Name: mechanical control of relaxation using intact cardiac trabeculae
Uploaded: 2023-02-17T13:35:00
Duration: 7 min 51 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Mechanical Control of Relaxation Using Intact Cardiac Trabeculae at JoVE.com

Dette arbejde støttes af National Institutes of Health (1R01HL151738) og American Heart Association (18TPA34170169).

Følgende protokol er blevet godkendt af Institutional Animal Care and Use Committee of Wayne State University. Protokollen beskriver her trin til udnyttelse af gnaverforsøgspersoner, men kan tilpasses til brug i andre modelorganismer.
1. Forberedelse
<ol><li>Få det eksperimentelle emne og lad det akklimatisere sig til laboratoriet.</li>
	<li>Der fremstilles 250 ml perfusionsopløsning og 250 ml modificeret tyrodopløsning (tabel 1) ved iltning til hver til 10-20 ppmO2 med pH 7,3.</li>
	<li>Forbered en 5 ml sprøjte med en kanyle fastgjort. Fyld sprøjten med perfusionsopløsning. Brug kanyler, der er henholdsvis 23 G til en mus og 18 eller 16 G til henholdsvis en lille eller stor rotte. Skub en 1 mm længde polyethylen (PE) slange på enden af en stump nål (materialetabel) for at forhindre aorta i at glide af kanylen efter at være bundet.</li>
	<li>Komplet forberedelse af dissektions- og kanyleringsområdet (figur 1)<ol><li>Fyld to rene vejebåde mindst halvvejs med perfusionsopløsning. Nedsænk spidsen af kanylen i perfusionsopløsning med mindst en dobbeltsløjfet sutur placeret omkring kanylen. Hold sprøjten på plads med en stangklemme.</li>
		<li>Placer kirurgisk saks, en hæmostat, iristang, en lille buet saks og to # 3 tang for nem adgang.</li>
	</ol></li>
	<li>Forbered det eksperimentelle system (figur 2) ved at prime og cirkulere den modificerede Tyrodes opløsning gennem hele forsøgssystemet. Sørg for, at kammeret er helt fyldt og stabilt.</li>
	<li>Tænd for alle dataindsamlingsbokse, herunder krafttransduceren, længdemotoren, pacingsystemet, temperaturstyringssystemet og dataindsamlingscomputeren.</li>
	<li>Kopiér og omdøb en skabelonmappe, der indeholder de nødvendige *.dap- og markørfiler for at referere til det aktuelle eksperiment. Åbn dataindsamlingssoftwaren.</li>
	<li>Forbered trabecula isolationsværktøjerne (Vannas saks, #5 eller #55 tang, glassonde) ved at nedsænke deres spidser i 10% (w / v) bovin serumalbumin (BSA) i ultrarent vand eller perfusionsopløsning for at belægge metallet med protein (figur 2B). BEMÆRK: Hele forsøgssystemet skal forberedes før dissektion.</li>
</ol>2. Grov dissektion og kanylering
<ol><li>Registrer identifikation, kropsvægt og andre relevante oplysninger om dyret.</li>
	<li>Eventuelt injiceres 1.000 E / kg heparin i sterilt saltvand til gnaveren via intraperitoneal injektion mindst 10 minutter før eutanasi for at minimere risikoen for koagulation før koronar perfusion.</li>
	<li>Anbring dyret i et induktionskammer og inducer generel anæstesi ved hjælp af 3% -5% isofluran fordampet i 100% ilt i henhold til standardproceduren. BEMÆRK: Tænd for eksterne rensere, nedtræksborde eller stinkskabe, der bruges til at minimere eksponering for isofluran.</li>
	<li>Når gnaveren mister sin oprettende refleks, og vejrtrækningen er bremset:<ol><li>(For en rotte) fjern dyret fra induktionskammeret og læg det liggende på en dissektionspude med fortsat anæstesi gennem en næsekegle.</li>
		<li>(For en mus) udfør cervikal dislokation umiddelbart efter fjernelse af dyret fra induktionskammeret. Næsekeglen er ikke nødvendig. Drej isofluranfordamperen til 0%.</li>
	</ol></li>
	<li>Fastgør om nødvendigt gnaverens øvre lemmer til dissektionspuden væk fra brystvæggen ved hjælp af tape understøttet af stifter, og pas på ikke at gennembore dyret. Kontroller for korrekt anæstesidybde (manglende tåklemmerespons), inden du fortsætter til dissektionen.</li>
	<li>Ved hjælp af kirurgisk saks (Mayo til rotter, Metzenbaum til mus), lige under xyphoid-processen, skær huden på tværs over den fulde bredde af gnaverens mave ind i peritonealrummet.</li>
	<li>Brug kirurgisk saks til at lave to lodrette snit parasagittal (op ad siderne af brystvæggen) på både venstre og højre side af brystvæggen fra det tværgående snit. Skær derefter over membranen, forbinder parasagittale nedskæringer og frigør thoraxrummet.</li>
	<li>Klem og løft xyphoid-processen ved hjælp af en hemostat mod gnaverens hoved for at flytte brystbenet og brystvæggen op mod gnaverens hoved og udsætte brystrummet og hjertet. Hvis det er nødvendigt, skal du hurtigt udvide parasagittale nedskæringer til nær det andet hvirvelrum for fuldt ud at udsætte hjertet og / eller bryde perikardiemembranen.</li>
	<li>Brug buede iristang til forsigtigt at løfte hjertet for at visualisere de store kar. Placer tangen mellem myokardiet og gnaverens rygsøjle, klem ned på de større kar og løft hjertet, pas på ikke at klemme atrierne eller ventrikulære segmenter.<ol><li>Mens du løfter hjertet lidt, skal du hurtigt placere den buede irissaks (konkav op) mellem den buede irispincet og gnaverens rygsøjle og skære de store kar og lunger væk fra hjertet. Flyt hurtigt hjertet ind i en vejebåd eller et bægerglas, der indeholder frisk perfusionsopløsning, og ryst for at hjælpe med at fjerne blod fra hjertet.</li>
	</ol></li>
	<li>Drej isofluranfordamperen til 0%, hvis det ikke allerede er gjort. Hvis store segmenter af lunge, perikardial eller andet væv forbliver fastgjort til hjertet, skal du forsigtigt skære væk og kassere dem på dette tidspunkt for at minimere interferens med kanyleringen.</li>
	<li>Brug den buede iristang til at flytte hjertet ind i en ren vejebåd eller bægerglas med den forberedte kanyle nedsænket. Cannulate aorta, fastgør aorta ved at stramme den sløjfede silkesutur og skyl med op til 5 ml perfusionsopløsning.</li>
	<li>Fjern hjertet fra kanylen og læg det i en silikone elastomerbelagt vejeskål for at forberede sig på trabecula-isolering.</li>
</ol>3. Isolering og ligevægt af trabecula
<ol><li>Placer hjertet i silikone elastomerbelagt skål under et stereomikroskop og lys det.</li>
	<li>Find den højre ventrikulære udstrømningskanal. Fastgør venstre atrium og ventrikulær spids til silikoneelastomeren i skålen.</li>
	<li>Brug lang Vannas saks til at skære fra højre ventrikulære udstrømningskanal til toppen langs septumet. Skær fra højre ventrikulære udstrømningskanal til højre atrium nær aorta, og skær derefter gennem højre atrium (figur 3B).</li>
	<li>Brug tang til forsigtigt at trække den højre ventrikulære (RV) frie væg fra udstrømningskanalen, og pas på ikke at strække vævet. BEMÆRK: Eksperimenter kan finde tynde, hvide bindevævsstrenge, som kan skæres uden bekymring. Større, lyserøde (væv) farvede tråde bør evalueres med omhu, da de kan være trabeculae, der kan isoleres.</li>
	<li>Fastgør den frie væg i højre ventrikeltrekant til skålen for at udsætte højre ventrikel (figur 3C).</li>
	<li>Brug en glaspipette, der er smeltet og formet med en tynd (<500 μm diameter), men ikke skarp ende, til at søge efter fritstående trabeculae i det eksponerede endokardium (figur 3C). BEMÆRK: En fritstående trabecula er en stribe muskler, som man fuldt ud kan sonde under. Brug trabeculae, der har parallelle sider (konstant bredde), undgå trekantede papillære muskler. Vær forsigtig under denne proces og efterfølgende dissektion, da påføring af belastning på trabecula kan forårsage skade, hvilket reducerer den udviklede kraft.</li>
