Name: mechanical control of relaxation using intact cardiac trabeculae
Uploaded: 2023-02-17T13:35:00
Duration: 7 min 51 s
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这项工作得到了美国国立卫生研究院（1R01HL151738）和美国心脏协会（18TPA34170169）的支持。

以下协议已获得韦恩州立大学机构动物护理和使用委员会的批准。这里的协议描述了利用啮齿动物实验对象的步骤，但可以适用于其他模式生物。
1. 准备
<ol><li>获得实验对象并使其适应实验室。</li>
	<li>制备 250 mL 灌注溶液和 250 mL 改良的 Tyrode 溶液（表 1），将每个灌注溶液氧合至 10-20 ppm 的 O2，pH 7.3。</li>
	<li>准备一个连接套管的 5 mL 注射器。用灌注溶液填充注射器。对小鼠使用23 G的插管，对小鼠或大鼠分别使用18或16 G的插管。在钝针的末端滑动 1 毫米长的聚乙烯 （PE） 管（材料表），以帮助防止主动脉在绑扎后从套管上滑落。</li>
	<li>完全准备解剖和插管区域（图1）<ol><li>用灌注溶液填充两个干净的称重船至少一半。将套管的尖端浸入灌注溶液中，并在套管周围放置至少一条双环缝合线。用条夹将注射器固定到位。</li>
		<li>放置手术剪刀、止血器、虹膜钳、一对小弯曲剪刀和两个 #3 镊子，以便于取用。</li>
	</ol></li>
	<li>通过在整个实验系统中启动和循环改良的Tyrode溶液来制备实验系统（图2）。确保腔室完全充满且稳定。</li>
	<li>打开所有数据采集盒，包括力传感器、长度电机、起搏系统、温度控制系统和数据采集计算机。</li>
	<li>复制并重命名包含所需 *.dap 和指针文件的模板文件夹，以引用当前试验。打开数据采集软件。</li>
	<li>准备小梁隔离工具（Vannas剪刀，#5或#55镊子，玻璃探针），方法是将其尖端浸入超纯水或灌注溶液中的10%（w / v）牛血清白蛋白（BSA）中，用蛋白质涂覆金属（图2B）。 注意：整个实验系统必须在解剖前准备好。</li>
</ol>2.大体解剖和插管
<ol><li>记录动物受试者的身份、体重等相关信息。</li>
	<li>可选地，在安乐死前至少 10 分钟通过腹腔注射 向 啮齿动物注射 1，000 U/kg 无菌盐水中的肝素，以尽量减少冠状动脉灌注前凝血的风险。</li>
	<li>根据标准程序，将动物置于诱导室中，并使用在100%氧气中蒸发的3%-5%异氟醚诱导全身麻醉。 注意：打开任何用于尽量减少接触异氟醚的外部清除器、下风台或通风柜。</li>
	<li>一旦啮齿动物失去矫正反射并且呼吸频率减慢：<ol><li>（对于大鼠）将动物从诱导室中取出并将其仰卧放在解剖垫上，通过鼻锥持续麻醉。</li>
		<li>（对于小鼠）将动物从诱导室中取出后立即进行颈椎脱位。鼻锥不是必需的。将异氟醚蒸发器转到0%。</li>
	</ol></li>
	<li>如果需要，使用由别针支撑的胶带将啮齿动物的上肢固定在远离胸壁的解剖垫上，注意不要刺穿动物。在进行解剖之前，检查适当的麻醉深度（缺乏脚趾捏反应）。</li>
	<li>使用手术剪刀（大鼠蛋黄酱，小鼠梅岑鲍姆），就在木突下方，将啮齿动物腹部整个宽度的皮肤横向切入腹膜空间。</li>
	<li>使用手术剪刀，从横向切口在胸壁的左侧和右侧进行两次垂直切口（胸壁两侧）。然后，穿过横膈膜，连接矢状旁切口，释放胸腔。</li>
	<li>使用止血器夹紧并抬起木突朝啮齿动物的头部，将胸骨和胸壁向上移向啮齿动物的头部，露出胸腔和心脏。如果需要，迅速将矢状旁切口延伸至第二椎间隙附近，以完全暴露心脏和/或破坏心包膜。</li>
