Name: generation and culturing of high-grade serous ovarian cancer patient-derived organoids
Uploaded: 2023-01-06T14:50:00
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Estamos agradecidos por la orientación de Ron Bose, MD, PhD, y la ayuda de Barbara Blachut, MD, en el establecimiento de este protocolo. También nos gustaría reconocer a la Escuela de Medicina de la Universidad de Washington en el Departamento de Obstetricia y Ginecología de St. Louis y la División de Oncología Ginecológica, al Programa de Becarios del Decano de la Universidad de Washington y al Programa de Desarrollo de Científicos Reproductivos por su apoyo a este proyecto.

Todas las muestras de tejido humano recolectadas para la investigación se obtuvieron de acuerdo con el protocolo aprobado por la Junta de Revisión Institucional (IRB). Los protocolos descritos a continuación se realizaron en un entorno estéril de cultivo de tejidos humanos. Se obtuvo el consentimiento informado por escrito de sujetos humanos. Las pacientes elegibles tenían que tener un diagnóstico o presunto diagnóstico de cáncer de ovario, estar dispuestas y ser capaces de firmar el consentimiento informado y te...

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	<li>Bray, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Global+cancer+statistics+2018:+GLOBOCAN+estimates+of+incidence+and+mortality+worldwide+for+36+cancers+in+185+countries.">Global cancer statistics 2018: GLOBOCAN estimates of incidence and mortality worldwide for 36 cancers in 185 countries.</a> CA: A Cancer Journal for Clinicians. 68 (6), 394-424 (2018).</li><li>Drost, J., Clevers, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Organoids+in+cancer+research.">Organoids in cancer research.</a> Nature Reviews Cancer. 18 (7), 407-418 (2018).</li><li>Pauli, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Personalized+in+vitro+and+in+vivo+cancer+models+to+guide+precision+medicine.">Personalized in vitro and in vivo cancer models to guide precision medicine.</a> Cancer Discovery. 7 (5), 462-477 (2017).</li><li>Fujii, E., Kato, A., Suzuki, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Patient-derived+xenograft+(PDX)+models:+Characteristics+and+points+to+consider+for+the+process+of+establishment.">Patient-derived xenograft (PDX) models: Characteristics and points to consider for the process of establishment.</a> Journal of Toxicologic Pathology. 33 (3), 153-160 (2020).</li><li>Yang, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Application+of+ovarian+cancer+organoids+in+precision+medicine:+Key+challenges+and+current+opportunities.">Application of ovarian cancer organoids in precision medicine: Key challenges and current opportunities.</a> Frontiers in Cell and Developmental Biology. 9, 701429 (2021).</li><li>Yang, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Patient-derived+organoids:+A+promising+model+for+personalized+cancer+treatment.">Patient-derived organoids: A promising model for personalized cancer treatment.</a> Gastroenterology Report. 6 (4), 243-245 (2018).</li><li>Karakasheva, T. 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J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Prediction+of+DNA+repair+inhibitor+response+in+short-term+patient-derived+ovarian+cancer+organoids.">Prediction of DNA repair inhibitor response in short-term patient-derived ovarian cancer organoids.</a> Cancer Discovery. 8 (11), 1404-1421 (2018).</li><li>Passarelli, M. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Leucyl-tRNA+synthetase+is+a+tumour+suppressor+in+breast+cancer+and+regulates+codon-dependent+translation+dynamics.">Leucyl-tRNA synthetase is a tumour suppressor in breast cancer and regulates codon-dependent translation dynamics.</a> Nature Cell Biology. 24 (3), 307-315 (2022).</li><li>Pleguezuelos-Manzano, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Establishment+and+culture+of+human+intestinal+organoids+derived+from+adult+stem+cells.">Establishment and culture of human intestinal organoids derived from adult stem cells.</a> Current Protocols in Immunology. 130 (1), 106 (2020).</li><li>Stumm, M. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Validation+of+a+postfixation+tissue+storage+and+transport+medium+to+preserve+histopathology+and+molecular+pathology+analyses+(total+and+phosphoactivated+proteins,+and+FISH).">Validation of a postfixation tissue storage and transport medium to preserve histopathology and molecular pathology analyses (total and phosphoactivated proteins, and FISH).</a> American Journal of Clinical Pathology. 137 (3), 429-436 (2012).</li><li>Feldman, A. T., Wolfe, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tissue+processing+and+hematoxylin+and+eosin+staining.">Tissue processing and hematoxylin and eosin staining.</a> Methods in Molecular Biology. 1180, 31-43 (2014).</li><li>Ooft, S. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Patient-derived+organoids+can+predict+response+to+chemotherapy+in+metastatic+colorectal+cancer+patients.">Patient-derived organoids can predict response to chemotherapy in metastatic colorectal cancer patients.</a> Science Translational Medicine. 11 (513), (2019).</li><li>Aisenbrey, E. A., Murphy, W. 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El cáncer de ovario es extremadamente mortal debido a su etapa avanzada en el momento del diagnóstico, así como al desarrollo común de resistencia a la quimioterapia. Se han logrado muchos avances en la investigación del cáncer de ovario mediante la utilización de líneas celulares cancerosas y modelos PDX; Sin embargo, existe una necesidad evidente de un modelo in vitro más representativo y asequible. Las PDO han demostrado representar con precisión la heterogeneidad tumoral, el microambiente tumoral y...