	<li>Disseker trabecula ved hjælp af en lille Vannas saks. Der efterlades et stykke væv i tern på ≥1 mm i hver ende af trabecula for at muliggøre fastgørelse. Stræk ikke trabeculaen, hvor det er muligt, og minimer kontakt med metalværktøj, da begge også kan forårsage skade på musklen. Flyt stifterne, der holder hjertet efter behov for at minimere belastningen på musklen nær de identificerede trabeculae.</li>
	<li>Skær ~2 tommer af enden af en 7 ml overførselspipette, træk langsomt trabecula ind i pipetten, og overfør den til en ny vejeskål, der indeholder 50% perfusionsopløsning og 50% modificeret Tyrodes opløsning. Lad musklen ekvilibrere til stigningen i ekstracellulært calcium i den blandede opløsning i flere minutter.<ol><li>Gentag trin 3.7-3.8 for at dissekere yderligere trabecula på dette tidspunkt for at få yderligere trabecula som backup.</li>
	</ol></li>
	<li>Sluk for pumpen, der tilfører superfusion og/eller sug til forsøgskammeret. Brug den store boreoverførselspipette til at flytte trabecula ind i forsøgskammeret fyldt med Tyrodes opløsning.</li>
	<li>Fastgør et >1 mm terningstykke væv for enden af trabecula til en krog på krafttransduceren, og fastgør derefter den anden terning til motoren. BEMÆRK: Adskil motor- og krafttransduceren, når du monterer den første side for bedre adgang til transduceren, og flyt derefter krogene så tæt sammen som muligt, når du monterer den anden terning af væv, mens trabecula forbliver slap.</li>
	<li>Genstart superfusion og begynd at pacing musklen for at bestemme tærskelspændingen. Tempo ved 20% over tærskelspændingen i ca. 1 time for at tillade trabecula at ekvilibrere.</li>
	<li>Ved afslutningen af denne ligevægtsperiode skal du langsomt strække musklen ved hjælp af mikrometeret, der er forbundet med motoren, indtil optimal udviklet stressgenerering opnås ved at observere den udviklede (minimum til peak) spænding. Stop med at øge muskellængden, når den passive diastoliske spænding stiger hurtigere end topspændingen, hvilket indikerer, at den optimale længde er passeret.</li>
	<li>Sluk for den transmitterede mikroskopbelysning, og belys trabecula ved hjælp af en svanehalsbelysning i en stejl vinkel. Brug et kamera, der er tilsluttet via mikroskopoptikken, der tidligere er kalibreret, til at tage et billede af trabecula under diastol i den eksperimentelle mappe. Hvis trabecula er bredere end kameraets synsfelt, skal du tage flere billeder på tværs af musklen.</li>
	<li>Åbn billedet/billederne i en billedbehandlingssoftware, der rapporterer pixelafstande.<ol><li>Mål pixelafstanden for muskeldiameteren fire gange langs dens længde. Mål muskellængden (trabecula) i pixels, eksklusive den store terning af væv.</li>
		<li>Hvis muskellængden er længere end synsfeltet, skal du bruge referencepunkter langs musklen til at måle hele længden.</li>
	</ol></li>
	<li>Brug skabelonen i eksperimentmappen til at beregne gennemsnittet af diametermålene og konvertere diameteren og længderne fra pixel til mm ved hjælp af en tidligere opnået kalibrering. Beregn tværsnitsarealet som π*diameter 2/4 i mm2 og muskellængden i μm.</li>
</ol>4. Dataindsamling
<ol><li>Når musklen er ekvilibreret, skal du åbne dataindsamlingssoftwaren, vælge Eksperimenter | Længdekontrol, og angiv den kalibrerede trabeculalængde (FL) og tværsnitsarealet (område [m2]) i feltet Kalibrering.</li>
	<li>Fra skabelonmappen (trin 1.7) skal du sikre dig, at freeform_file.txt peger på den korrekte mappe, og åbne filen freeform.dap i et tekstredigeringsprogram. Indstil det isotoniske niveau (isoton) til 32.000 i filen *.dap.</li>
	<li>I feltet Længdekontrol skal du vælge fanen Kombinationstegning og gå til den relevante Kombinationslistefil. Sørg for, at stien til dataarkivering også er den korrekte mappe til lagring af data. Begynd at hente data fra fuldt isometriske trækninger ved at trykke på Kør eksperimentt, før du henter belastningsklemmedata ved hjælp af en feedbackkontrol med proportionale parametre og integrationsforstærkningsparametre.</li>
	<li>Hent belastningsfastspændte data ved at definere efterbelastningen (isoton) i *.dap-filen, og gentag værdier for proportional forstærkning (propgain) og integration (Ki) parametre ved at gemme filen i teksteditoren. Tryk på Kør eksperiment i grænsefladen til dataindsamlingssoftware.<ol><li>Sørg for, at klemmen inkluderer forlængelse tilbage til sin oprindelige længde (undertiden benævnt afslapningsbelastning5) under denne iteration for at opnå det maksimale interval for belastningshastigheder ved at indstille tilstand (flswitch) fra en og øge tærsklen for afslutning af belastningsklemmen (flthreshold) fra nul.</li>
	</ol></li>
	<li>Kontroller enden af lastklemmen ved at ændre tilstanden (flswitch) fra en til nul. Gentag anskaffelsen, mens du ændrer enden af lastklemmen fra nul forlængelse til fuldstændig forlængelse tilbage til startlængden.<ol><li>For at øge længden skal du gradvist øge tærsklen for afslutning af belastningsklemmen (flthreshold) fra nul, indtil musklen næsten forlænges tilbage til sin oprindelige længde.</li>
	</ol></li>
	<li>Nulstil tilstanden (flswitch = 1) og tærsklen (flthreshold = 0), og kør en endelig dataindsamling.</li>
	<li>Hvis det ønskes, ændres efterbelastningen i undersøgelsen ved at gentage trin 4.4-4.6. Denne erhvervelse kan ske straks.</li>
	<li>Hvis det ønskes, skal du ændre forspændingen ved at strække eller forkorte musklen eller behandle musklen ved at tilføje forbindelser til tyrodens opløsning. Hvis du ændrer forspændingen eller tilføjer forbindelser, skal du vente mindst 20 minutter for at sikre, at slow-force-responsen 9,15 er stabiliseret, og/eller for at forbindelsen trænger helt ind i musklen.</li>
	<li>Når dataindsamlingen er afsluttet, skal du fjerne trabeculaen. Hvis det er nødvendigt, fryses eller fastgøres trabecula til biokemisk eller histologisk analyse.</li>
	<li>Rengør arbejdsområderne og forsøgssystemet, skyl alle slanger med vand, og sluk for alle komponenter.</li>
</ol>5. Analyse af data
<ol><li>Åbn datafilerne ved hjælp af et kvantitativt analyseprogram ved at dirigere programmet til den relevante filsti.</li>
	<li>Kvantificer afslapning ved at sikre, at dataanalyseprogrammet analyserer den fastspændte rytme, og at programmet korrekt erhverver starten af belastningsklemmen.<ol><li>Sørg for, at enden af belastningsklemmen identificeres, således at afslapningshastigheden (1/τ) kvantificeres ud fra den maksimale negative afledning af spænding under en isometrisk afslapning.</li>
		<li>Brug Glantz-metoden16 til at bestemme denne eksponentielle tidskonstant eller anden passende kvantificering af afslapning (minimum derivat af stress, logistisk tidskonstant17 eller kinematisk model18).</li>
	</ol></li>
	<li>Sørg for, at dataanalyseprogrammet beregner belastningshastigheden ved at tage tidsderivatet af stammen, hvor belastningen beregnes som længden som funktion af tiden divideret med længden ved optimal sammentrækning.</li>
	<li>Gentag ovenstående trin for alle spor af en given tilstand.</li>
	<li>Plot forholdet mellem afslapningshastigheden og belastningshastigheden, og begræns de maksimale data til en fysiologisk belastningshastighed på mindre end 1 s-1. Udelad data ved lave belastningshastigheder (figur 4C), da afslapningsfasen muligvis ikke afspejler det eksponentielle henfald17,18.</li>
	<li>Få hældningen på linjen mellem afslapningshastigheden og belastningshastigheden, og registrer hældningen som indekset for MCR.</li>
	<li>Gentag ovenstående analyse for hver tilstand, der spørges.</li>
</ol>

