Name: generation and culturing of high-grade serous ovarian cancer patient-derived organoids
Uploaded: 2023-01-06T14:50:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Generation and Culturing of High-Grade Serous Ovarian Cancer Patient-Derived Organoids at JoVE.com

Ron Bose, MD, PhD'nin rehberliği ve bu protokolün oluşturulmasında Barbara Blachut, MD'nin yardımı için minnettarız. Ayrıca, St. Louis'in Kadın Hastalıkları ve Doğum Bölümü ve Jinekolojik Onkoloji Bölümü'ndeki Washington Üniversitesi Tıp Fakültesi'ne, Washington Üniversitesi Dekan'ın Akademik Programı'na ve Üreme Bilim İnsanı Geliştirme Programı'na bu projeye verdikleri destek için teşekkür ederiz.

Araştırma için toplanan tüm insan dokusu örnekleri, Kurumsal İnceleme Kurulu (IRB) onaylı protokole göre elde edilmiştir. Aşağıda özetlenen protokoller steril bir insan doku kültürü ortamında gerçekleştirilmiştir. İnsan deneklerden bilgilendirilmiş yazılı onam alındı. Uygun hastaların yumurtalık kanseri tanısı veya varsayılan tanısı olması, bilgilendirilmiş onam imzalamaya istekli ve yetenekli olması ve en az 18 yaşında olması gerekiyordu. Tümör dokusu (malign primer tümör veya ...