	<li>使用弯曲的虹膜钳，小心地抬起心脏以可视化大血管。将镊子放在心肌和啮齿动物的脊柱之间，夹紧较大的血管，抬起心脏，注意不要夹住心房或心室段。<ol><li>在稍微抬起心脏的同时，迅速将弯曲的虹膜剪刀（向上凹陷）放在弯曲的虹膜镊子和啮齿动物的脊柱之间，并将大血管和肺从心脏上切开。快速将心脏移入装有新鲜灌注溶液的称重船或烧杯中，摇晃以帮助清除心脏上的血液。</li>
	</ol></li>
	<li>将异氟烷蒸发器转到 0%，如果尚未完成。如果肺、心包或其他组织的大部分仍然附着在心脏上，此时请小心地切开并丢弃它们，以尽量减少对插管的干扰。</li>
	<li>使用弯曲的虹膜钳，将心脏移动到干净的称重船或烧杯中，将准备好的套管浸没。套管主动脉，通过收紧环状丝线固定主动脉，并用多达 5 mL 的灌注溶液冲洗。</li>
	<li>从套管中取出心脏，并将其放入涂有硅弹性体的称重盘中，以准备分离小梁。</li>
</ol>3. 小梁的分离与平衡
<ol><li>将心脏放入体视显微镜下的有机硅弹性体涂层培养皿中并照亮它。</li>
	<li>找到右心室流出道。将左心房和心室顶点固定在培养皿中的有机硅弹性体上。</li>
	<li>使用长Vannas剪刀，沿隔从右心室流出道切到顶点。从右心室流出道切到主动脉附近的右心房，然后切开右心房（图3B）。</li>
	<li>使用镊子，小心地从流出道拉开右心室（RV）游离壁，注意不要拉伸组织。 注意：实验者可能会发现细而白色的结缔组织链，可以放心地切割。较大的粉红色（组织）色链应仔细评估，因为它们可能是可以分离的小梁。</li>
	<li>将右心室三角形的自由壁固定在培养皿上，以暴露右心室（图3C）。</li>
	<li>使用已熔化并形成薄（直径<500μm）但不锋利的玻璃移液管，在暴露的心内膜中搜索独立小梁（图3C）。 注意：独立式小梁是一条肌肉，可以在下面完全探测。使用具有平行边（恒定宽度）的小梁，避免三角形肌。在此过程中和随后的解剖过程中要小心，因为对小梁施加应变会造成损伤，从而减少产生的力。</li>
	<li>用小瓦纳斯剪刀解剖小梁。在小梁的每一端留一块 ≥1 毫米立方的组织以允许附着。尽可能不要拉伸小梁，并尽量减少金属工具的接触，因为两者都会对肌肉造成损害。根据需要重新定位固定心脏的销钉，以最大程度地减少对已识别小梁附近肌肉的压力。</li>
	<li>从 7 mL 移液器的末端切下 ~2 英寸，将小梁慢慢拉入移液管中，然后将其转移到含有 50% 灌注溶液和 50% 改良 Tyrode 溶液的新称量盘中。让肌肉平衡到混合溶液中细胞外钙的增加几分钟。<ol><li>此时重复步骤3.7-3.8解剖其他小梁，以获取其他小梁作为备份。</li>
	</ol></li>
	<li>关闭向实验室提供超流和/或抽吸的泵。使用大口径转移移液器，将小梁移动到充满Tyrode溶液的实验室中。</li>
	<li>将小梁末端的一块 >1 mm 立方体组织固定到力传感器上的钩子上，然后将第二个立方体固定到电机上。 注意：安装第一侧时，将电机和力传感器分开，以便更好地接近传感器，然后在安装第二个组织立方体时将钩子尽可能靠近，同时小梁保持松弛。</li>
	<li>重新启动超级融合并开始起搏肌肉以确定阈值电压。以高于阈值电压20%的速度行驶约1小时，以使小梁平衡。</li>
	<li>在这个平衡期结束时，通过观察发展（最小到峰值）张力，使用连接到电机的千分尺缓慢拉伸肌肉，直到达到最佳应力生成。当被动舒张张力上升速度快于峰值张力时，停止增加肌肉长度，表明已通过最佳长度。</li>
	<li>关闭透射显微镜照明，并使用鹅颈照明器以陡峭的角度照亮小梁。使用通过先前校准的显微镜光学元件连接的相机，将舒张期间的小梁图像捕获到实验文件夹中。如果小梁比相机的视野宽，请在肌肉上拍摄多张图像。</li>
	<li>在报告像素距离的成像软件中打开图像。<ol><li>测量肌肉直径沿其长度四倍的像素距离。以像素为单位测量肌肉（小梁）长度，不包括大立方体组织。</li>