<ol>
	<li>Iribe, G., Helmes, M., Kohl, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Force-length+relations+in+isolated+intact+cardiomyocytes+subjected+to+dynamic+changes+in+mechanical+load.">Force-length relations in isolated intact cardiomyocytes subjected to dynamic changes in mechanical load.</a> American Journal of Physiology. Heart and Circulatory Physiology. 292 (3), 1487-1497 (2007).</li><li>Dowrick, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Work-loop+contractions+reveal+that+the+afterload-dependent+time+course+of+cardiac+Ca(2+)+transients+is+modulated+by+preload.">Work-loop contractions reveal that the afterload-dependent time course of cardiac Ca(2+) transients is modulated by preload.</a> Journal of Applied Physiology. 133 (3), 663-675 (2022).</li><li>ter Keurs, H. E., Rijnsburger, W. H., van Heuningen, R., Nagelsmit, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tension+development+and+sarcomere+length+in+rat+cardiac+trabeculae.+Evidence+of+length-dependent+activation.">Tension development and sarcomere length in rat cardiac trabeculae. Evidence of length-dependent activation.</a> Circulation Research. 46 (5), 703-714 (1980).</li><li>Sonnenblick, E. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Force-velocity+relations+in+mammalian+heart+muscle.">Force-velocity relations in mammalian heart muscle.</a> The American Journal of Physiology. 202, 931-939 (1962).</li><li>Brutsaert, D. L., Rademakers, F. E., Sys, S. U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Triple+control+of+relaxation:+implications+in+cardiac+disease.">Triple control of relaxation: implications in cardiac disease.</a> Circulation. 69 (1), 190-196 (1984).</li><li>Taberner, A. J., Han, J. C., Loiselle, D. S., Nielsen, P. M. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+innovative+work-loop+calorimeter+for+in+vitro+measurement+of+the+mechanics+and+energetics+of+working+cardiac+trabeculae.">An innovative work-loop calorimeter for in vitro measurement of the mechanics and energetics of working cardiac trabeculae.</a> Journal of Applied Physiology. 111 (6), 1798-1803 (2011).</li><li>De Tombe, P. P., Little, W. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inotropic+effects+of+ejection+are+myocardial+properties.">Inotropic effects of ejection are myocardial properties.</a> Am J Physiol. 266, 1202-1213 (1994).</li><li>Chung, C. S., Hoopes, C. W., Campbell, K. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Myocardial+relaxation+is+accelerated+by+fast+stretch,+not+reduced+afterload.">Myocardial relaxation is accelerated by fast stretch, not reduced afterload.</a> Journal of Molecular and Cellular Cardiology. 103, 65-73 (2017).</li><li>Schick, B. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reduced+preload+increases+Mechanical+Control+(strain-rate+dependence)+of+Relaxation+by+modifying+myosin+kinetics.">Reduced preload increases Mechanical Control (strain-rate dependence) of Relaxation by modifying myosin kinetics.</a> Archives of Biochemistry and Biophysics. 707, 108909 (2021).</li><li>Parikh, S. S., Zou, S. Z., Tung, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Contraction+and+relaxation+of+isolated+cardiac+myocytes+of+the+frog+under+varying+mechanical+loads.">Contraction and relaxation of isolated cardiac myocytes of the frog under varying mechanical loads.</a> Circulation Research. 72 (2), 297-311 (1993).</li><li>Dowrick, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Simultaneous+brightfield,+fluorescence,+and+optical+coherence+tomographic+imaging+of+contracting+cardiac+trabeculae+ex+vivo.">Simultaneous brightfield, fluorescence, and optical coherence tomographic imaging of contracting cardiac trabeculae ex vivo.</a> Journal of Visualized Experiments. (176), e62799 (2021).</li><li>Wiggers, C. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Studies+on+the+consecutive+phases+of+the+cardiac+cycle+I.+The+duration+of+the+consecutive+phases+of+the+cardiac+cycle+and+the+criteria+for+their+precise+determination.">Studies on the consecutive phases of the cardiac cycle I. The duration of the consecutive phases of the cardiac cycle and the criteria for their precise determination.</a> American Journal of Physiology-Legacy Content. 56 (3), 415-438 (1921).</li><li>Rosen, B. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Late+systolic+onset+of+regional+LV+relaxation+demonstrated+in+three-dimensional+space+by+MRI+tissue+tagging.">Late systolic onset of regional LV relaxation demonstrated in three-dimensional space by MRI tissue tagging.</a> American Journal of Physiology. Heart and Circulatory Physiology. 287 (4), 1740-1746 (2004).</li><li>Saito, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+differences+in+left+ventricular+torsional+behavior+between+patients+with+hypertrophic+cardiomyopathy+and+hypertensive+heart+disease.">The differences in left ventricular torsional behavior between patients with hypertrophic cardiomyopathy and hypertensive heart disease.</a> International Journal of Cardiology. 150 (3), 301-306 (2011).</li><li>Monasky, M. M., Biesiadecki, B. J., Janssen, P. M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Increased+phosphorylation+of+tropomyosin,+troponin+I,+and+myosin+light+chain-2+after+stretch+in+rabbit+ventricular+myocardium+under+physiological+conditions.">Increased phosphorylation of tropomyosin, troponin I, and myosin light chain-2 after stretch in rabbit ventricular myocardium under physiological conditions.</a> Journal of Molecular and Cellular Cardiology. 48 (5), 1023-1028 (2010).</li><li>Raff, G. L., Glantz, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Volume+loading+slows+left+ventricular+isovolumic+relaxation+rate.+Evidence+of+load-dependent+relaxation+in+the+intact+dog+heart.">Volume loading slows left ventricular isovolumic relaxation rate. Evidence of load-dependent relaxation in the intact dog heart.</a> Circulation Research. 48, 813-824 (1981).</li><li>Matsubara, H., Takaki, M., Yasuhara, S., Araki, J., Suga, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Logistic+time+constant+of+isovolumic+relaxation+pressure-time+curve+in+the+canine+left+ventricle.+Better+alternative+to+exponential+time+constant.">Logistic time constant of isovolumic relaxation pressure-time curve in the canine left ventricle. Better alternative to exponential time constant.</a> Circulation. 92 (8), 2318-2326 (1995).</li><li>Chung, C. S., Kovacs, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Physical+determinants+of+left+ventricular+isovolumic+pressure+decline:+model+prediction+with+in+vivo+validation.">Physical determinants of left ventricular isovolumic pressure decline: model prediction with in vivo validation.</a> American Journal of Physiology. Heart and Circulatory Physiology. 294 (4), 1589-1596 (2008).</li><li>Campbell, K. B., Kirkpatrick, R. D., Tobias, A. H., Taheri, H., Shroff, S. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Series+coupled+non-contractile+elements+are+functionally+unimportant+in+the+isolated+heart.">Series coupled non-contractile elements are functionally unimportant in the isolated heart.</a> Cardiovascular Research. 28 (2), 242-251 (1994).</li><li>Raman, S., Kelley, M. A., Janssen, P. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effect+of+muscle+dimensions+on+trabecular+contractile+performance+under+physiological+conditions.">Effect of muscle dimensions on trabecular contractile performance under physiological conditions.</a> Pflugers Archiv: European Journal of Physiology. 451 (5), 625-630 (2006).</li><li>Czeiszperger, T. L., Wang, M. P., Chung, C. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Membrane+stabilizer+Poloxamer+188+improves+yield+of+primary+isolated+rat+cardiomyocytes+without+impairing+function.">Membrane stabilizer Poloxamer 188 improves yield of primary isolated rat cardiomyocytes without impairing function.</a> Physiol Rep. 8 (4), 14382 (2020).</li><li>Louch, W. E., Sheehan, K. A., Wolska, B. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Methods+in+cardiomyocyte+isolation,+culture,+and+gene+transfer.">Methods in cardiomyocyte isolation, culture, and gene transfer.</a> Journal of Molecular and Cellular Cardiology. 51 (3), 288-298 (2011).</li><li>Loiselle, D. S., Johnston, C. M., Han, J. C., Nielsen, P. M. F., Taberner, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Muscle+heat:+a+window+into+the+thermodynamics+of+a+molecular+machine.">Muscle heat: a window into the thermodynamics of a molecular machine.</a> American Journal of Physiology. Heart and Circulatory Physiology. 310 (3), 311-325 (2016).</li><li>de Tombe, P. P., ter Keurs, H. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Force+and+velocity+of+sarcomere+shortening+in+trabeculae+from+rat+heart.+Effects+of+temperature.">Force and velocity of sarcomere shortening in trabeculae from rat heart. Effects of temperature.</a> Circulation Research. 66 (5), 1239-1254 (1990).</li><li>Palmer, B. M., Bell, S. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preparing+excitable+cardiac+papillary+muscle+and+cardiac+slices+for+functional+analyses.">Preparing excitable cardiac papillary muscle and cardiac slices for functional analyses.</a> Frontiers in Physiology. 13, 817205 (2022).</li><li>Brunello, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Myosin+filament-based+regulation+of+the+dynamics+of+contraction+in+heart+muscle.">Myosin filament-based regulation of the dynamics of contraction in heart muscle.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 117 (14), 8177-8186 (2020).</li></ol>