<ol>
	<li>Bray, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Global+cancer+statistics+2018:+GLOBOCAN+estimates+of+incidence+and+mortality+worldwide+for+36+cancers+in+185+countries.">Global cancer statistics 2018: GLOBOCAN estimates of incidence and mortality worldwide for 36 cancers in 185 countries.</a> CA: A Cancer Journal for Clinicians. 68 (6), 394-424 (2018).</li><li>Drost, J., Clevers, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Organoids+in+cancer+research.">Organoids in cancer research.</a> Nature Reviews Cancer. 18 (7), 407-418 (2018).</li><li>Pauli, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Personalized+in+vitro+and+in+vivo+cancer+models+to+guide+precision+medicine.">Personalized in vitro and in vivo cancer models to guide precision medicine.</a> Cancer Discovery. 7 (5), 462-477 (2017).</li><li>Fujii, E., Kato, A., Suzuki, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Patient-derived+xenograft+(PDX)+models:+Characteristics+and+points+to+consider+for+the+process+of+establishment.">Patient-derived xenograft (PDX) models: Characteristics and points to consider for the process of establishment.</a> Journal of Toxicologic Pathology. 33 (3), 153-160 (2020).</li><li>Yang, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Application+of+ovarian+cancer+organoids+in+precision+medicine:+Key+challenges+and+current+opportunities.">Application of ovarian cancer organoids in precision medicine: Key challenges and current opportunities.</a> Frontiers in Cell and Developmental Biology. 9, 701429 (2021).</li><li>Yang, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Patient-derived+organoids:+A+promising+model+for+personalized+cancer+treatment.">Patient-derived organoids: A promising model for personalized cancer treatment.</a> Gastroenterology Report. 6 (4), 243-245 (2018).</li><li>Karakasheva, T. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+and+characterization+of+patient-derived+head+and+neck,+oral,+and+esophageal+cancer+organoids.">Generation and characterization of patient-derived head and neck, oral, and esophageal cancer organoids.</a> Current Protocols in Stem Cell Biology. 53 (1), 109 (2020).</li><li>Madison, B. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Let-7+represses+carcinogenesis+and+a+stem+cell+phenotype+in+the+intestine+via+regulation+of+Hmga2.">Let-7 represses carcinogenesis and a stem cell phenotype in the intestine via regulation of Hmga2.</a> PLoS Genetics. 11 (8), 1005408 (2015).</li><li>Sato, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single+Lgr5+stem+cells+build+crypt-villus+structures+in+vitro+without+a+mesenchymal+niche.">Single Lgr5 stem cells build crypt-villus structures in vitro without a mesenchymal niche.</a> Nature. 459 (7244), 262-265 (2009).</li><li>Murray, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=HER2+and+APC+mutations+promote+altered+crypt-villus+morphology+and+marked+hyperplasia+in+the+intestinal+epithelium.">HER2 and APC mutations promote altered crypt-villus morphology and marked hyperplasia in the intestinal epithelium.</a> Cellular and Molecular Gastroenterology and Hepatology. 12 (3), 1105-1120 (2021).</li><li>Hill, S. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Prediction+of+DNA+repair+inhibitor+response+in+short-term+patient-derived+ovarian+cancer+organoids.">Prediction of DNA repair inhibitor response in short-term patient-derived ovarian cancer organoids.</a> Cancer Discovery. 8 (11), 1404-1421 (2018).</li><li>Passarelli, M. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Leucyl-tRNA+synthetase+is+a+tumour+suppressor+in+breast+cancer+and+regulates+codon-dependent+translation+dynamics.">Leucyl-tRNA synthetase is a tumour suppressor in breast cancer and regulates codon-dependent translation dynamics.</a> Nature Cell Biology. 24 (3), 307-315 (2022).</li><li>Pleguezuelos-Manzano, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Establishment+and+culture+of+human+intestinal+organoids+derived+from+adult+stem+cells.">Establishment and culture of human intestinal organoids derived from adult stem cells.</a> Current Protocols in Immunology. 130 (1), 106 (2020).</li><li>Stumm, M. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Validation+of+a+postfixation+tissue+storage+and+transport+medium+to+preserve+histopathology+and+molecular+pathology+analyses+(total+and+phosphoactivated+proteins,+and+FISH).">Validation of a postfixation tissue storage and transport medium to preserve histopathology and molecular pathology analyses (total and phosphoactivated proteins, and FISH).</a> American Journal of Clinical Pathology. 137 (3), 429-436 (2012).</li><li>Feldman, A. T., Wolfe, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tissue+processing+and+hematoxylin+and+eosin+staining.">Tissue processing and hematoxylin and eosin staining.</a> Methods in Molecular Biology. 1180, 31-43 (2014).</li><li>Ooft, S. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Patient-derived+organoids+can+predict+response+to+chemotherapy+in+metastatic+colorectal+cancer+patients.">Patient-derived organoids can predict response to chemotherapy in metastatic colorectal cancer patients.</a> Science Translational Medicine. 11 (513), (2019).</li><li>Aisenbrey, E. A., Murphy, W. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synthetic+alternatives+to+Matrigel.">Synthetic alternatives to Matrigel.</a> Nature Reviews Materials. 5 (7), 539-551 (2020).</li><li>Nanki, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Patient-derived+ovarian+cancer+organoids+capture+the+genomic+profiles+of+primary+tumours+applicable+for+drug+sensitivity+and+resistance+testing.">Patient-derived ovarian cancer organoids capture the genomic profiles of primary tumours applicable for drug sensitivity and resistance testing.</a> Scientific Reports. 10, 12581 (2020).</li><li>Mead, B. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Screening+for+modulators+of+the+cellular+composition+of+gut+epithelia+via+organoid+models+of+intestinal+stem+cell+differentiation.">Screening for modulators of the cellular composition of gut epithelia via organoid models of intestinal stem cell differentiation.</a> Nature Biomedical Engineering. 6 (4), 476-494 (2022).</li></ol>

Yumurtalık kanseri, tanıdaki ileri aşaması ve kemoterapi direncinin ortak gelişimi nedeniyle son derece ölümcüldür. Yumurtalık kanseri araştırmalarında kanser hücre hatları ve PDX modelleri kullanılarak birçok ilerleme kaydedilmiştir; Bununla birlikte, daha temsili ve uygun fiyatlı bir in vitro modele belirgin bir ihtiyaç vardır. PDO'ların tümör heterojenliğini, tümör mikroçevresini ve primer tümörlerinin genomik ve transkriptomik özelliklerini doğru bir şekilde temsil ettiği ka...