En 2021, aproximadamente 21,410 mujeres en los Estados Unidos fueron diagnosticadas recientemente con cáncer epitelial de ovario, y 12,940 mujeres murieron de esta enfermedad1. Aunque se han logrado avances suficientes en cirugía y quimioterapia, más de 70% de los pacientes con enfermedad avanzada desarrollan resistencia quimioterapéutica y mueren dentro de los 5 años posteriores al diagnóstico 2,3. Por lo tanto, se necesitan urgentemente nuevas estrategias para tratar esta enfermedad mortal y modelos representativos y confiables para la investigación preclínica.
Las líneas celulares cancerosas y los xenoinjertos derivados de pacientes (PDX) creados a partir de tumores ováricos primarios son los principales instrumentos utilizados en la investigación del cáncer de ovario. Una ventaja importante de las líneas celulares de cáncer es su rápida expansión. Sin embargo, su cultivo continuo da como resultado alteraciones fenotípicas y genotípicas que hacen que las líneas celulares cancerosas se desvíen de la muestra original del tumor primario de cáncer. Debido a las diferencias existentes entre la línea celular del cáncer y el tumor primario, los ensayos farmacológicos que tienen efectos positivos en las líneas celulares no tienen los mismos efectos en los ensayos clínicos2. Para superar estas limitaciones, se utilizan modelos PDX. Estos modelos se crean mediante la implantación de tejido fresco de cáncer de ovario en ratones inmunodeficientes. Como son modelos in vivo , se parecen con mayor precisión a las características biológicas humanas y, a su vez, son más predictivos de los resultados de los medicamentos. Sin embargo, estos modelos también tienen limitaciones significativas, incluyendo el costo, el tiempo y los recursos necesarios para generarlos4.
Las PDO ofrecen un modelo alternativo para la investigación preclínica que supera las limitaciones tanto de las líneas celulares cancerosas como de los modelos PDX. Las PDO recapitulan el tumor y el microambiente tumoral de un paciente y, así, proporcionan un modelo intratable in vitro ideal para la investigación preclínica 2,3,5. Estos modelos 3D tienen capacidades de autoorganización que modelan el tumor primario, que es una característica que sus contrapartes de línea celular bidimensional (2D) no poseen. Además, se ha demostrado que estos modelos representan genética y funcionalmente sus tumores progenitores y, por lo tanto, son modelos confiables para estudiar nuevos procesos terapéuticos y biológicos. En resumen, ofrecen capacidades de expansión y almacenamiento a largo plazo similares a las líneas celulares, pero también abarcan el microambiente y las interacciones célula-célula inherentes a los modelos de ratón 4,6.
El presente protocolo describe la creación de PDOs a partir de tumores derivados de pacientes, ascitis y muestras de líquido pleural con una tasa de éxito superior al 97%. Los cultivos PDO pueden expandirse durante múltiples generaciones y usarse para probar la sensibilidad a la terapia farmacológica y los biomarcadores predictivos. Este método representa una técnica que podría utilizarse para personalizar los tratamientos en función de las respuestas terapéuticas de las DOP.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>1% HEPES</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>15630080</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1% Penicillin-Streptomycin</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>30002CI</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1.5 mL Eppendorf Tubes&#160;</td>
			<td>Genesee Scientific</td>
			<td>14125</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10 cm Tissue Culture Dish&#160;</td>
			<td>TPP</td>
			<td>93100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10 mL Serological Pipet</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>100 &#181;m Cell Filter</td>
			<td>MidSci</td>
			<td>100ICS</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>15 mL centrifuge tubes</td>
			<td>Corning</td>
			<td>430052</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2 mL Cryovial</td>
			<td>Simport Scientific</td>
			<td>T301-2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2% Paraformaldehyde Fixative</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>37 &#176;C water bath&#160;</td>
			<td>NEST</td>
			<td>602052</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3dGRO R-Spondin-1 Conditioned Media Supplement</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>SCM104</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>6 well plates</td>
			<td>TPP</td>
