Name: generation and culturing of high-grade serous ovarian cancer patient-derived organoids
Uploaded: 2023-01-06T14:50:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Generation and Culturing of High-Grade Serous Ovarian Cancer Patient-Derived Organoids at JoVE.com

Vi är tacksamma för vägledningen från Ron Bose, MD, PhD, och hjälpen från Barbara Blachut, MD, vid upprättandet av detta protokoll. Vi vill också erkänna Washington University's School of Medicine i St. Louis's Department of Obstetrics and Gynecology och Division of Gynecologic Oncology, Washington University's Dean's Scholar Program och Reproductive Scientist Development Program för deras stöd till detta projekt.

Alla mänskliga vävnadsprover som samlats in för forskning erhölls enligt det protokoll som godkänts av Institutional Review Board (IRB). Protokollen som beskrivs nedan utfördes i en steril human vävnadsodlingsmiljö. Informerat skriftligt samtycke erhölls från människor. Berättigade patienter måste ha en diagnos eller förmodad diagnos av äggstockscancer, vara villiga och kunna underteckna informerat samtycke och vara minst 18 år. Tumörvävnad (malign primärtumör eller metastatiska platser), ascites och ...

<ol>
	<li>Bray, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Global+cancer+statistics+2018:+GLOBOCAN+estimates+of+incidence+and+mortality+worldwide+for+36+cancers+in+185+countries.">Global cancer statistics 2018: GLOBOCAN estimates of incidence and mortality worldwide for 36 cancers in 185 countries.</a> CA: A Cancer Journal for Clinicians. 68 (6), 394-424 (2018).</li><li>Drost, J., Clevers, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Organoids+in+cancer+research.">Organoids in cancer research.</a> Nature Reviews Cancer. 18 (7), 407-418 (2018).</li><li>Pauli, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Personalized+in+vitro+and+in+vivo+cancer+models+to+guide+precision+medicine.">Personalized in vitro and in vivo cancer models to guide precision medicine.</a> Cancer Discovery. 7 (5), 462-477 (2017).</li><li>Fujii, E., Kato, A., Suzuki, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Patient-derived+xenograft+(PDX)+models:+Characteristics+and+points+to+consider+for+the+process+of+establishment.">Patient-derived xenograft (PDX) models: Characteristics and points to consider for the process of establishment.</a> Journal of Toxicologic Pathology. 33 (3), 153-160 (2020).</li><li>Yang, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Application+of+ovarian+cancer+organoids+in+precision+medicine:+Key+challenges+and+current+opportunities.">Application of ovarian cancer organoids in precision medicine: Key challenges and current opportunities.</a> Frontiers in Cell and Developmental Biology. 9, 701429 (2021).</li><li>Yang, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Patient-derived+organoids:+A+promising+model+for+personalized+cancer+treatment.">Patient-derived organoids: A promising model for personalized cancer treatment.</a> Gastroenterology Report. 6 (4), 243-245 (2018).</li><li>Karakasheva, T. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+and+characterization+of+patient-derived+head+and+neck,+oral,+and+esophageal+cancer+organoids.">Generation and characterization of patient-derived head and neck, oral, and esophageal cancer organoids.</a> Current Protocols in Stem Cell Biology. 53 (1), 109 (2020).</li><li>Madison, B. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Let-7+represses+carcinogenesis+and+a+stem+cell+phenotype+in+the+intestine+via+regulation+of+Hmga2.">Let-7 represses carcinogenesis and a stem cell phenotype in the intestine via regulation of Hmga2.</a> PLoS Genetics. 11 (8), 1005408 (2015).