2021 yılında, Amerika Birleşik Devletleri'nde yaklaşık 21.410 kadına yeni epitel yumurtalık kanseri teşhisi kondu ve 12.940 kadın bu hastalıktan öldü1. Cerrahi ve kemoterapide yeterli ilerlemeler kaydedilmesine rağmen, ilerlemiş hastalığı olan hastaların %70'inden fazlası kemoterapötik direnç geliştirir ve tanıdan sonraki 5 yıl içinde ölür 2,3. Bu nedenle, bu ölümcül hastalığı tedavi etmek için yeni stratejilere ve klinik öncesi araştırmalar için temsili, güvenilir modellere acilen ihtiyaç duyulmaktadır.
Kanser hücre hatları ve primer over tümörlerinden oluşturulan hasta kaynaklı ksenogreftler (PDX), yumurtalık kanseri araştırmalarında kullanılan başlıca araçlardır. Kanser hücre hatlarının en büyük avantajı, hızlı genişlemeleridir. Bununla birlikte, sürekli kültürleri, kanser hücresi hatlarının orijinal birincil kanser tümör örneğinden sapmasına neden olan fenotipik ve genotipik değişikliklerle sonuçlanır. Kanser hücre hattı ile primer tümör arasındaki mevcut farklılıklar nedeniyle, hücre hatlarında olumlu etkileri olan ilaç tahlilleri klinik çalışmalarda aynı etkilere sahip olamamaktadır2. Bu sınırlamaların üstesinden gelmek için PDX modelleri kullanılır. Bu modeller, taze yumurtalık kanseri dokusunun immün yetmezlikli farelere implante edilmesiyle oluşturulur. İn vivo modeller oldukları için, insan biyolojik özelliklerine daha doğru bir şekilde benzerler ve sırayla ilaç sonuçlarının daha öngörücüsüdürler. Bununla birlikte, bu modellerin bunları oluşturmak için gereken maliyet, zaman ve kaynaklar dahil olmak üzere önemli sınırlamaları da vardır4.
PDO'lar, hem kanser hücre hatlarının hem de PDX modellerinin sınırlamalarının üstesinden gelen klinik öncesi araştırmalar için alternatif bir model sunar. PDO'lar hastanın tümörünü ve tümör mikroçevresini özetler ve böylece klinik öncesi araştırmalar için ideal olan in vitro izlenebilir bir model sağlar 2,3,5. Bu 3D modeller, iki boyutlu (2D) hücre hattı muadillerinin sahip olmadığı bir özellik olan birincil tümörü modelleyen kendi kendine organizasyon yeteneklerine sahiptir. Ayrıca, bu modellerin genetik ve işlevsel olarak ebeveyn tümörlerini temsil ettiği gösterilmiştir ve bu nedenle, yeni terapötikleri ve biyolojik süreçleri incelemek için güvenilir modellerdir. Kısacası, hücre hatlarına benzer uzun vadeli genişleme ve depolama yetenekleri sunarlar, ancak aynı zamanda fare modellerine özgü mikro ortamı ve hücre-hücre etkileşimlerini de kapsarlar 4,6.
Mevcut protokol, %97'den daha yüksek başarı oranına sahip hasta kaynaklı tümörler, asitler ve plevral sıvı örneklerinden PDO'ların oluşturulmasını açıklamaktadır. PDO kültürleri daha sonra birden fazla nesil boyunca genişletilebilir ve ilaç tedavisi duyarlılığını ve prediktif biyobelirteçleri test etmek için kullanılabilir. Bu yöntem, PDO'ların terapötik yanıtlarına dayanarak tedavileri kişiselleştirmek için kullanılabilecek bir tekniği temsil eder.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>1% HEPES</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>15630080</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1% Penicillin-Streptomycin</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>30002CI</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1.5 mL Eppendorf Tubes&#160;</td>
			<td>Genesee Scientific</td>
			<td>14125</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10 cm Tissue Culture Dish&#160;</td>
			<td>TPP</td>
			<td>93100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10 mL Serological Pipet</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>100 &#181;m Cell Filter</td>
			<td>MidSci</td>
			<td>100ICS</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>15 mL centrifuge tubes</td>
			<td>Corning</td>
			<td>430052</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2 mL Cryovial</td>
			<td>Simport Scientific</td>
			<td>T301-2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2% Paraformaldehyde Fixative</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>37 &#176;C water bath&#160;</td>
			<td>NEST</td>
			<td>602052</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3dGRO R-Spondin-1 Conditioned Media Supplement</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>SCM104</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>6 well plates</td>
			<td>TPP</td>
			<td>92006</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>70% Ethanol</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>R31541GA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>A83-01</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>SML0788</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Advanced DMEM/F12</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>12634028</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agar</td>
			<td>Lamda Biotech</td>
			<td>C121</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>B-27</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>17504044</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge&#160;</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cultrex Type 2</td>
			<td>R&#38;D Systems</td>
			<td>3533-010-02</td>
			<td>basement membrane extract</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNase I</td>
			<td>New England Bio Labs</td>
			<td>M0303S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNase I Reaction Buffer</td>
			<td>New England Bio Labs</td>
			<td>M0303S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EGF</td>
			<td>PeproTech</td>
			<td>AF-100-15</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FBS&#160;</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>F2442</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FGF-10</td>
			<td>PeproTech</td>
			<td>100-26</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FGF2</td>
			<td>PeproTech</td>
			<td>100-18B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>gentleMACS C Tubes</td>
			<td>Miltenyi BioTech</td>
			<td>130-096-334</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>gentleMACS Octo Dissociator with Heaters</td>
			<td>Miltenyi BioTech</td>
			<td>130-096-427</td>
			<td>We use the manufacturers protocol.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GlutaMAX</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>35050061</td>
			<td>dipeptide, L-alanyl-L-glutamine</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hematoxylin and Eosin Staining Kit</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>NC1470670</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Histoplast Paraffin Wax</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>22900700</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microcentrifuge&#160;</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mr. Frosty Freezing Container</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>07202363S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N-acetylcysteine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A9165</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nicotinamide</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>N0636</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>p1000 Pipette with Tips&#160;</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>p200 Pipette with Tips&#160;</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pasteur Pipettes 9&#34;</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>1367820D</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>MT21031CM</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipet Controller</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Prostaglandin E2</td>
			<td>R&#38;D Systems</td>
			<td>2296</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Puromycin&#160;</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>A1113802</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recombinant Murine Noggin</td>
			<td>PeproTech</td>
			<td>250-38</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recovery Cell Culture Freezing Medium</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>12648010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Red Blood Cell Lysis Buffer</td>
			<td>BioLegend</td>
			<td>420301</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ROCK Inhibitor (Y-27632)</td>
			<td>R&#38;D Systems</td>
			<td>1254/1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SB202190</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S7076</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T75 Flask</td>
			<td>MidSci</td>
			<td>TP90076</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue Culture Hood&#160;</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue Embedding Cassette</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TrypLE Express</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>12604013</td>
			<td>animal origin-free, recombinant enzyme</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Type II Collagenase</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>17101015</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vortex</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