Mekanisk kontrol af afslapning (MCR) kvantificerer afhængigheden af myokardieafslapningshastigheden af muskelforløbets belastningshastighed 8,9. Belastningshastighed, snarere end efterbelastning, er både nødvendig og tilstrækkelig til at ændre afslapningshastigheden8. Da interventioner til ændring af calciumhastigheden ikke har vist sig at forbedre hjerteafslapning væsentligt, kan mekanisk indgreb give ny indsigt i mekanismen og give en ny behandling for diastolisk dysfunktion.
Protokollen til ændring af myokardiebelastningshastigheden beskrevet her anvender en isotonisk belastningsklemme 8,9. En styrke af den isotoniske belastningsklemme er den kvantitative kontrol af efterbelastningsspændingen. Windkessel-lignende protokoller kunne bruges til yderligere at undersøge ændringer i efterbelastning, forbelastning og hjertearbejde 2,6,7. En rampe, der ikke styres af belastningsklemmen, kan også bruges til bedre at isolere ændringen i belastning fra belastningshastigheden. Uanset hvad ser efterbelastningen i sig selv ikke ud til at være en stærk modifikator af afslapningshastigheden8.
Protokollen kan også tilpasses til at nærme sig mere fysiologiske betingelser for temperatur og tempohastighed. De aktuelle protokoloplysninger blev brugt til at vise tilstedeværelsen af MCR. Gennemførelse af eksperimenter under fysiologiske forhold anbefales generelt afhængigt af det eksperimentelle spørgsmål. Imidlertid kan eksperimenter udført ved 37 ° C eller ved høje pacinghastigheder hurtigere fremkalde nedslidning (skade) på musklen. En løsning med forbedret iltbæreevne kan være nødvendig. Desuden skal dataindsamlingen være i stand til at prøve længden og kraften hurtigt nok til at løse de hurtige trækninger og give feedbackkontrol.
Den nuværende protokol beskriver ikke måling af calcium eller måling og kontrol af sarkomerlængder. Calciummålinger er blevet behandlet i andre protokoller11, mens sarkomerlængdemåling kan tilføjes med passende udstyr. Sarkomerlængdekontrol anvendes ikke i nuværende MCR-undersøgelser, fordi muskellængde er den mest korrelative parameter til den kliniske tilstand19. Yderligere sarkomerlængdekontrol (vs. muskellængdekontrol) ville give specifikke svar på kinetiske spørgsmål, men vil sandsynligvis ikke føje til translationel viden på grund af inter-sarkomervariation og den minimale forståelse af sarkomerlængdeændringer in vivo.
Tre eksperimentelle overvejelser fremhæves her for at øge reproducerbarheden af dataene.
For det første kan fritstående hjertetrabeculae være vanskelige at finde hos nogle dyr (upublicerede resultater og meddelelser). Mens trækninger muskler kan findes hos de fleste rotter, er en rimelig succesrate for at indhente data fra trabecula hos rotter en ud af tre. Trabecula succes kan være højere med Brown Norway x Lewis F1 rotter, som også er blevet brugt historisk20 og rapporteret at have flere trabeculae (upubliceret kommunikation). For mus er succesraten sandsynligvis lavere, med mindre end en ud af 10 forventes for mus fra en BL / 6-baggrund; Der forventes dog en højere frekvens for mus med FVBN-baggrund (ikke-offentliggjorte meddelelser og observationer).
For det andet kan skader på muskler reducere produktionen. Hvis de udviklede kræfter er mindre end 10 mN mm-2 ved 25 °C og 0,5 Hz pacing, kan det være nødvendigt at udføre fejlfinding for at vurdere, om der forekommer utilsigtet strækning eller kontakt mellem metaltang og muskler, hvis opløsningerne ikke er korrekt forberedt, eller hvis pacing eller eksperimentelt udstyr fungerer korrekt. Andre protokoller, der anvender intakt trabecula, har foreslået at bruge Luer-lock-sprøjter som overførselsbeholdere11. Selvom dette er muligt, især hvis brugeren styrer en meget langsom strømningshastighed eller mindre muskelsegment, bruger den nuværende protokol en meget større boreoverførselspipette for at minimere mulig skade. Et andet trin, hvor iskæmisk skade kan forekomme, er under dissektion. Aorta skal kanyleres og skylles med perfusionsopløsning inden for 3 minutter efter den første abdominale snit (rotte) eller cervikal dislokation (mus), svarende til grænserne anført i kardiomyocytisolationsprotokoller21,22. Dette minimerer den tid, hvor hjertevævet ikke udsættes for den kardioplegi-lignende perfusionsopløsning. Desuden producerer dissektioner, der varer mere end 30 minutter, generelt ikke træktrabecula. Således bør operatører øve hurtig, men omhyggelig dissektion for at minimere skader. Et tværsnitsareal over 0,2 mm 2 (2 x 10-7 m2) kan lide af kerneiskæmi20.
For det tredje bør den måde, hvorpå musklerne er fastgjort til motor- og krafttransduceren, overvejes. Denne protokol fokuserer i øjeblikket på kroge og fritstående trabeculae. Den undertiden hurtige belastningshastighed af strækningen før afslapning kan få en muskel til at glide, hvis den ikke fastgøres korrekt, hvorfor den nuværende protokol ikke bruger "kurve" til at holde trabecula23,24. Alternative monteringsmetoder (klæbemidler, clips osv.25,26) kan også overvejes og valideres. Protokollen beskrevet her bruger trabeculae og ikke papillære muskler. Papillærmuskulaturens chordae inducerer en serieelasticitet, der kan hæmme ændringer i MCR9. Imidlertid er det usandsynligt, at den nøjagtige placering af vedhæftningerne i musklen påvirker foranstaltningerne, fordi trabeculalængden (og diameteren) varierer betydeligt.
En begrænsning ved at gennembore muskelenderne med kroge er, at selve monteringspunktet også kan blive beskadiget. Mulig rivning af det anbragte muskelvæv med hyppige sammentrækninger (afhængigt af deres styrke) kan ændre længden eller seriens elasticitet. Denne rivehastighed er vanskelig at kontrollere. På samme måde kan skader på vævet og krogen forværres under strækning, hvilket også potentielt kan forårsage problemer. Visuel inspektion og de udviklede kraftværdier, der forbliver >80% af den ekvilibrerede isometriske kraft, bør anvendes til at vurdere, om præparatet er beskadiget og bør udelukkes.
En anden begrænsning eller overvejelse påvirker, hvilke eksperimentelle spørgsmål der kan besvares ved metoden. Overvej for eksempel brugen af 2,3-butandionmonoxim (BDM) i perfusionsopløsningen. BDM er en fosfatase, som kan ændre muskelfunktionen. Derudover betyder den lange periode med losning og manglende tempo, at den latente fosforyleringstilstand sandsynligvis har ændret sig. Der bør derfor udvises forsigtighed, hvis man forsøger direkte at vurdere et dyrs muskelkontraktilitet (vs. forskelle mellem genotyper eller behandlinger), da den kontraktile tilstand sandsynligvis har ændret sig. Virkningen af phosphorylering kan dog vurderes farmakologisk ved tilsætning af en agonist eller antagonist i vejen.
Sammenfattende giver MCR indsigt i, hvordan afslapning reguleres af muskelbevægelse (belastningshastighed). MCR kan bidrage til at give bedre indsigt i diagnosticering og overvågning af diastolisk sygdom sammen med mål for farmakologisk intervention, såsom ændring af myosinkinetik. Den protokol og rådgivning, der er skitseret her, beskriver viden udviklet gennem flere års forsøg og bør kunne anvendes på andre systemer og modeller for hjertesygdomme.