</li><li>Sato, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single+Lgr5+stem+cells+build+crypt-villus+structures+in+vitro+without+a+mesenchymal+niche.">Single Lgr5 stem cells build crypt-villus structures in vitro without a mesenchymal niche.</a> Nature. 459 (7244), 262-265 (2009).</li><li>Murray, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=HER2+and+APC+mutations+promote+altered+crypt-villus+morphology+and+marked+hyperplasia+in+the+intestinal+epithelium.">HER2 and APC mutations promote altered crypt-villus morphology and marked hyperplasia in the intestinal epithelium.</a> Cellular and Molecular Gastroenterology and Hepatology. 12 (3), 1105-1120 (2021).</li><li>Hill, S. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Prediction+of+DNA+repair+inhibitor+response+in+short-term+patient-derived+ovarian+cancer+organoids.">Prediction of DNA repair inhibitor response in short-term patient-derived ovarian cancer organoids.</a> Cancer Discovery. 8 (11), 1404-1421 (2018).</li><li>Passarelli, M. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Leucyl-tRNA+synthetase+is+a+tumour+suppressor+in+breast+cancer+and+regulates+codon-dependent+translation+dynamics.">Leucyl-tRNA synthetase is a tumour suppressor in breast cancer and regulates codon-dependent translation dynamics.</a> Nature Cell Biology. 24 (3), 307-315 (2022).</li><li>Pleguezuelos-Manzano, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Establishment+and+culture+of+human+intestinal+organoids+derived+from+adult+stem+cells.">Establishment and culture of human intestinal organoids derived from adult stem cells.</a> Current Protocols in Immunology. 130 (1), 106 (2020).</li><li>Stumm, M. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Validation+of+a+postfixation+tissue+storage+and+transport+medium+to+preserve+histopathology+and+molecular+pathology+analyses+(total+and+phosphoactivated+proteins,+and+FISH).">Validation of a postfixation tissue storage and transport medium to preserve histopathology and molecular pathology analyses (total and phosphoactivated proteins, and FISH).</a> American Journal of Clinical Pathology. 137 (3), 429-436 (2012).</li><li>Feldman, A. T., Wolfe, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tissue+processing+and+hematoxylin+and+eosin+staining.">Tissue processing and hematoxylin and eosin staining.</a> Methods in Molecular Biology. 1180, 31-43 (2014).</li><li>Ooft, S. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Patient-derived+organoids+can+predict+response+to+chemotherapy+in+metastatic+colorectal+cancer+patients.">Patient-derived organoids can predict response to chemotherapy in metastatic colorectal cancer patients.</a> Science Translational Medicine. 11 (513), (2019).</li><li>Aisenbrey, E. A., Murphy, W. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synthetic+alternatives+to+Matrigel.">Synthetic alternatives to Matrigel.</a> Nature Reviews Materials. 5 (7), 539-551 (2020).</li><li>Nanki, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Patient-derived+ovarian+cancer+organoids+capture+the+genomic+profiles+of+primary+tumours+applicable+for+drug+sensitivity+and+resistance+testing.">Patient-derived ovarian cancer organoids capture the genomic profiles of primary tumours applicable for drug sensitivity and resistance testing.</a> Scientific Reports. 10, 12581 (2020).</li><li>Mead, B. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Screening+for+modulators+of+the+cellular+composition+of+gut+epithelia+via+organoid+models+of+intestinal+stem+cell+differentiation.">Screening for modulators of the cellular composition of gut epithelia via organoid models of intestinal stem cell differentiation.</a> Nature Biomedical Engineering. 6 (4), 476-494 (2022).</li></ol>