generation and culturing of high-grade serous ovarian cancer patient-derived organoids

Organoidler, hasta kaynaklı yumurtalık tümör dokusundan, asitlerinden veya plevral sıvıdan başarıyla yetiştirilebilen ve yumurtalık kanseri için yeni terapötiklerin ve prediktif biyobelirteçlerin keşfine yardımcı olan 3D dinamik tümör modelleridir. Bu modeller klonal heterojenliği, tümör mikroçevresini ve hücre-hücre ve hücre-matris etkileşimlerini özetler. Ek olarak, primer tümörü morfolojik, sitolojik, immünohistokimyasal ve genetik olarak eşleştirdikleri gösterilmiştir. Böylece, organoidler tümör hücreleri ve tümör mikroçevresi üzerinde araştırmayı kolaylaştırır ve hücre hatlarından üstündür. Mevcut protokol, %97'den daha yüksek başarı oranına sahip hasta tümörleri, asitler ve plevral sıvı örneklerinden hasta kaynaklı yumurtalık kanseri organoidleri üretmek için farklı yöntemler tanımlamaktadır. Hasta örnekleri hem mekanik hem de enzimatik sindirim ile hücresel süspansiyonlara ayrılır. Hücreler daha sonra bir bazal membran ekstresi (BME) kullanılarak kaplanır ve yüksek dereceli seröz yumurtalık kanserinin (HGSOC) kültürlenmesine özgü takviyeler içeren optimize edilmiş büyüme ortamı ile desteklenir. İlk organoidleri oluşturduktan sonra, PDO'lar sonraki deneyler için genişleme için pasaj da dahil olmak üzere uzun vadeli kültürü sürdürebilir.

PDO'lar üretmek için, numuneler mekanik ve enzimatik olarak tek hücreli süspansiyonlara sindirildi. Hücreler daha sonra BME'de yeniden askıya alındı ve özel olarak tasarlanmış ortamlarla desteklendi (Şekil 3). Organoidler tipik olarak 10 günlük bir zaman diliminde kurulur, daha sonra kültürde ayrı organoidler gösterirler (Şekil 4).
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/...