Hjerteafslapning er nedsat i næsten alle former for hjertesvigt (herunder hjertesvigt med reduceret udstødningsfraktion) og i mange hjerte-kar-sygdomme. Ud over adskillige metoder til evaluering af hjertefunktion i permeabiliserede muskler vinder evalueringen af intakte hjertemuskler interesse. Sådanne væv vurderes, aflæsses (ender frit at trække sig sammen) eller belastes (længde eller kraft kontrolleres). Historisk set er intakte isolerede myocytter blevet evalueret i en ubelastet tilstand, hvor cellekroppen er fri til at forkorte under sammentrækning. Intakte hjertetrabeculae evalueres ofte under isometriske forhold, hvor længden ikke må ændre sig, men stress (kraft pr. Tværsnitsareal) genereres. Både intakte myocyt- og trabeculae-metoder begynder at konvergere med modifikationer af belastning 1,2.
Protokoller til belastningsklemme af en muskel (dvs. styring af en muskels udviklede stress ved en bestemt værdi, der simulerer fysiologiske efterbelastninger) er blevet udviklet over flere årtier 3,4,5. I intakt hjertevæv giver belastningsklemmer forskere mulighed for bedre at efterligne in vivo-hjertecyklussen ved hjælp af isotoniske eller Windkessel-lignende efterbelastninger 6,7,8,9. Målet med denne protokol er at opnå data, der anvendes til at kvantificere MCR (dvs. belastningshastighedsafhængigheden af lempelseshastigheden)8,9.
Mens MCR-protokollen er blevet tilpasset fra tidligere arbejde, er fokus for denne protokol (sammenlignet med lignende protokoller, der bruger intakt hjertevæv) på biomekaniske mekanismer, der ændrer afslapning. Der er flere protokoller, der bruger belastningsspænding 3,4,5,7,10 og protokoller med fokus på Windkessel-modeller 1,2,11, men denne protokol beskriver specifikt, hvordan strækning før afslapning ændrer afslapningshastigheden. Vi har vist, at denne kontrol forekommer i en proto-diastolisk periode8, en fase oprindeligt beskrevet af Wiggers12. I normale sunde hjerter gennemgår myokardiet en forlængende belastning under udstødning før aortaklappelukning (dvs. før isovolumisk afslapning)13. Dette efterlignes ved at forlænge varigheden af efterbelastningskontrol, indtil musklen begynder at strække sig. Klinisk dokumentation tyder på, at denne forlængelse kan svækkes eller gå tabt i sygdomstilstande14, og implikationerne og mekanismerne af ændrede endesystoliske belastningshastigheder er ikke blevet fuldt belyst. I betragtning af de sparsomme behandlingsmuligheder for diastoliske sygdomme og hjertesvigt med en bevaret uddrivningsfraktion postulerer vi, at MCR kan give indsigt i nye mekanismer, der ligger til grund for nedsat afslapning.
Mens den grove dissektion beskrevet her fokuserer på gnavere, kan trabecula-isolering udføres fra ethvert intakt hjerte og har tidligere været brugt med en human hjertetrabecula8. På samme måde kan dataindsamling og analyse også anvendes på kardiomyocytter eller andre isolerede muskeltyper 1,10. Diskussionen indeholder kommentarer til mulige ændringer og tilpasninger af metoden sammen med begrænsninger, såsom forsigtighed mod at bruge papillære muskler på grund af chordae's mekaniske egenskaber 9.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>18 or 16 gauge blunted needle/canula</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>for cannulation of rat aorta, use 1mm of PE160 or PE205 tubing as stop</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2,3-Butanedione Monoxime</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>B0753-25G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>23 gauge blunted needle/canula</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>for cannulation of mouse aorta, use 1mm of PE50 tubing as stop</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5 mL syringe</td>
			<td>BD Luer-Lock</td>
			<td>309646</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>95% Oxygen/5% CO2</td>
			<td>AirGas</td>
			<td>Z02OX9522000043</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anethesia system</td>
			<td>EZ Systems</td>
			<td>EZ-SA800</td>
			<td>Can use any appropriate anethesia method/system</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine Serum Albumin</td>
			<td>Fisher BioReagents</td>
			<td>BP-1600</td>
			<td>to coat tips of fine forcepts, scissors</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Calcium Chloride Dihydrate</td>
			<td>Fisher Chemical</td>
			<td>C79-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Containers/dissection dishes</td>
			<td>FisherBrand</td>
			<td>08-732-113</td>
			<td>Weigh dishes for creating dissection plates</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Crile Hemostat</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>13005-14</td>
			<td>for mouse gross dissection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D-(+)-Glucose</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G8270-1KG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Data acquisition software</td>
			<td>SLControl</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Data acquisition system</td>
			<td>MicrostarLabs</td>
			<td>DAP5216a</td>
			<td>Can use any DAQ.&#160; This is a PCI based data acqusition for use with SLControl; must have a PC with a PCI slot</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Data analysis software</td>
			<td>Mathworks</td>
			<td>Matlab</td>
			<td>Custom Script</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dumont #3 Forceps</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>11231-30</td>
			<td>2x for cannulation of aorta</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dumont #5 Forceps</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>11254-20</td>
			<td>2x for trabecula isolation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Experimental system</td>
			<td>Aurora Scientific</td>
			<td>801C</td>
			<td>Can use any appropriate experimental chamber with force and length control</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fine Scissors, curved</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>14061-09</td>
			<td>for removal of heart</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gooseneck Piggyback Illuminator</td>
			<td>AmScope</td>
			<td>LED-6WA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>H3375-250G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Imaging software</td>
			<td>IrfanView</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Iris Forceps</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>15915</td>
			<td>for removal of heart</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isoflurane</td>
			<td>VetOne</td>
			<td>502017</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnesium Chloride Hexahydrate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>M2670-100G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnesium Sulfate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>M7506-500G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mayo Scissors</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>14110-15</td>
			<td>for rat gross dissection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Metzenbaum Scissors</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>14116-14</td>
			<td>for mouse gross dissection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope connected camera</td>
			<td>Flir</td>
			<td>BFS-U3-27S5M-C</td>
			<td>Includes acquisition software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope/digital imaging system</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>IX-73</td>
			<td>Can use any appropriate microscope.&#160; Needed to measure muscle length, cross sectional area</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mounting Pin/Needle</td>
			<td>BD PrecisionGlide</td>
			<td>305136</td>
			<td>For holding heart to dish.&#160; 27 G x 1-1/4</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mounting Pin/Needle</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>26000-40</td>
			<td>For holding heart to dish. 0.4mm diameter insect pin (Alt to 27G needle)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Oxygen (O2)</td>
			<td>AirGas</td>
			<td>OX USP300</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Peristaltic Pump</td>
			<td>Rainin</td>
			<td>Rabbit</td>
			<td>Can be any means to create flow in experimental chamber</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pH and Oxygen sensor</td>
			<td>Mettler Toledo</td>
			<td>SevenGo pH and DO</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium Bicarbonate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>237205-100G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium Chloride</td>
			<td>Fisher Chemical</td>
			<td>P217-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium Phosphate Monobasic</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>795488-500G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rochester-pean Hemostat</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>501708</td>
			<td>for rat gross dissection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Silk Suture, Size: 4/0</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>18020-40</td>
			<td>cut to ~1.5 inch pieces, soaked in water</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Bicarbonate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S6297-250G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Chloride</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S9888-1KG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Hydroxide</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S8045-500G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Phosphate Dibasic</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S7907-100G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stereomicroscope</td>
			<td>AmScope</td>
			<td>SM-1TX</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Student Vannas Spring Scissors&#160;</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>91500-09</td>
			<td>for opening of the RV</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SYLGARD 184 Silicone Elastomer Base</td>
			<td>Dow Corning</td>
			<td>3097358-1004</td>
			<td>For creating dissection plates</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringe Holder</td>
			<td>Harbor Frieght</td>
			<td>Helping Hands 60501</td>
			<td>Can be used as alternate for ring stand</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Taurine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T0625-1KG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Transfer Pipette</td>
			<td>FisherBrand</td>
			<td>13-711-7M</td>
			<td>cut ~1&#34; from tip to widen bore</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vannas Spring Scissors</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>15000-00</td>
			<td>for trabecula isolation</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