		<li>如果肌肉长度长于视野，请使用沿肌肉的参考点来测量整个长度。</li>
	</ol></li>
	<li>使用实验文件夹中的模板，平均直径测量值，并使用先前获得的校准将直径和长度从像素转换为毫米。计算横截面积为 π*直径 2/4 以 mm2 为单位，肌肉长度以 μm 为单位。</li>
</ol>4. 数据采集
<ol><li>肌肉平衡后，打开数据采集软件，选择 实验 |长度控制，然后在校准框中输入校准的小梁长度 （FL） 和横截面积（面积 [m 2]）。</li>
	<li>从模板文件夹（步骤 1.7）中，确保freeform_file.txt指向正确的文件夹，然后在文本编辑器中打开 freeform.dap 文件。在 *.dap 文件中将等渗级别（等值）设置为 32，000。</li>
	<li>在“长度控制”框中，选择“自由格式”选项卡并浏览到相应的“ 自由格式 ”列表文件。确保数据归档路径也是保存数据的正确文件夹。通过按 Run Experiment 开始从完全等距抽搐中获取数据，然后使用具有比例和积分增益参数的反馈控制获取负载钳位数据。</li>
	<li>通过在 *.dap 文件中定义后载荷（等值子）来获取负载钳位数据，并通过在文本编辑器中保存文件来迭代比例增益 （propgain） 和积分 （Ki） 参数的值。在数据采集软件界面中按 运行实验 。<ol><li>确保夹具包括在此迭代期间重新延长回其原始长度（有时称为松弛载荷5），以达到最大应变率范围，方法是将模式 （flswitch） 从 1 开始，并将结束载荷钳位的阈值（flthreshold）从零增加。</li>
	</ol></li>
	<li>通过将模式（flswitch）从1更改为零来控制负载钳位的末端。重复采集，同时将负载钳的末端从零重新延长更改为完全重新延长回起始长度。<ol><li>要增加长度，请逐渐增加结束负荷钳夹（flthreshold）的阈值，从零开始，直到肌肉几乎重新拉长到原来的长度。</li>
	</ol></li>
	<li>重置模式（flswitch = 1）和阈值（flthreshold = 0），然后运行一次最终数据采集。</li>
	<li>如果需要，通过重复步骤4.4-4.6来修改研究中的余载荷。此次收购可能会立即完成。</li>
	<li>如果需要，通过拉伸或缩短肌肉来改变预紧力，或者通过在 Tyrode 溶液中添加化合物来治疗肌肉。如果改变预载荷或添加化合物，请等待至少 20 分钟以确保慢力响应9，15 已稳定和/或化合物完全穿透肌肉。</li>
	<li>数据采集完成后，去除小梁。如果需要，冷冻或固定小梁以进行生化或组织学分析。</li>
	<li>清洁工作区域和实验系统，用水冲洗所有管道，并关闭所有组件。</li>
</ol>5. 数据分析
<ol><li>通过将程序定向到适当的文件路径，使用定量分析程序打开数据文件。</li>
	<li>通过确保数据分析程序分析钳位节拍，并且程序正确获取负载钳位的开始来量化松弛。<ol><li>确保确定负载钳的末端，以便根据等长松弛期间应力的峰值负导数量化松弛率（1/τ）。</li>
		<li>使用格兰茨方法16 来确定该指数时间常数，或其他适当的松弛量化（应力的最小导数，逻辑时间常数17或运动学模型18）。</li>
	</ol></li>
	<li>确保数据分析程序通过取应变的时间导数来计算应变率，其中应变计算为长度作为时间的函数除以最佳收缩处的长度。</li>
	<li>对给定条件的所有跟踪重复上述步骤。</li>
	<li>绘制松弛率和应变率之间的关系，将最大数据限制为小于 1 s-1 的生理应变率。排除低应变率下的数据（图4C），因为弛豫阶段可能无法反映指数衰减17，18。</li>
	<li>获取松弛率与应变率之间的直线斜率，并将斜率记录为MCR的指标。</li>
	<li>对询问的每个条件重复上述分析。</li>
</ol>