Watch this Scientific Journal Video about Generation and Culturing of High-Grade Serous Ovarian Cancer Patient-Derived Organoids at JoVE.com

Generation and Culturing of High-Grade Serous Ovarian Cancer Patient-Derived Organoids

Hasta kaynaklı organoidler (PDO), tümör ortamını in vitro olarak taklit edebilen üç boyutlu (3D) bir kültürdür. Yüksek dereceli seröz over kanserinde, PDO'lar yeni biyobelirteçleri ve terapötikleri incelemek için bir model oluşturur.

Yüksek Dereceli Seröz Yumurtalık Kanseri Hasta Kaynaklı Organoidlerin Üretimi ve Kültürlenmesi

Organoids are 3D dynamic tumor models that can be grown successfully from patient-derived ovarian tumor tissue, ascites, or pleural fluid and aid in the ...

Hasta sürücü organoid modelleri, genetik ve fonksiyonel olarak ana tümörlerini temsil eder ve bu nedenle yumurtalık kanserinde yeni terapötikleri ve karmaşık biyolojik süreçleri incelemek için güvenilir modellerdir. Klonal heterojenliği, tümör mikroçevresini ve in vitro hücreden hücreye etkileşimleri özetleyerek, bu modeller kanser hücre hatlarının ve hasta kaynaklı ksenogreftlerin sınırlamalarının üstesinden gelir. Hasta kaynaklı organoidler uzun süreli genişleme ve depolama yetenekleri sunar ve tümör fizyolojisini taklit eder.Sonuç olarak, yeni terapötiklerin ve öngörücü biyobelirteçlerin incelenmesi için ideal modellerdir. Tümör örneklerini 10 santimetrelik bir doku kültürü kabına yerleştirerek ve tek kullanımlık bir neşter kullanarak homojen bir karışım oluşturmak için dokuyu kıyarak organoidlerin toplanmasına başlayın. Homojen doku karışımını forseps kullanarak bir ayrışma tüpüne yerleştirin.Her bir ila iki mililitre homojenize doku için, organoid baz ortamında mililitre başına yedi ila sekiz mililitre bir miligram tip iki kollajenaz çözeltisi ve bir mililitre DNaz Bir çözeltisi ekleyin. 458 G.'deki çözeltiyi vorteksleyin Ayrışma makinesini kullanarak kollajenaz çözeltisindeyken dokuyu sıvılaştırın. Programı çalıştırın 37 C alt çizgi H alt çizgi TDK üç bir saat tek hücreli süspansiyon olana kadar.Tamamlandığında, homojenize edilmiş karışımı yeni bir 50 mililitrelik konik tüpe aktarın. 20 ila 40 mililitre organoid baz ortamı ekleyin ve çözeltiyi 458 G'de vorteksleyin.Daha sonra çözeltiyi 100 mikrometrelik bir hücre süzgecinden yeni etiketlenmiş 50 mililitrelik konik bir tüpe filtreleyin. Daha sonra, filtrelenmiş karışımı dört santigrat derecede beş dakika boyunca 1.650 G'de santrifüj edin ve bir cam mera pipeti kullanarak süpernatantı aspire edin.Mililitre başına 100 mikrogram Dnase One hazırlayın ve damla bilge DNase One çözeltisi ekleyerek hücreleri bir mililitre Dnase One çözeltisinde yeniden askıya alın. Oda sıcaklığında 15 dakikalık inkübasyondan sonra hücrelere 25 mililitre organoid baz ortamı ekleyin ve karıştırmak için ters çevirin. Daha sonra hücreleri 1.650 G'de dört santigrat derecede beş dakika boyunca santrifüj edin ve bir cam mera pipeti kullanarak süpernatantı dikkatlice aspire edin.Yeni oluşan hücre peletini beş mililitre önceden ısıtılmış kırmızı kan hücresi veya RBC lizis tamponunda yeniden askıya alın. Her konik tüpteki çözeltileri 458 G'de vorteks edin ve beş dakika boyunca inkübe edin. Yine, RBC lizis tamponunda asılı duran peleti santrifüj edin ve bir cam mera pipeti kullanarak süpernatantı aspire edin.Peleti 10 mililitre PBS ile yıkayın ve hücrelerin santrifüjlenmesinden önce