이 프로토콜은 심장 섬유주에서 이완의 기계적 제어 또는 근육 이완의 변형 의존성을 측정하는 방법을 설명합니다. 이 기술의 가장 큰 장점은 심장 이완에 초점을 맞추고 있다는 것입니다. 이완기 질환에 대한 치료 옵션이 부족하다는 점을 감안할 때 이 기술은 심장 이완과 관련된 새로운 지표 및 약물 표적을 식별하는 데 사용될 수 있습니다.
이 방법은 설치류 심장으로 표시되지만 손상되지 않은 근육에 사용할 수 있습니다. 이 절차를 시연하는 것은 저와 제 연구실의 학부 연구 조교인 Anita Abbo가 될 것입니다. 시작하려면 캐뉼라에서 심하게 해부된 작은 동물 모델의 심장을 제거하고 실리콘 엘라스토머 코팅 계량 접시에 넣어 섬유주 분리를 준비합니다.
그런 다음 심장을 실체 현미경으로 비추십시오. 우심실 유출관을 찾은 후 좌심방과 심실 정점을 접시의 실리콘 엘라스토머에 고정합니다. 긴 Vannas 가위를 사용하여 우심실 유출로에서 중격을 따라 정점까지 자릅니다.
다음으로, 우심실 유출로에서 대동맥 근처의 우심방으로 절제한 다음 우심방을 절단합니다. 집게를 사용하여 조직을 늘리지 않고 유출로에서 우심실 자유 벽을 조심스럽게 잡아 당깁니다. 흰색의 얇은 결합 조직 가닥이 발견되면 절단할 수 있지만 더 큰 분홍색 조직 가닥은 섬유주일 수 있으므로 절단할 수 없습니다.
우심실 삼각형의 자유 벽을 접시에 고정하여 우심실을 노출시킵니다. 끝이 뭉툭한 얇은 유리 피펫을 사용하여 압력을 가하지 않고 노출된 심내막에서 독립형 섬유주를 검색합니다. 삼각형 유두 근육을 피하고 평행 한면을 가진 섬유주를 선택하십시오.이 섬유주는 우심실 자유 벽의 기저부와 중격을 따라 종종 발견됩니다.
작은 Vannas 가위를 사용하여 섬유주를 해부하고 섬유주의 양쪽 끝에 1mm 입방체의 조직 조각을 남겨 부착할 수 있도록 합니다. 다음으로, 7밀리리터 이송 피펫의 끝에서 약 2인치를 잘라내고, 섬유주를 피펫에 천천히 끌어들인 다음, 50% 관류 용액과 50% 변형된 Tyrode's 용액이 들어 있는 새로운 계량 접시에 옮깁니다. 근육이 혼합 용액 내에서 세포 외 칼슘의 증가와 평형을 이루도록 몇 분 동안.
실험 챔버에 과융합 또는 흡입을 공급하는 펌프를 끕니다. 대구경 이송 피펫을 사용하여 섬유주를 Tyrode의 용액으로 채워진 실험 챔버로 옮깁니다. 섬유주 끝에 있는 입방체 조직 조각을 힘 변환기의 고리에 고정한 다음 두 번째 입방체를 모터에 고정합니다.
과융합을 다시 시작하고 근육의 페이싱을 시작하여 임계 전압을 결정합니다. 약 1시간 동안 임계 전압보다 20% 높은 속도로 진행합니다. 이 평형 기간이 끝나면 발달 된 장력을 관찰하여 최적의 발달 된 응력 생성이 달성 될 때까지 모터에 연결된 마이크로 미터를 사용하여 근육을 천천히 스트레칭합니다.
수동 이완기 장력이 최대 장력보다 빠르게 상승하면 근육 길이 증가를 중지하여 최적의 길이가 통과되었음을 나타냅니다. 투과된 현미경 조명을 끄고 구즈넥 조명기를 사용하여 가파른 각도로 섬유주를 비춥니다. 현미경 광학 장치를 통해 연결된 이전에 보정된 카메라를 사용하여 확장기 동안 섬유주를 실험 폴더에 캡처합니다.
직경 측정값의 평균을 구하고 이전에 얻은 보정을 사용하여 직경과 길이를 픽셀에서 밀리미터로 변환합니다. 단면적과 근육 길이를 마이크로미터 단위로 계산합니다. 데이터 수집 소프트웨어에서 dap 파일에서 애프터로드를 정의하여 로드 클램핑된 데이터를 수집하고, 텍스트 편집기에 파일을 저장하여 비례 이득 및 적분 파라미터 값을 반복한 다음 인터페이스에서 Run Experiment(실험 실행)를 누릅니다.
로드 cl의 끝을 제어amp 모드를 변경하여 . 로드 cl의 끝을 변경하면서 수집을 반복합니다.amp 0에서 완료로 다시 시작 길이로 다시 연장합니다. 길이를 늘리려면 근육이 원래 길이로 거의 다시 늘어날 때까지 부하 클램프를 끝내기 위한 임계값을 0에서 점진적으로 늘립니다.
원하는 경우 애프터로드를 수정하고 즉시 수집을 반복하십시오. 원하는 경우 근육을 늘리거나 짧게 하여 예압을 수정하거나 Tyrode의 용액에 화합물을 추가하여 근육을 치료하되 느린 힘 반응이 안정화되고 화합물이 근육에 완전히 침투할 때까지 최소 20분을 기다리십시오. 데이터 수집이 완료되면 섬유주를 제거하고 실험 시스템을 청소합니다.
데이터 분석 프로그램이 클램핑된 비트를 분석하고 프로그램이 부하 클램프의 시작을 올바르게 획득하는지 확인하여 완화를 정량화합니다. 주어진 조건의 모든 흔적을 정량화한 후 이완 속도와 변형률 사이의 관계를 플롯하여 최대 데이터를 초당 1 미만의 생리학적 변형률로 제한합니다. 변형률이 낮은 데이터는 완화 단계가 기하급수적 감쇠를 반영하지 않을 수 있으므로 제외합니다.
이완률과 변형률 사이의 선의 기울기를 구하고 이완의 기계적 제어 지표로 기울기를 기록합니다. 현미경 렌즈 축에서 75도의 가파른 각도로 구즈넥 LED 조명을 사용하여 조명된 단일 심장 섬유주가 여기에 표시됩니다. 동일한 섬유주에 대한 응력 시간 및 변형률 시간 곡선은 증가하는 수축기 변형률에서 등척성 경련과 3개의 하중 클램프 경련을 보여주었습니다.
변형률은 등척성 완화 직전의 변형률 도함수로부터 계산됩니다. 데이터는 완화율 대 변형률 그래프에 표시되며, 여기서 선의 기울기는 이완의 기계적 제어 또는 MCR 지수를 제공합니다. 이 프로토콜에서 가장 어려운 구성 요소는 심장 섬유주를 조심스럽게 분리하는 것입니다.
이 프로토콜은 세포 내 칼슘, 수축성 및 육종 길이를 포함한 근육의 다른 측정과 결합될 수 있습니다. 또한, 이 방법은 분자 메커니즘을 확인하고 손상된 심장 이완의 병태생리학을 더 잘 이해하는 데 사용되고 있습니다.