mechanical control of relaxation using intact cardiac trabeculae

Diastolisk dysfunktion er en almindelig fænotype på tværs af præsentationer af hjerte-kar-sygdomme. Ud over forhøjet hjertestivhed (forhøjet venstre ventrikulært slutdiastolisk tryk) er nedsat hjerteafslapning en vigtig diagnostisk indikator for diastolisk dysfunktion. Mens afslapning kræver fjernelse af cytosolisk calcium og deaktivering af sarkomeriske tynde filamenter, har målretning af sådanne mekanismer endnu ikke givet effektive behandlinger. Mekaniske mekanismer, såsom blodtryk (dvs. efterbelastning), er blevet teoretiseret for at ændre afslapning. For nylig viste vi, at ændring af belastningshastigheden for en strækning, ikke efterbelastning, var både nødvendig og tilstrækkelig til at ændre den efterfølgende afslapningshastighed for myokardievæv. Belastningshastighedsafhængigheden af afslapning, kaldet mekanisk kontrol af afslapning (MCR), kan vurderes ved hjælp af intakte hjertetrabeculae. Denne protokol beskriver udarbejdelsen af en smådyrsmodel, forsøgssystem og kammer, isolering af hjertet og efterfølgende isolering af en trabecula, forberedelse af forsøgskammeret samt forsøgs- og analyseprotokoller. Beviser for forlængelse af stammer i det intakte hjerte tyder på, at MCR kan give nye arenaer for bedre karakterisering af farmakologiske behandlinger sammen med en metode til vurdering af myofilamentkinetik i intakte muskler. Derfor kan undersøgelse af MCR belyse en vej til nye tilgange og nye grænser i behandlingen af hjertesvigt.