hücreleri vorteksleyin. Büyük hücreli bir pelet için, PBS'yi aspire edin ve peletin üzerine bir mililitre organoid baz ortamı ekleyin. Çözeltiyi vorteksledikten sonra, hücre süspansiyonunun 300 ila 400 mikrolitresini bir mikrosantrifüj tüpüne aktarın.Beş dakikalık santrifüjlemeden sonra, süpernatantı aspire edin ve soğuk uçlar kullanarak bazal membran ekstraktı veya BME ve organoid baz ortamında yeniden askıya alın. Yeniden askıya alınmış hücre çözeltisini 40 mikrolitrelik alikotlarda altı delikli bir plakaya yerleştirin. Kuyu başına beş aliquots'a kadar plaka.Kuyu plakasını derhal 20 dakika boyunca inkübatöre yerleştirin ve inkübasyondan sonra, her bir kuyucuğa tam organoid ortamın iki mililitresini yavaşça ekleyin. Her bir oyuğa bir mililitre organoid baz ortamı ekleyin ve ayrışma için ortamı doğrudan organoid tırnakların üzerine yukarı ve aşağı pipetleyin. Yeniden asılı peletleri içeren tüm ortamları 15 mililitrelik bir konik tüpte toplayın.Daha sonra, süpernatanı aspire etmeden önce karışımı içeren 15 mililitrelik konik tüpü beş dakika boyunca santrifüj edin. Hücre peletine bir mililitre hayvansal kökenli serbest rekombinant enzim ekleyin. Vorteks ile karıştırın ve süspansiyonu 1,5 mililitrelik bir mikrosantrifüj tüpüne aktarın.37 santigrat derecelik bir su banyosunda 15 dakikalık inkübasyondan ve beş dakikalık santrifüjlemeden sonra, süpernatanı aspire edin. Peletin BME ve organoid baz ortamında yeniden askıya alınması ve yeniden askıya alınan hücre çözeltisinin 40 mikrolitrelik alikotlarda altı delikli bir plakaya plakalanması gerekir. Kuyu başına beş aliquots'a kadar plaka.20 dakikalık inkübasyondan sonra, her bir kuyucuğa tam organoid ortamın iki mililitresini yavaşça ekleyin. Geçiş organoid hücre peletini 0.5 ila bir mililitre Geri Kazanım Hücre Kültürü Donma Ortamında yeniden askıya alın ve uzun süreli depolama için eksi 80 dereceye ve sıvı azot tankına aktarmadan önce her kriyo şişesine bir mililitre aktarın. Sıvı azotta depolanan kriyo şişelerini 37 santigrat derece su banyosuna aktararak organoidleri çözün.Çözüldükten sonra, organoidleri 15 mililitrelik bir konik tüpe aktarın ve süpernatanı aspire etmeden önce santrifüj yapın. Daha sonra, pelet için bir mililitre PBS ekleyin ve yeniden askıya alınmış peleti 1.5 mililitrelik bir mikrosantrifüj tüpüne aktarın Dört santigrat derecede beş dakika boyunca 1.650 G'de santrifüjlemeden sonra, bir cam mera pipeti kullanarak süpernatantı dikkatlice aspire edin. Peleti BME ve organoid baz ortamında yeniden askıya alın ve yeniden askıya alınan hücreleri 40 mikrolitre alikotta altı kuyucuklu bir plakaya yerleştirin.Kuyu başına en fazla beş aliquot yerleştirin. Kuyucuklara iki mililitre tam organoid ortam eklemeden önce plakayı hemen 20 dakika boyunca inkübatöre yerleştirin. Organoidler 10 gün içinde kuruldu ve bundan sonra kültürde ayrı organoidler gösterdiler.Hasta kaynaklı organoid kültürler agaroz içine gömülerek hematoksilin ve eozin boyama ile değerlendirilerek değerlendirildi. BME ile çalışmanın zorluklarını göz önünde bulundurmak önemlidir. Hücre peletinin ve BME'nin yeniden süspansiyonu, işlemde kabarcıkların oluşmamasını sağlamak için buz üzerinde yapılmalıdır.Bu teknik, neoadjuvan kemoterapi gören hastaların karşılaştığı sorunlara bağlı olarak kemoterapinin organoid üretimi ve gelişimi üzerindeki etkisi hakkında daha fazla araştırmaya izin verir.