Äggstockscancer är extremt dödlig på grund av dess avancerade stadium vid diagnos, liksom den vanliga utvecklingen av kemoterapiresistens. Många framsteg inom äggstockscancerforskning har gjorts genom att använda cancercellinjer och PDX-modeller; Det finns dock ett uppenbart behov av en mer representativ och överkomlig in vitro-modell . SUBs har visat sig exakt representera tumörheterogeniteten, tumörmikromiljön och de genomiska och transkriptomiska egenskaperna hos deras primära tumörer och är dä...

År 2021 diagnostiserades cirka 21 410 kvinnor i USA nyligen med epitelial äggstockscancer och 12 940 kvinnor dog av denna sjukdom1. Även om tillräckliga framsteg har gjorts inom kirurgi och kemoterapi, utvecklar över 70% av patienterna med avancerad sjukdom kemoterapeutisk resistens och dör inom 5 år efter diagnos 2,3. Därför behövs nya strategier för att behandla denna dödliga sjukdom och representativa, tillförlitliga modeller för preklinisk forskning.
Cancercellinjer och patient-derived xenografts (PDX) skapade från primära äggstockstumörer är de viktigaste instrumenten som används i äggstockscancerforskning. En stor fördel med cancercellinjer är deras snabba expansion. Men deras kontinuerliga kultur resulterar i fenotypiska och genotypiska förändringar som får cancercellinjerna att avvika från det ursprungliga primära cancertumörprovet. På grund av de befintliga skillnaderna mellan cancercellinjen och den primära tumören misslyckas läkemedelsanalyser som har positiva effekter i cellinjer att ha samma effekter i kliniska prövningar2. För att övervinna dessa begränsningar används PDX-modeller. Dessa modeller skapas genom att implantera färsk äggstockscancervävnad i immunbristfälliga möss. Eftersom de är in vivo-modeller liknar de mer exakt mänskliga biologiska egenskaper och är i sin tur mer prediktiva för läkemedelsutfall. Dessa modeller har dock också betydande begränsningar, inklusive kostnad, tid och resurser som krävs för att generera dem4.
SUBs erbjuder en alternativ modell för preklinisk forskning som övervinner begränsningarna hos både cancercellinjer och PDX-modeller. SUBs rekapitulerar en patients tumör och tumörmikromiljö och ger därmed en in vitro-dragbar modell idealisk för preklinisk forskning 2,3,5. Dessa 3D-modeller har självorganiseringsförmåga som modellerar den primära tumören, vilket är en egenskap som deras tvådimensionella (2D) cellinjemotsvarigheter inte har. Vidare har dessa modeller visat sig genetiskt och funktionellt representera sina modertumörer och är därmed tillförlitliga modeller för att studera nya terapier och biologiska processer. Kort sagt, de erbjuder långsiktig expansion och lagringskapacitet som liknar cellinjer men omfattar också mikromiljön och cell-cellinteraktioner som är inneboende i musmodeller 4,6.
Det nuvarande protokollet beskriver skapandet av SUB från patient-härledda tumörer, ascites och pleuravätskeprover med en högre än 97% framgångsgrad. SUB-kulturerna kan sedan utvidgas i flera generationer och användas för att testa läkemedelsterapikänslighet och prediktiva biomarkörer. Denna metod representerar en teknik som kan användas för att anpassa behandlingar baserat på de terapeutiska svaren hos SUB.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>1% HEPES</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>15630080</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1% Penicillin-Streptomycin</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>30002CI</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1.5 mL Eppendorf Tubes&#160;</td>
			<td>Genesee Scientific</td>
			<td>14125</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10 cm Tissue Culture Dish&#160;</td>
			<td>TPP</td>
			<td>93100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10 mL Serological Pipet</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>100 &#181;m Cell Filter</td>
			<td>MidSci</td>
			<td>100ICS</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>15 mL centrifuge tubes</td>
			<td>Corning</td>
			<td>430052</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2 mL Cryovial</td>
			<td>Simport Scientific</td>
			<td>T301-2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2% Paraformaldehyde Fixative</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>37 &#176;C water bath&#160;</td>
			<td>NEST</td>
			<td>602052</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3dGRO R-Spondin-1 Conditioned Media Supplement</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>SCM104</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>6 well plates</td>
			<td>TPP</td>
			<td>92006</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>70% Ethanol</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>R31541GA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>A83-01</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>SML0788</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Advanced DMEM/F12</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>12634028</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agar</td>
			<td>Lamda Biotech</td>
			<td>C121</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>B-27</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>17504044</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge&#160;</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cultrex Type 2</td>
			<td>R&#38;D Systems</td>
			<td>3533-010-02</td>
			<td>basement membrane extract</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNase I</td>
			<td>New England Bio Labs</td>
			<td>M0303S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNase I Reaction Buffer</td>
			<td>New England Bio Labs</td>
			<td>M0303S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EGF</td>
			<td>PeproTech</td>
			<td>AF-100-15</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FBS&#160;</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>F2442</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FGF-10</td>
			<td>PeproTech</td>
			<td>100-26</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FGF2</td>
			<td>PeproTech</td>
			<td>100-18B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>gentleMACS C Tubes</td>
			<td>Miltenyi BioTech</td>
			<td>130-096-334</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>gentleMACS Octo Dissociator with Heaters</td>
			<td>Miltenyi BioTech</td>
			<td>130-096-427</td>
			<td>We use the manufacturers protocol.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GlutaMAX</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>35050061</td>
			<td>dipeptide, L-alanyl-L-glutamine</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hematoxylin and Eosin Staining Kit</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>NC1470670</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Histoplast Paraffin Wax</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>22900700</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microcentrifuge&#160;</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mr. Frosty Freezing Container</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>07202363S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N-acetylcysteine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A9165</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nicotinamide</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>N0636</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>p1000 Pipette with Tips&#160;</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>p200 Pipette with Tips&#160;</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pasteur Pipettes 9&#34;</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>1367820D</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>MT21031CM</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipet Controller</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Prostaglandin E2</td>
			<td>R&#38;D Systems</td>
			<td>2296</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Puromycin&#160;</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>A1113802</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recombinant Murine Noggin</td>
			<td>PeproTech</td>
			<td>250-38</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recovery Cell Culture Freezing Medium</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>12648010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Red Blood Cell Lysis Buffer</td>
			<td>BioLegend</td>
			<td>420301</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ROCK Inhibitor (Y-27632)</td>
			<td>R&#38;D Systems</td>
			<td>1254/1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SB202190</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S7076</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T75 Flask</td>
			<td>MidSci</td>
			<td>TP90076</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue Culture Hood&#160;</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue Embedding Cassette</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TrypLE Express</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>12604013</td>
			<td>animal origin-free, recombinant enzyme</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Type II Collagenase</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>17101015</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vortex</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