Et repræsentativt datasæt er vist i figur 4, og yderligere resultater kan findes i tidligere publikationer 8,9. Kort fortalt beregnes belastningshastigheden ud fra derivatet af stammen, lige før isometrisk afslapning. Stamme er længden som funktion af tiden divideret med muskelens længde ved optimal længde. Afslapningshastigheden beregnes som 1/τ, hvor τ er eksponentialtidskonstanten16. Flere belastningshastigheder og deres resulterende afslapningshastigheder er nødvendige for at bestemme den mekaniske styring af afslapning (MCR). Disse data er plottet på en lempelsesrate versus belastningshastighedsgraf. Linjens hældning giver MCR-indekset.
Bemærk, at slutsystoliske og diastoliske belastningshastigheder sandsynligvis ikke overstiger 1 s-1. Derfor bør hældningen kun omfatte belastningshastigheder < 1 s-1. Afslapningshastigheden ved lave belastningshastigheder kan forvirres af ændringer i minimumstidsderivatet af stress (dStress / dtmin), og i disse tilfælde kan data fra strækninger mindre end ca. 0,15 s-1 ignoreres.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64879/64879fig01.jpg"> Figur 1: Opsætning af grov dissektion og hjertekanyleringsområde. Fra højre mod venstre: a. Anæstesiinduktionskammeret til dyret ligger nær dissektionsområdet. b. En snorkel til valgfri flygtig gas scavenger. c. En dissektionspude, hvor dyret placeres liggende, flankeres af (med uret) d. en næsekegle for at give fortsat bedøvelse til gnaveren, e. hæmostater, f. kirurgisk saks, g. buet fin saks placeret for nem adgang med den dominerende (skære) hånd, h. buet irispincet placeret for nem adgang med den ikke-dominerende hånd. Gnaverens øvre lemmer kan fastgøres til dissektionspuden ved hjælp af tape, og i. en dissektionsskål (eller lille bægerglas) med perfusionsopløsning skal placeres i nærheden for at skylle hjertet. j. Et område, der er iscenesat til kanylering, skal placeres i nærheden. En sprøjte med en passende kanyle er monteret på et ringstativ. k. (Indsat) Et nærmere billede af en 16 G kanyle, med 1 mm PE205 slange fastgjort og en sutur løst knyttet sammen. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64879/64879fig01large.jpg" target="_blank">Klik her for at se en større version af denne figur.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64879/64879fig02.jpg"> Figur 2: Forsøgsområde og værktøjer. (A) Forsøgsområde. Det eksperimentelle kammer og dataindsamlingssystemet fremstilles på et nærliggende omvendt mikroskop (venstre). Trabecula-isolering og montering sker under et stereoskop (højre). (B) Spidser af to pincet, store og små Vannas-sakse og en brugerdefineret glassonde fremstilles ved iblødsætning i 10% BSA-opløsning. (C) Yderligere dissektionsværktøjer. En silikone elastomerbelagt skål giver mulighed for montering af hjertet under fin dissektion. En 7 ml overførselspipette med endeskæring er vist under skålen og glassonden. Den afskårne spids af overførselspipetten kasseres, og en forstørret boring bruges til at overføre musklen med minimal risiko for strækning eller dehydrering. (D) Forstørret billede af enden af en glaspipette, som er ca. 2 mm lang og 0,25-0,5 mm i diameter. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64879/64879fig02large.jpg" target="_blank">Klik her for at se en større version af denne figur.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64879/64879fig03.jpg"> Figur 3: Vejledning i dissektion. (A) Grov dissektion skal begynde med et tværgående snit (1. grønt) gennem huden ind i bughulen under xyphoid-processen (nedre ribben og xyphoid er angivet med en tynd grå linje). Parasagittale snit fra bughulen op i brystkassen skal følge (2. blågrøn og 3. blå linjer), hvorefter mellemgulvet skal skæres. En hemostat kan derefter bruges til at klemme xyphoid-processen og hæve brystvæggen mod hovedet. (B) Et intakt rottehjerte fastgjort til en silicium-elastomerskål, orienteret med udsigt over højre ventrikulær udstrømningskanal (RVOT), højre atrium (RA), aorta (Ao) og venstre atrium (LA). Det første sæt snit skal være fra RVOT til toppen langs septum (1. Gul linje). Et andet sæt snit skal være fra RVOT langs bunden af hjertet og derefter over højre atrium (2. orange linje). (C) RVOT kan forsigtigt trækkes væk fra aorta for at åbne hjertet og fastgøre det tilbage. Gule og orange linjer svarer til snit beskrevet i B. Fritstående trabeculae findes ofte nær bunden af RV-frimuren og nær septumet, men kan forekomme overalt (røde linjer angiver fælles placeringer). (D) Forstørret billede af glassonden under en trabecula (gul pil angiver skæringspunktet mellem trabecula og sonde). (E) En trabecula (rød pil) er monteret på forsøgssystemet mellem en krafttransducer (venstre) og motor (centrum-højre) og flankeres af to pacingledninger (vandret over og under trabeculaen). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64879/64879fig03large.jpg" target="_blank">Klik her for at se en større version af denne figur.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64879/64879fig04.jpg"> Figur 4: Repræsentative spor og resultater . (A) En enkelt hjertetrabecula oplyst ved hjælp af et svanehals LED-lys i en stejl (~ 75 °) vinkel fra mikroskoplinsens akse, hvilket forbedrer trabeculaens kontrast. I dette eksempel er to billeder flisebelagt for at vise trabeculaens fulde længde. (B) Stress-tid (øverst) og belastningstid (nederst) kurver for samme trabecula. Et isometrisk ryk sammen med tre belastningsklemmetræk ved stigende systoliske belastningshastigheder vises. C) Repræsentativ beregning af markedsrisikoen. MCR defineres som hældningen af linjen mellem afslapningshastigheden og belastningshastigheden. Som nævnt i diskussionen kan belastningshastigheder begrænses til at tilvejebringe en kvantitativ, reproducerbar MCR. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64879/64879fig04large.jpg" target="_blank">Klik her for at se en større version af denne figur.</a>
Tabel 1: Løsninger. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64879/64879_Table1.xlsx" target="_blank">Klik her for at downloade denne tabel.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Mechanical Control of Relaxation Using Intact Cardiac Trabeculae at JoVE.com

Mechanical Control of Relaxation Using Intact Cardiac Trabeculae

Hurtig myokardie- og hjerteafslapning er afgørende for normal fysiologi. Mekaniske afslapningsmekanismer er nu kendt for at være afhængige af belastningshastighed. Denne protokol giver et overblik over erhvervelse og analyse af eksperimenter for yderligere at studere den mekaniske kontrol af afslapning.

Mekanisk kontrol af afslapning ved hjælp af intakte hjertetrabeculae

Diastolic dysfunction is a common phenotype across cardiovascular disease presentations. In addition to elevated cardiac stiffness (elevated left ...