<ol>
	<li>Iribe, G., Helmes, M., Kohl, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Force-length+relations+in+isolated+intact+cardiomyocytes+subjected+to+dynamic+changes+in+mechanical+load.">Force-length relations in isolated intact cardiomyocytes subjected to dynamic changes in mechanical load.</a> American Journal of Physiology. Heart and Circulatory Physiology. 292 (3), 1487-1497 (2007).</li><li>Dowrick, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Work-loop+contractions+reveal+that+the+afterload-dependent+time+course+of+cardiac+Ca(2+)+transients+is+modulated+by+preload.">Work-loop contractions reveal that the afterload-dependent time course of cardiac Ca(2+) transients is modulated by preload.</a> Journal of Applied Physiology. 133 (3), 663-675 (2022).</li><li>ter Keurs, H. 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机械松弛控制（MCR）量化了心肌松弛率对肌肉进行松弛的拉伤率的依赖性8，9。应变率，而不是后载荷，对于改变松弛率是必要和充分的8。由于尚未证明改变钙率的干预措施可以显着改善心脏松弛，机械干预可能会为该机制提供新的见解，并为舒张功能障碍提供新的治疗方法。
此处描述的修改心肌应变率的方案使用等渗负荷钳8，9。等渗荷载钳的一个优点是对后荷应力的定量控制。类似Windkessel的方案可用于进一步探测后负荷，预负荷和心脏工作的变化2，6，7。不受负载钳控制的斜坡也可用于更好地隔离应变与应变率的变化。无论如何，后载荷本身似乎并不是松弛率8的强修正因素。
该方案也可以适应接近温度和起搏速率的更多生理条件。当前的协议详细信息用于显示MCR的存在。通常建议在生理条件下进行实验，具体取决于实验问题。然而，在37°C或高起搏速率下进行的实验可以更快地诱导肌肉的破败（损伤）。可能需要一种具有改进携氧能力的解决方案。此外，数据采集必须能够对长度和力进行采样，以足够快地解决快速抽搐并提供反馈控制。
目前的协议没有描述钙的测量或肌节长度的测量和控制。钙测量已在其他协议11中解决，而肌节长度测量可以使用适当的设备添加。肌节长度控制未在当前的MCR研究中使用，因为肌肉长度是与临床状况最相关的参数19。进一步的肌节长度控制（相对于肌肉长度控制）将为动力学问题提供具体答案，但由于肌节间变异和 对体内肌节长度变化的最低限度理解，不太可能增加转化知识。
这里强调了三个实验考虑因素，以提高数据的可重复性。
首先，在某些动物中可能很难发现独立的心脏小梁（未发表的结果和通讯）。虽然在大多数大鼠中可以找到抽搐的肌肉，但从大鼠小梁获取数据的合理成功率为三分之一。Brown Norway x Lewis F1大鼠的小梁成功率可能更高，这些大鼠在历史上也被使用过20 只，据报道有更多的小梁（未发表的通讯）。对于小鼠，成功率可能较低，BL / 6背景的小鼠预期成功率不到十分之一;然而，对于来自FVBN背景的小鼠（未发表的通信和观察），预计比率更高。
其次，肌肉损伤会降低输出。如果在 25 °C 和 0.5 Hz 起搏时产生的力小于 10 mN mm-2，研究人员可能需要进行故障排除，以评估金属镊子和肌肉之间是否发生了无意拉伸或接触，是否未正确制备溶液，或者起搏或实验设备是否正常运行。其他使用完整小梁的方案建议使用鲁尔锁注射器作为转移容器11。虽然这是可能的，特别是如果用户控制非常慢的流速或较小的肌肉节段，但目前的协议使用更大口径的转移移液器来最大限度地减少可能的损害。可能发生缺血性损伤的另一个步骤是在解剖过程中。应在第一次腹部切口（大鼠）或颈椎脱位（小鼠）后3分钟内插管并用灌注溶液冲洗主动脉，类似于心肌细胞分离方案中列出的限制21，22。这最大限度地减少了心脏组织不暴露于心肌麻痹样灌注溶液的时间。此外，持续超过30分钟的解剖通常不会产生抽搐的小梁。因此，操作人员应进行快速但仔细的解剖，以尽量减少损坏。横截面积大于0.2mm 2（2×10-7m 2）可能遭受核心缺血20。
第三，应考虑肌肉连接到电机和力传感器的方式。该协议目前侧重于钩子和独立小梁。如果固定不当，放松前拉伸的有时快速拉伤率会导致肌肉滑动，这就是为什么目前的协议不使用“篮子”来固定小梁23，24。还可以考虑和验证替代安装方法（粘合剂、夹子等25、26）。这里描述的方案利用小梁而不是肌。肌的腱索诱导一系列弹性，可以抑制MCR9的变化。然而，附件在肌肉中的确切位置不太可能影响测量，因为小梁长度（和直径）差异很大。
用钩子刺穿肌肉末端的一个限制是安装点本身也可能损坏。频繁收缩（取决于其强度）可能撕裂附着的肌肉组织可能会改变长度或系列弹性。这种撕裂速度很难控制。同样，在拉伸过程中，组织和钩子的损伤会加剧，也可能导致问题。应使用目视检查和剩余平衡等距力的 >80% 的显力值来评估制剂是否损坏并应排除。
另一个限制或考虑因素会影响该方法可以回答哪些实验问题。例如，考虑在灌注溶液中使用2，3-丁二酮一肟（BDM）。BDM是一种磷酸酶，可能会改变肌肉的功能。此外，长时间的卸载和缺乏起搏意味着潜伏磷酸化状态可能已经改变。因此，如果试图直接评估动物的肌肉收缩力（相对于基因型或治疗之间的差异），应谨慎使用，因为收缩状态可能已经改变。然而，磷酸化的影响可以通过添加该途径的激动剂或拮抗剂来评估药理学。
总之，MCR提供了关于肌肉运动（应变率）如何调节放松的见解。MCR 可能有助于更好地了解舒张期疾病的诊断和监测，以及药物干预的目标，例如改变肌球蛋白动力学。这里概述的方案和建议列出了经过几年试验发展的知识，应该适用于心脏病的其他系统和模型。