			<td>92006</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>70% Ethanol</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>R31541GA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>A83-01</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>SML0788</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Advanced DMEM/F12</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>12634028</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agar</td>
			<td>Lamda Biotech</td>
			<td>C121</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>B-27</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>17504044</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge&#160;</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cultrex Type 2</td>
			<td>R&#38;D Systems</td>
			<td>3533-010-02</td>
			<td>basement membrane extract</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNase I</td>
			<td>New England Bio Labs</td>
			<td>M0303S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNase I Reaction Buffer</td>
			<td>New England Bio Labs</td>
			<td>M0303S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EGF</td>
			<td>PeproTech</td>
			<td>AF-100-15</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FBS&#160;</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>F2442</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FGF-10</td>
			<td>PeproTech</td>
			<td>100-26</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FGF2</td>
			<td>PeproTech</td>
			<td>100-18B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>gentleMACS C Tubes</td>
			<td>Miltenyi BioTech</td>
			<td>130-096-334</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>gentleMACS Octo Dissociator with Heaters</td>
			<td>Miltenyi BioTech</td>
			<td>130-096-427</td>
			<td>We use the manufacturers protocol.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GlutaMAX</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>35050061</td>
			<td>dipeptide, L-alanyl-L-glutamine</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hematoxylin and Eosin Staining Kit</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>NC1470670</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Histoplast Paraffin Wax</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>22900700</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microcentrifuge&#160;</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mr. Frosty Freezing Container</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>07202363S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N-acetylcysteine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A9165</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nicotinamide</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>N0636</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>p1000 Pipette with Tips&#160;</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>p200 Pipette with Tips&#160;</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pasteur Pipettes 9&#34;</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>1367820D</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>MT21031CM</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipet Controller</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Prostaglandin E2</td>
			<td>R&#38;D Systems</td>
			<td>2296</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Puromycin&#160;</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>A1113802</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recombinant Murine Noggin</td>
			<td>PeproTech</td>
			<td>250-38</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recovery Cell Culture Freezing Medium</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>12648010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Red Blood Cell Lysis Buffer</td>
			<td>BioLegend</td>
			<td>420301</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ROCK Inhibitor (Y-27632)</td>
			<td>R&#38;D Systems</td>
			<td>1254/1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SB202190</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S7076</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T75 Flask</td>
			<td>MidSci</td>
			<td>TP90076</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue Culture Hood&#160;</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue Embedding Cassette</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TrypLE Express</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>12604013</td>
			<td>animal origin-free, recombinant enzyme</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Type II Collagenase</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>17101015</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vortex</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