Research

JoVE Journal

Cancer Research

Establishment of Gastric Cancer Patient-derived Xenograft Models and Primary Cell Lines

Mide kanseri hasta-türetilen xenograft modelleri ve primer hücre hatları kurulması

The use of preclinical models to advance our understanding of tumor biology and investigate the efficacy of therapeutic agents is key to cancer research. ...

High-Throughput In Vitro Assay using Patient-Derived Tumor Organoids

High-Throughput In Vitro Assay using Patient-Derived Tumor Organoids

Hasta Kaynaklı Tümör Organoidleri Kullanılarak Yüksek Verimli In Vitro Tahlil

Patient-derived tumor organoids (PDOs) are expected to be a preclinical cancer model with better reproducibility of disease than traditional cell culture ...

Profiling Sensitivity to Targeted Therapies in EGFR-Mutant NSCLC Patient-Derived Organoids

EGFR-Mutant NSCLC Hasta Kaynaklı Organoidlerde Hedefe Yönelik Tedavilere Duyarlılığın Profillenmesi

Novel 3D cancer organoid cultures derived from clinical patient specimens represent an important model system to evaluate intratumor heterogeneity and ...

Orthotopic Implantation of Patient-Derived Cancer Cells in Mice Recapitulates Advanced Colorectal Cancer

Farelerde Hasta Kaynaklı Kanser Hücrelerinin Ortotopik İmplantasyonu, İleri Kolorektal Kanseri Özetliyor

Over the last decade, more sophisticated preclinical colorectal cancer (CRC) models have been established using patient-derived cancer cells and 3D ...

Establishment and Culture of Patient-Derived Breast Organoids

Hasta kaynaklı meme organoidlerinin kurulması ve kültürü

Breast cancer is a complex disease that has been classified into several different histological and molecular subtypes. Patient-derived breast tumor ...

Visualizing DNA Damage Repair Proteins in Patient-Derived Ovarian Cancer Organoids via Immunofluorescence Assays

Visualizing DNA Damage Repair Proteins in Patient-Derived Ovarian Cancer Organoids via Immunofluorescence Assays

İmmünofloresan Tahlilleri ile Hasta Kaynaklı Yumurtalık Kanseri Organoidlerinde DNA Hasar Onarım Proteinlerinin Görselleştirilmesi

Immunofluorescence is one of the most widely used techniques to visualize target antigens with high sensitivity and specificity, allowing for the accurate ...

Ovarian Cancer Patient-Derived Organoid Models for Pre-Clinical Drug Testing

Ovarian cancer is a fatal gynecologic cancer and the fifth leading cause of cancer death among women in the United States. Developing new drug treatments ...

Automated Kinetic Imaging for Drug Assessment in Patient-Derived Tumor Organoids

Multiplexed Live-Cell Imaging for Drug Responses in Patient-Derived Organoid Models of Cancer

Author Spotlight: Developing Multiplexed Kinetic Assays for Organoid-Based Drug Response Analysis

Patient-derived organoid (PDO) models of cancer are a multifunctional research system that better recapitulates human disease as compared to cancer cell ...

Derivation of 3D Glioma Organoids from Chopper-Processed Patient Tumors

Cultivating Ex Vivo Patient-Derived Glioma Organoids Using a Tissue Chopper

Author Spotlight: Enhanced Generation of Patient-Derived 3D Organoids for Glioblastoma and Glioma

Glioblastoma, IDH-wild type, CNS WHO grade 4 (GBM) is a primary brain tumor associated with poor patient survival despite aggressive treatment. Developing ...

Standardizing Ovarian Cancer Organoid Biobanking

Strategy for Biobanking of Ovarian Cancer Organoids: Addressing the Interpatient Heterogeneity across Histological Subtypes and Disease Stages

Author Spotlight: Advancing Personalized Medicine in Ovarian Cancer 

Yumurtalık Kanseri Organoidlerinin Biyobankacılığı Stratejisi: Histolojik Alt Tipler ve Hastalık Evrelerinde Hastalar Arası Heterojenliğin Ele Alınması

While the establishment of an ovarian cancer biobank from patient-derived organoids along with their clinical background information promises advances in ...