几乎所有形式的心力衰竭（包括射血分数降低的心力衰竭）和许多心血管疾病的心脏松弛都会受损。除了评估透化肌肉心脏功能的众多方法外，完整心肌的评估也越来越受到关注。评估这些组织卸载（末端自由收缩）或加载（长度或力控制）。从历史上看，完整的分离肌细胞已经在卸载条件下进行评估，其中细胞体在收缩过程中可以自由缩短。完整的心脏小梁通常在等长条件下进行评估，其中长度不允许改变，但会产生应力（每个横截面积的力）。完整肌细胞和小梁方法都开始随着负荷1，2的修饰而收敛。
几十年来，已经开发了用于肌肉负荷钳夹的协议（即，将肌肉产生的压力控制在模拟生理后负荷的特定值）3，4，5。在完整的心脏组织中，负荷钳使研究人员能够使用等渗或Windkessel样后负荷6，7，8，9更紧密地模拟体内心动周期。该协议的目标是获得用于量化MCR（即松弛率的应变速率依赖性）的数据8，9。
虽然MCR方案已经改编自以前的工作，但该协议的重点（与使用完整心脏组织的类似方案相比）是改变松弛的生物力学机制。有几种协议使用负载钳位3，4，5，7，10 和专注于 Windkessel 模型1、2、11 的协议，但该协议具体描述了松弛前的拉伸如何改变松弛速率。我们已经证明，这种控制发生在原舒张期8，这一阶段最初由Wiggers12描述。在正常健康的心脏中，心肌在主动脉瓣闭合前（即等容松弛之前）的射血过程中经历延长应变13。这是通过延长后负荷控制的持续时间直到肌肉开始伸展来模拟的。临床证据表明，这种延长在疾病状态下可能会减弱或消失14，并且收缩末期劳损率改变的含义和机制尚未完全阐明。鉴于射血分数保留的舒张期疾病和心力衰竭的治疗选择很少，我们认为MCR可能提供对松弛受损的新机制的见解。
虽然这里描述的大体解剖侧重于啮齿动物，但可以从任何完整的心脏中进行小梁分离，并且以前已用于人类心脏小梁8。类似地，该数据采集和分析也可以应用于心肌细胞或其它孤立的肌肉类型1，10。讨论包括对该方法可能的改变和调整的评论，以及局限性，例如由于脊索9的机械特性而谨慎使用肌。