generation and culturing of high-grade serous ovarian cancer patient-derived organoids

Los organoides son modelos tumorales dinámicos 3D que se pueden cultivar con éxito a partir de tejido tumoral ovárico derivado del paciente, ascitis o líquido pleural y ayudan en el descubrimiento de nuevas terapias y biomarcadores predictivos para el cáncer de ovario. Estos modelos recapitulan la heterogeneidad clonal, el microambiente tumoral y las interacciones célula-célula y célula-matriz. Además, se ha demostrado que coinciden con el tumor primario morfológicamente, citológicamente, inmunohistoquímicamente y genéticamente. Por lo tanto, los organoides facilitan la investigación sobre las células tumorales y el microambiente tumoral y son superiores a las líneas celulares. El presente protocolo describe distintos métodos para generar organoides de cáncer de ovario derivados de pacientes a partir de tumores de pacientes, ascitis y muestras de líquido pleural con una tasa de éxito superior al 97%. Las muestras de pacientes se separan en suspensiones celulares mediante digestión mecánica y enzimática. Luego, las células se colocan utilizando un extracto de membrana basal (BME) y se apoyan con medios de crecimiento optimizados que contienen suplementos específicos para el cultivo de cáncer de ovario seroso de alto grado (HGSOC). Después de formar organoides iniciales, los PDO pueden sostener el cultivo a largo plazo, incluido el paso por expansión para experimentos posteriores.

Para generar DOP, las muestras se digirieron mecánica y enzimáticamente en suspensiones unicelulares. Las células se resuspendieron en BME y se complementaron con medios específicamente diseñados (Figura 3). Los organoides se establecen típicamente en un marco de tiempo de 10 días, después de lo cual demuestran organoides discretos en cultivo (Figura 4).
<img alt="Figure 3" class="xfi...

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Generation and Culturing of High-Grade Serous Ovarian Cancer Patient-Derived Organoids

Los organoides derivados del paciente (PDO) son un cultivo tridimensional (3D) que puede imitar el entorno tumoral in vitro. En el cáncer de ovario seroso de alto grado, las PDO representan un modelo para estudiar nuevos biomarcadores y terapias.

Generación y cultivo de organoides derivados de pacientes con cáncer de ovario seroso de alto grado

Organoids are 3D dynamic tumor models that can be grown successfully from patient-derived ovarian tumor tissue, ascites, or pleural fluid and aid in the ...