generation and culturing of high-grade serous ovarian cancer patient-derived organoids

Organoider är 3D-dynamiska tumörmodeller som kan odlas framgångsrikt från patient-härledd äggstockstumörvävnad, ascites eller pleuravätska och hjälper till vid upptäckten av nya terapier och prediktiva biomarkörer för äggstockscancer. Dessa modeller rekapitulerar klonal heterogenitet, tumörmikromiljön och cell-cell- och cell-matrisinteraktioner. Dessutom har de visat sig matcha den primära tumören morfologiskt, cytologiskt, immunhistokemiskt och genetiskt. Således underlättar organoider forskning om tumörceller och tumörmikromiljön och är överlägsna cellinjer. Det nuvarande protokollet beskriver distinkta metoder för att generera patient-härledda äggstockscancerorganoider från patienttumörer, ascites och pleuravätskeprover med en högre än 97% framgångsgrad. Patientproverna separeras i cellulära suspensioner genom både mekanisk och enzymatisk nedbrytning. Cellerna pläteras sedan med hjälp av ett basalmembranextrakt (BME) och stöds med optimerade tillväxtmedier som innehåller kosttillskott som är specifika för odling av höggradig serös äggstockscancer (HGSOC). Efter att ha bildat initiala organoider kan SUB: erna upprätthålla långsiktig kultur, inklusive passaging för expansion för efterföljande experiment.

För att generera SUB röts proverna mekaniskt och enzymatiskt till encellssuspensioner. Cellerna återsuspenderades sedan i BME och kompletterades med specifikt konstruerade medier (figur 3). Organoider etableras typiskt under en tidsram på 10 dagar, varefter de visar diskreta organoider i kultur (figur 4).
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64878/64878fig03.jpg"><br...

Watch this Scientific Journal Video about Generation and Culturing of High-Grade Serous Ovarian Cancer Patient-Derived Organoids at JoVE.com

Generation and Culturing of High-Grade Serous Ovarian Cancer Patient-Derived Organoids

Patient-derived organoids (PDO) är en tredimensionell (3D) kultur som kan efterlikna tumörmiljön in vitro. Vid höggradig serös äggstockscancer utgör SUB en modell för att studera nya biomarkörer och terapier.

Generering och odling av höggradig serös äggstockscancer patient-derived organoider

Organoids are 3D dynamic tumor models that can be grown successfully from patient-derived ovarian tumor tissue, ascites, or pleural fluid and aid in the ...