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>18 or 16 gauge blunted needle/canula</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>for cannulation of rat aorta, use 1mm of PE160 or PE205 tubing as stop</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2,3-Butanedione Monoxime</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>B0753-25G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>23 gauge blunted needle/canula</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>for cannulation of mouse aorta, use 1mm of PE50 tubing as stop</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5 mL syringe</td>
			<td>BD Luer-Lock</td>
			<td>309646</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>95% Oxygen/5% CO2</td>
			<td>AirGas</td>
			<td>Z02OX9522000043</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anethesia system</td>
			<td>EZ Systems</td>
			<td>EZ-SA800</td>
			<td>Can use any appropriate anethesia method/system</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine Serum Albumin</td>
			<td>Fisher BioReagents</td>
			<td>BP-1600</td>
			<td>to coat tips of fine forcepts, scissors</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Calcium Chloride Dihydrate</td>
			<td>Fisher Chemical</td>
			<td>C79-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Containers/dissection dishes</td>
			<td>FisherBrand</td>
			<td>08-732-113</td>
			<td>Weigh dishes for creating dissection plates</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Crile Hemostat</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>13005-14</td>
			<td>for mouse gross dissection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D-(+)-Glucose</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G8270-1KG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Data acquisition software</td>
			<td>SLControl</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Data acquisition system</td>
			<td>MicrostarLabs</td>
			<td>DAP5216a</td>
			<td>Can use any DAQ.&#160; This is a PCI based data acqusition for use with SLControl; must have a PC with a PCI slot</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Data analysis software</td>
			<td>Mathworks</td>
			<td>Matlab</td>
			<td>Custom Script</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dumont #3 Forceps</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>11231-30</td>
			<td>2x for cannulation of aorta</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dumont #5 Forceps</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>11254-20</td>
			<td>2x for trabecula isolation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Experimental system</td>
			<td>Aurora Scientific</td>
			<td>801C</td>
			<td>Can use any appropriate experimental chamber with force and length control</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fine Scissors, curved</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>14061-09</td>
			<td>for removal of heart</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gooseneck Piggyback Illuminator</td>
			<td>AmScope</td>
			<td>LED-6WA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>H3375-250G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Imaging software</td>
			<td>IrfanView</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Iris Forceps</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>15915</td>
			<td>for removal of heart</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isoflurane</td>
			<td>VetOne</td>
			<td>502017</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnesium Chloride Hexahydrate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>M2670-100G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnesium Sulfate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>M7506-500G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mayo Scissors</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>14110-15</td>
			<td>for rat gross dissection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Metzenbaum Scissors</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>14116-14</td>
			<td>for mouse gross dissection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope connected camera</td>
			<td>Flir</td>
			<td>BFS-U3-27S5M-C</td>
			<td>Includes acquisition software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope/digital imaging system</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>IX-73</td>
			<td>Can use any appropriate microscope.&#160; Needed to measure muscle length, cross sectional area</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mounting Pin/Needle</td>
			<td>BD PrecisionGlide</td>
			<td>305136</td>
			<td>For holding heart to dish.&#160; 27 G x 1-1/4</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mounting Pin/Needle</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>26000-40</td>
			<td>For holding heart to dish. 0.4mm diameter insect pin (Alt to 27G needle)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Oxygen (O2)</td>
			<td>AirGas</td>
			<td>OX USP300</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Peristaltic Pump</td>
			<td>Rainin</td>
			<td>Rabbit</td>
			<td>Can be any means to create flow in experimental chamber</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pH and Oxygen sensor</td>
			<td>Mettler Toledo</td>
			<td>SevenGo pH and DO</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium Bicarbonate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>237205-100G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium Chloride</td>
			<td>Fisher Chemical</td>
			<td>P217-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium Phosphate Monobasic</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>795488-500G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rochester-pean Hemostat</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>501708</td>
			<td>for rat gross dissection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Silk Suture, Size: 4/0</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>18020-40</td>
			<td>cut to ~1.5 inch pieces, soaked in water</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Bicarbonate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S6297-250G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Chloride</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S9888-1KG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Hydroxide</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S8045-500G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Phosphate Dibasic</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S7907-100G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stereomicroscope</td>
			<td>AmScope</td>
			<td>SM-1TX</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Student Vannas Spring Scissors&#160;</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>91500-09</td>
			<td>for opening of the RV</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SYLGARD 184 Silicone Elastomer Base</td>
			<td>Dow Corning</td>
			<td>3097358-1004</td>
			<td>For creating dissection plates</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringe Holder</td>
			<td>Harbor Frieght</td>
			<td>Helping Hands 60501</td>
			<td>Can be used as alternate for ring stand</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Taurine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T0625-1KG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Transfer Pipette</td>
			<td>FisherBrand</td>
			<td>13-711-7M</td>
			<td>cut ~1&#34; from tip to widen bore</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vannas Spring Scissors</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>15000-00</td>
			<td>for trabecula isolation</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