Los modelos de organoides impulsados por pacientes representan genética y funcionalmente sus tumores progenitores y, por lo tanto, son modelos confiables para estudiar nuevas terapias y procesos biológicos complejos en el cáncer de ovario. Al recapitular la heterogeneidad clonal, el microambiente tumoral y las interacciones in vitro de célula a célula, estos modelos superan las limitaciones de las líneas celulares cancerosas y los xenoinjertos derivados del paciente. Los organoides derivados del paciente ofrecen capacidades de expansión y almacenamiento a largo plazo e imitan la fisiología tumoral.Como resultado, son modelos ideales para el estudio de nuevas terapias y biomarcadores predictivos. Comience la recolección de los organoides colocando las muestras de tumor en un plato de cultivo de tejido de 10 centímetros y picando el tejido para crear una mezcla homogénea usando un bisturí desechable. Coloque la mezcla de tejido homogéneo en un tubo de disociación con fórceps.Por cada uno o dos mililitros de tejido homogeneizado, agregue de siete a ocho mililitros de un miligramo por mililitro de solución de colagenasa tipo dos en medio base organoide y un mililitro de solución de DNasa Uno. Vórtice la solución a 458 G.Licuar el tejido mientras está en la solución de colagenasa utilizando la máquina de disociación. Ejecute el programa 37 C subrayar H subrayar TDK tres una hora hasta que sea una suspensión de una sola celda.Una vez hecho esto, transfiera la mezcla homogeneizada a un nuevo tubo cónico de 50 mililitros. Agregue de 20 a 40 mililitros de medio base organoide y vórtice la solución a 458 G.Luego filtre la solución a través de un filtro celular de 100 micrómetros en un tubo cónico de 50 mililitros recién etiquetado. A continuación, centrifugar la mezcla filtrada a 1, 650 G durante cinco minutos a cuatro grados centígrados y aspirar el sobrenadante con una pipeta de vidrio para pastos.Prepare 100 microgramos por mililitro de Dnase One y resuspenda las células en un mililitro de solución de Dnase One agregando una solución de DNase One en gota. Después de 15 minutos de incubación a temperatura ambiente, agregue 25 mililitros de medio base organoide a las células e invierta para mezclar. Luego centrifugar las celdas a 1, 650 G durante cinco minutos a cuatro grados Celsius y aspirar cuidadosamente el sobrenadante con una pipeta de vidrio para pastos.Resuspenda el pellet de células recién formado en cinco mililitros de tampón de lisis de glóbulos rojos o RBC precalentados. Vortex las soluciones en cada tubo cónico a 458 G e incubar durante cinco minutos. Nuevamente, centrifugar el pellet suspendido en tampón de lisis RBC y aspirar el sobrenadante usando una pipeta de vidrio para pastos.Lave el pellet con PBS de 10 mililitros y vortex las células antes de la centrifugación de las células. Para un pellet de celda grande, aspire el PBS y agregue un mililitro del medio base organoide encima del pellet. Después de vortexar la solución, transfiera de 300 a 400 microlitros de la suspensión celular a un tubo de microcentrífuga.Después de cinco minutos de centrifugación, aspirar el sobrenadante y resuspenderlo en extracto de membrana basal, o BME, y medio base organoide utilizando puntas frías. Colocar la solución celular resuspendida en una placa de seis pocillos en alícuotas de 40 microlitros. Planchar hasta cinco alícuotas por pozo.Coloque inmediatamente la placa del pozo en la incubadora durante 20 minutos y, después de la incubación, agregue suavemente dos mililitros del medio organoide completo en cada pocillo. Agregue un mililitro de medio base organoide a cada pocillo y pipete el medio hacia arriba y hacia abajo directamente sobre las pestañas del organoide para la disociación. Recoger todo el medio que contiene los pellets resuspendidos en un tubo cónico de 15 mililitros.Luego, centrifugar el tubo cónico de 15 mililitros que contiene la mezcla durante cinco minutos antes de aspirar el sobrenadante. Agregue un mililitro de enzima recombinante libre de origen animal al pellet celular. Mezclar por vórtice y transferir la suspensión a un tubo de microcentrífuga de 1,5 mililitros.Después de 15 minutos de incubación en un baño de agua de 37 grados centígrados y cinco minutos de centrifugación, aspirar el sobrenadante. Resuspender el pellet en BME y medio base organoide y colocar la solución celular resuspendida en una placa de seis pocillos en alícuotas de 40 microlitros. Planchar hasta cinco alícuotas por pozo.Después de 20 minutos de incubación, agregue suavemente dos mililitros del medio organoide completo en cada pocillo. Resuspenda el gránulo de células organoides de paso en 0.5 a un mililitro de medio de congelación de cultivo celular de recuperación y transfiera un mililitro a cada vial criogénico antes de transferirlos a menos 80 grados y al tanque de nitrógeno líquido para su almacenamiento a largo plazo. Descongele los organoides transfiriendo los viales criogénicos almacenados en nitrógeno líquido al baño de agua a 37 grados centígrados.Una vez descongelados, transfiera los organoides a un tubo cónico de 15 mililitros y centrifugarlos antes de aspirar el sobrenadante. A continuación, agregue un mililitro de PBS al pellet y transfiera el pellet resuspendido a un tubo de microcentrífuga de 1,5 mililitros Después de la centrifugación a 1, 650 G durante cinco minutos a cuatro grados centígrados, aspire cuidadosamente el sobrenadante con una pipeta de vidrio para pastos. Resuspender el pellet en BME y medio base organoide y placar las células resuspendidas en una placa de seis pocillos en alícuotas de 40 microlitros.Colocar hasta cinco alícuotas por pozo. Coloque inmediatamente la placa en la incubadora durante 20 minutos antes de agregar dos mililitros de medio organoide completo a los pocillos. Los organoides se establecieron durante 10 días después de lo cual demostraron organoides discretos en cultivo.Los cultivos de organoides derivados de pacientes se evaluaron incrustándolos en agarosa y evaluándolos con tinción de hematoxilina y eosina. Es importante tener en cuenta los retos de trabajar con BME. La resuspensión del pellet celular y BME debe hacerse en hielo asegurando que no se formen burbujas en el proceso.Esta técnica permite realizar más investigaciones sobre el impacto de la quimioterapia en la generación y el desarrollo de organoides debido a los problemas encontrados por los pacientes que se han sometido a quimioterapia neoadyuvante.