Patientdrivna organoidmodeller representerar genetiskt och funktionellt sina modertumörer och är därmed tillförlitliga modeller för att studera nya terapier och komplexa biologiska processer vid äggstockscancer. Genom att rekapitulera klonal heterogenitet, tumörmikromiljön och in vitro cell till cellinteraktioner, övervinner dessa modeller begränsningarna hos cancercellinjer och patienthärledda xenotransplantat. Patienthärledda organoider erbjuder långsiktig expansions- och lagringskapacitet och efterliknar tumörfysiologi.Som ett resultat är de idealiska modeller för studier av nya terapier och prediktiva biomarkörer. Börja skörden av organoiderna genom att placera tumörproverna i en 10 centimeter vävnadsodlingsskål och hacka vävnaden för att skapa en homogen blandning med en engångsskalpell. Placera den homogena vävnadsblandningen i ett dissociationsrör med pincett.För varje en till två milliliter homogeniserad vävnad tillsätt sju till åtta milliliter av ett milligram per milliliter typ två kollagenaslösning i organoidbasmedium och en milliliter DNas One-lösning. Virvla lösningen vid 458 G.Kondensera vävnaden medan den är i kollagenaslösningen med hjälp av dissociationsmaskinen. Kör programmet 37 C understreck H understryk TDK tre en timme tills det är en enda cellsuspension.När du är klar, överför den homogeniserade blandningen till ett nytt 50 ml koniskt rör. Tillsätt 20 till 40 ml organoidbasmedium och virvla lösningen vid 458 G.Filtrera sedan lösningen genom en 100 mikrometer cellsil i ett nymärkt 50 ml koniskt rör. Därefter centrifugera den filtrerade blandningen vid 1 650 G i fem minuter vid fyra grader Celsius och aspirera supernatanten med en glaspipett.Bered 100 mikrogram per milliliter Dnase One och suspendera cellerna i en milliliter Dnase One-lösning genom att tillsätta droppvis DNase One-lösning. Efter 15 minuters inkubation vid rumstemperatur tillsätt 25 ml organoidbasmedium till cellerna och invertera för att blanda. Centrifugera sedan cellerna vid 1 650 G i fem minuter vid fyra grader Celsius och sug försiktigt supernatanten med en glaspipett.Resuspendera den nybildade cellpelleten i fem milliliter förvärmda röda blodkroppar eller RBC-lysbuffert. Virvla lösningarna i varje koniskt rör vid 458 G och inkubera i fem minuter. Centrifugera återigen pelleten suspenderad i RBC-lysbuffert och aspirera supernatanten med en glasbetespipett.Tvätta pelleten med 10 ml PBS och virvla cellerna före centrifugering av cellerna. För en stor cellpellet, aspirera PBS och tillsätt en milliliter av organoidbasmediet ovanpå pelleten. Efter virvling av lösningen, överför 300 till 400 mikroliter av cellsuspensionen till ett mikrocentrifugrör.Efter fem minuters centrifugering, aspirera supernatanten och suspendera den igen i basalmembranextrakt, eller BME, och organoidbasmedium med kalla spetsar. Platta den återsuspenderade celllösningen i en sexbrunnsplatta i 40 mikroliter alikvoter. Platta upp till fem alikvoter per brunn.Placera omedelbart brunnplattan i inkubatorn i 20 minuter, och tillsätt försiktigt två milliliter av det kompletta organoidmediet i varje brunn efter inkubationen. Tillsätt en milliliter organoidbasmedium till varje brunn och pipettera mediet upp och ner direkt på organoidflikarna för dissociation. Samla upp allt medium som innehåller de återsuspenderade pelletsen i ett 15 ml koniskt rör.Centrifugera sedan det 15 ml koniska röret innehållande blandningen i fem minuter innan supernatanten aspireras. Tillsätt en milliliter fritt rekombinant enzym av animaliskt ursprung till cellpelleten. Blanda genom virvling och överför suspensionen till ett 1,5 ml mikrocentrifugrör.Efter 15 minuters inkubation i ett 37 graders vattenbad och fem minuters centrifugering, aspirera supernatanten. Återsuspendera pelleten i BME och organoidbasmediet och platta den återsuspenderade celllösningen till en sexbrunnsplatta i 40 mikroliter alikvoter. Platta upp till fem alikvoter per brunn.Efter 20 minuters inkubation tillsätt försiktigt två ml av det kompletta organoidmediet i varje brunn. Återsuspendera passagen organoid cellpellet i 0,5 till en milliliter Recovery Cell Culture Freezing Medium och överför en milliliter till varje kryoflaska innan du överför dem till minus 80 grader och flytande kvävetank för långvarig lagring. Tina organoiderna genom att överföra kryoflaskorna lagrade i flytande kväve till 37 grader Celsius vattenbad.När de har tinats, överför organoiderna till ett 15 ml koniskt rör och centrifugera dem innan du aspirerar supernatanten. Tillsätt sedan en milliliter PBS till pelleten och överför den återsuspenderade pelleten till ett 1,5 ml mikrocentrifugrör Efter centrifugering vid 1 650 G i fem minuter vid fyra grader Celsius, aspirera försiktigt supernatanten med en glaspipett. Återsuspendera pelleten i BME och organoidbasmedium och platta de återsuspenderade cellerna på en sexbrunnsplatta i 40 mikroliter alikvoter.Placera upp till fem alikvoter per brunn. Placera omedelbart plattan i inkubatorn i 20 minuter innan du tillsätter två ml komplett organoidmedium till brunnarna. Organoider etablerades över 10 dagar, varefter de visade diskreta organoider i odling.Patienthärledda organoidkulturer bedömdes genom att bädda in dem i agaros och utvärdera dem med hematoxylin och eosinfärgning. Det är viktigt att överväga utmaningarna med att arbeta med BME. Resuspensionen av cellpelleten och BME måste göras på is så att inga bubblor bildas i processen.Denna teknik möjliggör ytterligare forskning om effekterna av kemoterapi på organoidgenerering och utveckling på grund av de problem som patienter som har genomgått neoadjuvant kemoterapi stöter på.