mechanical control of relaxation using intact cardiac trabeculae

舒张功能障碍是心血管疾病表现中的常见表型。除了心脏硬度升高（左心室舒张末期压升高）外，心脏松弛受损是舒张功能障碍的关键诊断指标。虽然松弛需要去除胞质钙和肉瘤细丝失活，但靶向这些机制尚未提供有效的治疗方法。机械机制，如血压（即后负荷），已被理论化以改变松弛。最近，我们发现，改变拉伸的应变率，而不是后负荷，对于改变心肌组织的后续松弛率既必要又足以。松弛的应变率依赖性，称为松弛机械控制（MCR），可以使用完整的心脏小梁进行评估。该协议描述了小动物模型，实验系统和腔室的制备，心脏的分离和随后的小梁的分离，实验室的制备以及实验和分析方案。完整心脏中拉伤延长的证据表明，MCR 可能为更好地表征药物治疗提供新的领域，以及评估完整肌肉中肌丝动力学的方法。因此，研究MCR可能会阐明治疗心力衰竭的新方法和新领域的途径。

代表性数据集如图 4所示，其他结果可以在先前的出版物8，9中找到。简而言之，应变率是根据应变的导数计算的，就在等长松弛之前。拉伤是长度与时间的函数除以最佳长度的肌肉长度。松弛率计算为 1/τ，其中 τ 是指数时间常数16。需要多个应变率及其产生的松弛率来确定松弛的机械控制（MCR）。这些数据绘制在松弛率与应变率的关系图上。线的斜率提供 MCR 指数。
请注意，收缩末期和舒张期劳损率不太可能超过 1 s-1。因此，斜率应仅包括应变速率< 1 s-1。低应变率下的松弛率可能会被应力的最小时间导数（dStress/dtmin）的变化所混淆，在这些情况下，小于约0.15 s-1 的拉伸数据可能会被忽略。
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64879/64879fig01.jpg"> 图1：大体解剖和心脏插管区域的设置。 从右到左：a。动物的麻醉诱导室位于解剖区附近。b.可选挥发性气体清除剂的通气管。c.解剖垫，动物将被仰卧放置，两侧是（顺时针）d.鼻锥，为啮齿动物提供持续麻醉，e.止血器，f.手术剪刀，g.弯曲的细剪刀放置以便于用优势（切割）手进入，H.弯曲虹膜钳放置以便于用非惯用手进入。啮齿动物的上肢可以用胶带固定在解剖垫上，i.附近应放置带有灌注溶液的解剖盘（或小烧杯）冲洗心脏。j.必须在附近放置一个分期插管的区域。带有适当套管的注射器安装在环架上。k. （插图）16 G 套管的近似图像，连接了 1 mm 的 PE205 管，缝合线松散打结。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64879/64879fig01large.jpg" target="_blank">请点击此处查看此图的大图。</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64879/64879fig02.jpg"> 图2：实验区和工具 。 （一）实验区。实验室和数据采集系统在附近的倒置显微镜（左）上制备。小梁隔离和安装发生在立体镜下（右）。（B）两个镊子，大小Vannas剪刀的尖端，以及一个定制的玻璃探针通过浸泡在10%BSA溶液中制备。（C） 其他解剖工具。有机硅弹性体镀盘允许在精细解剖过程中安装心脏。带有端切口的 7 mL 转移移液器显示在培养皿和玻璃探头下方。移液器的切割尖端被丢弃，并使用扩大的孔来转移肌肉，拉伸或脱水的风险最小。（D） 玻璃移液器末端的放大图像，长约2毫米，直径约0.25-0.5毫米。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64879/64879fig02large.jpg" target="_blank">请点击此处查看此图的大图。</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64879/64879fig03.jpg"> 图 3：解剖指南。 （A）大体解剖应从横向切口（1.绿色）开始，穿过皮肤进入木突下方的腹膜腔（下肋骨和木骨用灰色细线表示）。从腹膜腔到胸腔的矢状旁切口应遵循（2.蓝绿色和3.蓝线），之后应切开横膈膜。然后可以使用止血器夹紧木突并将胸壁抬高到头部。（B）将完整的大鼠心脏固定在硅弹性体培养皿上，以右心室流出道（RVOT），右心房（RA），主动脉（Ao）和左心房（LA）为方向。第一组切口应从RVOT沿隔膜（1.黄线）。第二组切口应从RVOT沿心脏底部开始，然后穿过右心房（2.橙线）。（C）可以小心地将RVOT从主动脉拉开以打开心脏并将其固定回去。黄色和橙色线对应于 B 中描述的切口。独立小梁通常位于右心室游离壁底部附近和隔膜附近，但也可能发生在任何地方（红线表示常见位置）。（D）小梁下玻璃探针的放大视图（黄色箭头表示小梁和探针的交点）。（E）小梁（红色箭头）安装在力传感器（左）和电机（中右）之间的实验系统上，两侧是两个起搏导线（小梁上方和下方的水平）。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64879/64879fig03large.jpg" target="_blank">请点击此处查看此图的大图。</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64879/64879fig04.jpg"> 图 4：代表性迹线和结果 。 （A） 使用鹅颈管 LED 灯以与显微镜镜头轴线陡峭 （~75°） 的角度照射单个心脏小梁，这增强了小梁的对比度。在此示例中，两个图像平铺以显示小梁的整个长度。（B）同一小梁的应力时间（顶部）和应变时间（底部）曲线。图中显示了等长抽搐，以及收缩末期应变率增加时的三个负荷钳夹抽搐。（三）具有代表性的MCR计算。MCR 定义为松弛速率和应变速率之间的直线斜率。如讨论中所述，可以限制应变率以提供定量的、可重复的MCR。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64879/64879fig04large.jpg" target="_blank">请点击此处查看此图的大图。</a>
表 1：解决方案。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64879/64879_Table1.xlsx" target="_blank">请按此下载此表格。</a>

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Mechanical Control of Relaxation Using Intact Cardiac Trabeculae

快速的心肌和心脏松弛对于正常的生理学至关重要。现在已知机械松弛机制取决于应变率。该协议提供了实验的获取和分析的概述，以进一步研究松弛的机械控制。

使用完整的心脏小梁机械控制松弛

Diastolic dysfunction is a common phenotype across cardiovascular disease presentations. In addition to elevated cardiac stiffness (elevated left ...