Research

JoVE Journal

Cancer Research

Establishment of Gastric Cancer Patient-derived Xenograft Models and Primary Cell Lines

Establecimiento de modelos de xenoinjerto saqueos derivados del paciente y líneas celulares primarias

The use of preclinical models to advance our understanding of tumor biology and investigate the efficacy of therapeutic agents is key to cancer research. ...

Investigación

Investigación sobre el cáncer

High-Throughput In Vitro Assay using Patient-Derived Tumor Organoids

High-Throughput In Vitro Assay using Patient-Derived Tumor Organoids

Ensayo in vitro de alto rendimiento utilizando organoides tumorales derivados del paciente

Patient-derived tumor organoids (PDOs) are expected to be a preclinical cancer model with better reproducibility of disease than traditional cell culture ...

Profiling Sensitivity to Targeted Therapies in EGFR-Mutant NSCLC Patient-Derived Organoids

Perfil de la sensibilidad a las terapias dirigidas en organoides derivados de pacientes con NSCLC con mutación de EGFR

Novel 3D cancer organoid cultures derived from clinical patient specimens represent an important model system to evaluate intratumor heterogeneity and ...

Orthotopic Implantation of Patient-Derived Cancer Cells in Mice Recapitulates Advanced Colorectal Cancer

La implantación ortotópica de células cancerosas derivadas de pacientes en ratones recapitula el cáncer colorrectal avanzado

Over the last decade, more sophisticated preclinical colorectal cancer (CRC) models have been established using patient-derived cancer cells and 3D ...

Establishment and Culture of Patient-Derived Breast Organoids

Establecimiento y cultivo de organoides mamarios derivados de pacientes

Breast cancer is a complex disease that has been classified into several different histological and molecular subtypes. Patient-derived breast tumor ...

Visualizing DNA Damage Repair Proteins in Patient-Derived Ovarian Cancer Organoids via Immunofluorescence Assays

Visualizing DNA Damage Repair Proteins in Patient-Derived Ovarian Cancer Organoids via Immunofluorescence Assays

Visualización de proteínas de reparación del daño del ADN en organoides de cáncer de ovario derivados de pacientes a través de ensayos de inmunofluorescencia

Immunofluorescence is one of the most widely used techniques to visualize target antigens with high sensitivity and specificity, allowing for the accurate ...

Ovarian Cancer Patient-Derived Organoid Models for Pre-Clinical Drug Testing

Ovarian cancer is a fatal gynecologic cancer and the fifth leading cause of cancer death among women in the United States. Developing new drug treatments ...

Automated Kinetic Imaging for Drug Assessment in Patient-Derived Tumor Organoids

Multiplexed Live-Cell Imaging for Drug Responses in Patient-Derived Organoid Models of Cancer

Author Spotlight: Developing Multiplexed Kinetic Assays for Organoid-Based Drug Response Analysis

Patient-derived organoid (PDO) models of cancer are a multifunctional research system that better recapitulates human disease as compared to cancer cell ...

Derivation of 3D Glioma Organoids from Chopper-Processed Patient Tumors

Cultivating Ex Vivo Patient-Derived Glioma Organoids Using a Tissue Chopper

Author Spotlight: Enhanced Generation of Patient-Derived 3D Organoids for Glioblastoma and Glioma

Glioblastoma, IDH-wild type, CNS WHO grade 4 (GBM) is a primary brain tumor associated with poor patient survival despite aggressive treatment. Developing ...

Standardizing Ovarian Cancer Organoid Biobanking

Strategy for Biobanking of Ovarian Cancer Organoids: Addressing the Interpatient Heterogeneity across Histological Subtypes and Disease Stages

Author Spotlight: Advancing Personalized Medicine in Ovarian Cancer 

Estrategia para el biobanco de organoides de cáncer de ovario: abordaje de la heterogeneidad entre pacientes en los subtipos histológicos y los estadios de la enfermedad

While the establishment of an ovarian cancer biobank from patient-derived organoids along with their clinical background information promises advances in ...