Denne protokol beskriver en metode til måling af mekanisk kontrol af afslapning eller belastningsafhængighed af muskelafslapning i hjertetrabecula. Den største fordel ved denne teknik er, at den fokuserer på hjerteafslapning. I betragtning af manglen på behandlingsmuligheder for diastoliske sygdomme kan denne teknik bruges til at identificere nye indekser og lægemiddelmål relateret til hjerteafslapning.Denne metode vil blive vist med et gnaverhjerte, men det kan bruges på enhver intakt muskel. Demonstrere denne procedure vil være mig selv og Anita Abbo, en bachelor forskningsassistent i mit laboratorium. Til at begynde med skal du fjerne den groft dissekerede smådyrsmodels hjerte fra kanylen og placere den i en silikone elastomerbelagt vejeskål for at forberede sig på trabekulær isolering.Placer og belys derefter hjertet under et stereomikroskop. Efter at have lokaliseret højre ventrikulær udstrømningskanal, fastgør venstre atrium og ventrikulær spids til silikoneelastomeren i skålen. Brug lang Vannas saks til at skære fra højre ventrikulære udstrømningskanal til toppen langs septumet.Skær derefter fra højre ventrikulær udstrømningskanal til højre atrium nær aorta, og skær derefter gennem højre atrium. Brug tang til forsigtigt at åbne den højre ventrikulære frie væg fra udstrømningskanalen uden at strække vævet. Hvide tynde bindevævsstrenge, hvis de findes, kan skæres, men ikke de større lyserøde vævsstrenge, da de kan være trabeculae.Fastgør den frie væg i højre ventrikeltrekant til skålen for at udsætte højre ventrikel. Brug en tynd stump smeltet glaspipette til at søge i det eksponerede endokardium efter fritstående trabeculae uden at anvende tryk. Undgå de trekantede papillære muskler og vælg trabeculae med parallelle sider, som ofte findes nær bunden af højre ventrikulære frie væg og langs septumet.Disseker trabecula ved hjælp af en lille Vannas-saks, og efterlad et stykke væv på en millimeter i hver ende af trabecula for at muliggøre fastgørelse. Skær derefter ca. to inches af enden af en syv milliliter overførselspipette, træk langsomt trabecula ind i pipetten og overfør den til en ny vejeskål, der indeholder 50% perfusionsopløsning og 50% modificeret Tyrodes opløsning. Lad musklen ekvilibrere til stigningen i ekstracellulært calcium i den blandede opløsning I flere minutter.Sluk for pumpen, der leverer superfusion eller sug til forsøgskammeret. Brug den store boreoverførselspipette til at flytte trabecula ind i forsøgskammeret fyldt med Tyrodes opløsning. Fastgør et stykke væv i terning for enden af trabecula til en krog på krafttransduceren, og fastgør derefter den anden terning til motoren.Genstart superfusionen og begynd at pacing musklen for at bestemme tærskelspændingen. Tempo ved 20% over tærskelspændingen i ca. en time. Ved afslutningen af denne ligevægtsperiode skal du langsomt strække musklen ved hjælp af mikrometeret, der er forbundet med motoren, indtil optimal udviklet stressgenerering opnås ved at observere den udviklede spænding.Stop med at øge muskellængden, når den passive diastoliske spænding stiger hurtigere end topspændingen, hvilket indikerer, at den optimale længde er passeret. Sluk for den transmitterede mikroskopbelysning og belys trabecula ved hjælp af en svanehalsbelysning i en stejl vinkel. Brug et tidligere kalibreret kamera tilsluttet via mikroskopoptikken til at tage et billede af trabecula under diastol i den eksperimentelle mappe.Gennemsnit diameteren måler og konverterer diameteren og længden fra pixels til millimeter ved hjælp af en tidligere opnået kalibrering. Beregn tværsnitsarealet og muskellængden i mikrometer. I dataindsamlingssoftwaren skal du hente belastningsfastspændte data ved at definere efterbelastningen i dap-filen og gentage værdier for proportional forstærkning og integrationsparametre ved at gemme filen i teksteditoren og derefter trykke på Kør eksperiment "i grænsefladen.Kontroller enden af lastklemmen ved at ændre tilstanden. Gentag erhvervelsen, mens du ændrer enden af lastklemmen fra nul til komplet, og forlæng tilbage til startlængden. For at øge længden skal du gradvist øge tærsklen for afslutning af belastningsklemmen fra nul, indtil musklen næsten forlænges tilbage til sin oprindelige længde.Hvis det ønskes, skal du ændre efterbelastningen og gentage erhvervelsen med det samme. Hvis det ønskes, skal du ændre forspændingen ved at strække eller forkorte musklen eller behandle musklen ved at tilføje forbindelser til tyrodens opløsning, men vent mindst 20 minutter for at sikre, at den langsomme kraftrespons er stabiliseret, og for at forbindelsen trænger helt ind i musklen. Når dataindsamlingen er afsluttet, skal du fjerne trabecula og rense det eksperimentelle system.Kvantificer afslapning ved at sikre, at dataanalyseprogrammet analyserer den fastspændte rytme, og at programmet korrekt erhverver starten af belastningsklemmen. Efter kvantificering af alle spor af en given tilstand plottes forholdet mellem afslapningshastigheden og belastningshastigheden, idet de maksimale data begrænses til en fysiologisk belastningshastighed på mindre end en pr. Sekund. Udeluk data ved lave belastningshastigheder, da afslapningsfasen muligvis ikke afspejler det eksponentielle henfald.Få hældningen af linjen mellem afslapningshastigheden og belastningshastigheden, og registrer hældningen som indekset for mekanisk kontrol af afslapning. En enkelt hjertetrabecula oplyst ved hjælp af et svanehals LED-lys i en stejl vinkel på 75 grader fra mikroskoplinsens akse er vist her. Stresstids- og belastningstidskurver for den samme trabecula viste et isometrisk ryk og tre belastningsklemmetræk ved stigende og systoliske belastningshastigheder.Belastningshastigheden beregnes ud fra derivatet af stammen lige før isometrisk afslapning. Dataene plottes på en afslapningshastighed versus belastningshastighedsgraf, hvor linjens hældning giver mekanisk kontrol af afslapning eller MCR-indeks. Den sværeste komponent i denne protokol er en omhyggelig isolering af hjertetrabeculaen.Denne protokol kan kombineres med andre målinger af muskler, herunder intracellulært calcium, kontraktilitet og sarkomerlængde. Denne metode bruges også til at identificere molekylære mekanismer og bedre forstå patofysiologien ved nedsat hjerteafslapning.

Research

JoVE Journal

Medicine

Quantitative Visualization and Detection of Skin Cancer Using Dynamic Thermal Imaging

In 2010 approximately 68,720 melanomas will be diagnosed in the US alone, with around 8,650 resulting in death 1. To date, the only effective treatment ...

Mesenteric Artery Contraction and Relaxation Studies Using Automated Wire Myography

Proximal resistance vessels, such as the mesenteric arteries, contribute substantially to the peripheral resistance. These small vessels of between ...

Direct Pressure Monitoring Accurately Predicts Pulmonary Vein Occlusion During Cryoballoon Ablation

Direkte trykmålekomponenter nøjagtigt Forudsiger lungevene okklusion under Cryoballoon Ablation

Cryoballoon  ablation (CBA) is an established therapy for atrial fibrillation (AF).  Pulmonary vein (PV) occlusion is essential for achieving antral ...

Early Detection of Drug-Induced Renal Hemodynamic Dysfunction Using Sonographic Technology in Rats

Tidlig påvisning af Drug-induceret Renal Hæmodynamisk dysfunktion Brug Sonografisk Technology i rotter

The kidney normally functions to maintain hemodynamic homeostasis and is a major site of damage caused by drug toxicity. Drug-induced nephrotoxicity is ...

Visualization of Streptococcus pneumoniae within Cardiac Microlesions and Subsequent Cardiac Remodeling

Visualization of Streptococcus pneumoniae within Cardiac Microlesions and Subsequent Cardiac Remodeling

Visualisering af<em&gt; Streptococcus pneumoniae</em&gt; Inden Hjerte småsår og efterfølgende Cardiac Remodeling

During bacteremia Streptococcus pneumoniae can translocate across the vascular endothelium into the myocardium and form discrete bacteria-filled ...

A Chronic Cardiac Ischemia Model in Swine Using an Ameroid Constrictor

En kronisk hjerte iskæmi Model i svin ved hjælp af en Ameroid kvælerslange

Cardiovascular disease remains the number one cause of mortality in the United States. There are numerous approaches to treating these diseases, but ...

Mechanical Ventilation Boot Camp Curriculum

Mekanisk Ventilation Boot Camp Curriculum

Medical management of mechanically ventilated patients is challenging to novice providers. Incorrect management of this population may lead to increased ...

Noninvasive Determination of Vortex Formation Time Using Transesophageal Echocardiography During Cardiac Surgery

Noninvasiv bestemmelse af Vortex dannelsen tid ved hjælp af Transesophageal ekkokardiografi under hjertekirurgi

Trans-mitral blood flow produces a three-dimensional rotational body of fluid, known as a vortex ring, that enhances the efficiency of left ventricular ...

Normothermic Ex Situ Heart Perfusion in Working Mode: Assessment of Cardiac Function and Metabolism

Normothermic Ex Situ hjerte Perfusion i arbejde Mode: vurdering af hjertets funktion og stofskifte

The current standard method for organ preservation (cold storage, CS), exposes the heart to a period of cold ischemia that limits the safe preservation ...

In Vitro Assessment of Cardiac Function Using Skinned Cardiomyocytes

In Vitro vurdering af hjertefunktion ved hjælp af flået kardiomyocytter

In this article, we describe the steps required to isolate a single permeabilized (&#34;skinned&#34;) cardiomyocyte and attach it to a force-measuring ...