Research

JoVE Journal

Cancer Research

Establishment of Gastric Cancer Patient-derived Xenograft Models and Primary Cell Lines

Inrättande av patienter med Ventrikelhärledd xenograft-modell och primära cellinjer

The use of preclinical models to advance our understanding of tumor biology and investigate the efficacy of therapeutic agents is key to cancer research. ...

High-Throughput In Vitro Assay using Patient-Derived Tumor Organoids

High-Throughput In Vitro Assay using Patient-Derived Tumor Organoids

In vitro-analys med hög genomströmning med patient-härledda tumörorganoider

Patient-derived tumor organoids (PDOs) are expected to be a preclinical cancer model with better reproducibility of disease than traditional cell culture ...

Profiling Sensitivity to Targeted Therapies in EGFR-Mutant NSCLC Patient-Derived Organoids

Profileringskänslighet mot riktade terapier i EGFR-mutanta NSCLC patientbaserade organoider

Novel 3D cancer organoid cultures derived from clinical patient specimens represent an important model system to evaluate intratumor heterogeneity and ...

Orthotopic Implantation of Patient-Derived Cancer Cells in Mice Recapitulates Advanced Colorectal Cancer

Ortotopisk implantation av patienthärledda cancerceller hos möss rekapitulerar avancerad kolorektal cancer

Over the last decade, more sophisticated preclinical colorectal cancer (CRC) models have been established using patient-derived cancer cells and 3D ...

Establishment and Culture of Patient-Derived Breast Organoids

Etablering och odling av patient-härledda bröstorganoider

Breast cancer is a complex disease that has been classified into several different histological and molecular subtypes. Patient-derived breast tumor ...

Visualizing DNA Damage Repair Proteins in Patient-Derived Ovarian Cancer Organoids via Immunofluorescence Assays

Visualizing DNA Damage Repair Proteins in Patient-Derived Ovarian Cancer Organoids via Immunofluorescence Assays

Visualisera DNA-skador reparera proteiner i patient-derived äggstockscancer organoider via immunofluorescensanalyser

Immunofluorescence is one of the most widely used techniques to visualize target antigens with high sensitivity and specificity, allowing for the accurate ...

Ovarian Cancer Patient-Derived Organoid Models for Pre-Clinical Drug Testing

Ovarian cancer is a fatal gynecologic cancer and the fifth leading cause of cancer death among women in the United States. Developing new drug treatments ...

Automated Kinetic Imaging for Drug Assessment in Patient-Derived Tumor Organoids

Multiplexed Live-Cell Imaging for Drug Responses in Patient-Derived Organoid Models of Cancer

Author Spotlight: Developing Multiplexed Kinetic Assays for Organoid-Based Drug Response Analysis

Patient-derived organoid (PDO) models of cancer are a multifunctional research system that better recapitulates human disease as compared to cancer cell ...

Derivation of 3D Glioma Organoids from Chopper-Processed Patient Tumors

Cultivating Ex Vivo Patient-Derived Glioma Organoids Using a Tissue Chopper

Author Spotlight: Enhanced Generation of Patient-Derived 3D Organoids for Glioblastoma and Glioma

Glioblastoma, IDH-wild type, CNS WHO grade 4 (GBM) is a primary brain tumor associated with poor patient survival despite aggressive treatment. Developing ...

Standardizing Ovarian Cancer Organoid Biobanking

Strategy for Biobanking of Ovarian Cancer Organoids: Addressing the Interpatient Heterogeneity across Histological Subtypes and Disease Stages

Author Spotlight: Advancing Personalized Medicine in Ovarian Cancer 

Strategi för biobankning av äggstockscancerorganoider: Att ta itu med den interkliniska heterogeniteten över histologiska subtyper och sjukdomsstadier

While the establishment of an ovarian cancer biobank from patient-derived organoids along with their clinical background information promises advances in ...