сразу же поместите тарелку в инкубатор на 20 минут, прежде чем добавлять в лунки два миллилитра полной органоидной среды. Органоиды были установлены в течение 10 дней, после чего они продемонстрировали дискретные органоиды в культуре.Органоидные культуры, полученные от пациентов, оценивали путем встраивания их в агарозу и оценки с помощью окрашивания гематоксилином и эозином. Важно учитывать трудности работы с BME. Ресуспендирование клеточной гранулы и BME должно производиться на льду, чтобы в процессе не образовывались пузырьки.Этот метод позволяет проводить дальнейшие исследования влияния химиотерапии на генерацию и развитие органоидов из-за проблем, с которыми сталкиваются пациенты, прошедшие неоадъювантную химиотерапию.

Research

JoVE Journal

Cancer Research

Establishment of Gastric Cancer Patient-derived Xenograft Models and Primary Cell Lines

Создание желудка рака пациента полученных Ксенотрансплантат Модели и первичные линии клеток

The use of preclinical models to advance our understanding of tumor biology and investigate the efficacy of therapeutic agents is key to cancer research. ...

High-Throughput In Vitro Assay using Patient-Derived Tumor Organoids

High-Throughput In Vitro Assay using Patient-Derived Tumor Organoids

Высокопроизводительный анализ in vitro с использованием органоидов опухолей, полученных от пациента

Patient-derived tumor organoids (PDOs) are expected to be a preclinical cancer model with better reproducibility of disease than traditional cell culture ...

Profiling Sensitivity to Targeted Therapies in EGFR-Mutant NSCLC Patient-Derived Organoids

Профилирование чувствительности к таргетной терапии в органоидах EGFR-мутантного НМРЛ, полученных из пациента

Novel 3D cancer organoid cultures derived from clinical patient specimens represent an important model system to evaluate intratumor heterogeneity and ...

Orthotopic Implantation of Patient-Derived Cancer Cells in Mice Recapitulates Advanced Colorectal Cancer

Ортотопическая имплантация раковых клеток, полученных от пациентов, у мышей повторяет прогрессирующий колоректальный рак

Over the last decade, more sophisticated preclinical colorectal cancer (CRC) models have been established using patient-derived cancer cells and 3D ...

Establishment and Culture of Patient-Derived Breast Organoids

Создание и культивирование органоидов молочной железы пациента

Breast cancer is a complex disease that has been classified into several different histological and molecular subtypes. Patient-derived breast tumor ...

Visualizing DNA Damage Repair Proteins in Patient-Derived Ovarian Cancer Organoids via Immunofluorescence Assays

Visualizing DNA Damage Repair Proteins in Patient-Derived Ovarian Cancer Organoids via Immunofluorescence Assays

Визуализация белков репарации повреждений ДНК в органоидах рака яичников пациента с помощью иммунофлюоресцентных анализов

Immunofluorescence is one of the most widely used techniques to visualize target antigens with high sensitivity and specificity, allowing for the accurate ...

Ovarian Cancer Patient-Derived Organoid Models for Pre-Clinical Drug Testing

Ovarian cancer is a fatal gynecologic cancer and the fifth leading cause of cancer death among women in the United States. Developing new drug treatments ...

Automated Kinetic Imaging for Drug Assessment in Patient-Derived Tumor Organoids

Multiplexed Live-Cell Imaging for Drug Responses in Patient-Derived Organoid Models of Cancer

Author Spotlight: Developing Multiplexed Kinetic Assays for Organoid-Based Drug Response Analysis

Patient-derived organoid (PDO) models of cancer are a multifunctional research system that better recapitulates human disease as compared to cancer cell ...

Derivation of 3D Glioma Organoids from Chopper-Processed Patient Tumors

Cultivating Ex Vivo Patient-Derived Glioma Organoids Using a Tissue Chopper

Author Spotlight: Enhanced Generation of Patient-Derived 3D Organoids for Glioblastoma and Glioma

Glioblastoma, IDH-wild type, CNS WHO grade 4 (GBM) is a primary brain tumor associated with poor patient survival despite aggressive treatment. Developing ...

Standardizing Ovarian Cancer Organoid Biobanking

Strategy for Biobanking of Ovarian Cancer Organoids: Addressing the Interpatient Heterogeneity across Histological Subtypes and Disease Stages

Author Spotlight: Advancing Personalized Medicine in Ovarian Cancer 

Стратегия биобанкирования органоидов рака яичников: решение проблемы межпациентской гетерогенности по гистологическим подтипам и стадиям заболевания

While the establishment of an ovarian cancer biobank from patient-derived organoids along with their clinical background information promises advances in ...