该协议描述了一种测量心小梁中松弛的机械控制或肌肉松弛的应变依赖性的方法。这种技术的主要优点是它专注于心脏松弛。鉴于缺乏舒张期疾病的治疗选择，该技术可用于识别与心脏松弛相关的新指标和药物靶点。这种方法将在啮齿动物心脏上显示，但它可用于任何完整的肌肉。演示这个程序的将是我和我实验室的本科生研究助理Anita Abbo。首先，从套管中取出粗略解剖的小动物模型的心脏，并将其放入硅胶弹性体涂层的称重盘中，为小梁隔离做准备。然后将心脏放在体视显微镜下照亮。定位右心室流出道后，将左心房和心室顶端固定在培养皿中的硅胶弹性体上。使用长Vannas剪刀，沿隔从右心室流出道切到顶点。接下来，从右心室流出道切到主动脉附近的右心房，然后切开右心房。使用镊子，小心地从流出道拉开右心室游离壁，不要拉伸组织。如果发现白色细结缔组织链，可以切割，但不能切割较大的粉红色组织链，因为它们可能是小梁。将右心室三角形的自由壁固定在培养皿上，露出右心室。使用薄的钝端熔化玻璃移液管，在不施加压力的情况下搜索暴露的心内膜是否有独立的小梁。避免使用三角形肌，选择平行侧的小梁，这些小梁通常位于右心室游离壁底部附近和沿隔膜。使用小Vannas剪刀解剖小梁，在小梁的每一端留下一毫米立方的组织以允许附着。接下来，从七毫升移液管的末端切下约两英寸，慢慢将小梁吸入移液器中，然后将其转移到新的称重盘中，其中包含50%灌注溶液和50%改良的Tyrode溶液。让肌肉平衡到混合溶液中细胞外钙的增加几分钟。关闭向实验室提供超流或抽吸的泵。使用大口径转移移液器，将小梁移动到充满Tyrode溶液的实验室中。将小梁末端的一块立方组织固定在力传感器上的钩子上，然后将第二个立方体固定到电机上。重新启动超级融合并开始起搏肌肉以确定阈值电压。以高于阈值电压 20% 的速度行驶约 1 小时。在这个平衡期结束时，使用连接到电机的千分尺慢慢拉伸肌肉，直到通过观察产生的张力达到最佳应力生成。当被动舒张张力上升速度快于峰值张力时，停止增加肌肉长度，表明已通过最佳长度。关闭透射显微镜照明，并使用鹅颈照明器以陡峭的角度照亮小梁。使用通过显微镜光学元件连接的先前校准的相机，将舒张期间的小梁图像捕获到实验文件夹中。平均直径测量值，并使用先前获得的校准将直径和长度从像素转换为毫米。以微米为单位计算横截面积和肌肉长度。在数据采集软件中，通过在dap文件中定义后载荷来获取负载钳位数据，并通过在文本编辑器中保存文件来迭代比例增益和积分参数的值，然后在界面中按“运行实验”。通过改变模式来控制负载钳的末端。重复采集，同时将负载钳的末端从零更改为完成，重新延长回起始长度。要增加长度，请逐渐增加结束负荷钳的阈值，从零开始，直到肌肉几乎重新延长到其原始长度。如果需要，修改后载荷并立即重复采集。如果需要，通过拉伸或缩短肌肉来改变预紧力，或者通过在 Tyrode 溶液中添加化合物来治疗肌肉，但至少等待 20 分钟以确保缓慢的力反应稳定并让化合物完全穿透肌肉。数据采集完成后，去除小梁并清洁实验系统。通过确保数据分析程序分析钳位节拍，并且程序正确获取负载钳位的开始来量化松弛。在量化给定条件的所有迹线后，绘制松弛率和应变率之间的关系，将最大数据限制为每秒小于 1 的生理应变率。排除低应变率下的数据，因为弛豫阶段可能无法反映指数衰减。得到松弛率与应变率之间的直线斜率，并将斜率记录为松弛机械控制的指标。此处显示了使用鹅颈管LED灯以与显微镜镜头轴线成75度的陡峭角度照亮的单个心脏小梁。同一小梁的应力时间和应变时间曲线在收缩期应变率增加时显示等长抽搐和3个负荷钳夹抽搐。应变率是根据等距松弛之前应变的导数计算得出的。数据绘制在松弛率与应变率图上，其中线的斜率提供了松弛的机械控制或MCR指数。该方案中最困难的组成部分是仔细分离心小梁。该方案可以与其他肌肉测量相结合，包括细胞内钙、收缩力和肌节长度。此外，该方法正用于识别分子机制并更好地了解心脏松弛受损的病理生理学。

Research

JoVE Journal

Medicine

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