Name: mechanical control of relaxation using intact cardiac trabeculae
Uploaded: 2023-02-17T13:35:00
Duration: 7 min 51 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Mechanical Control of Relaxation Using Intact Cardiac Trabeculae at JoVE.com

Detta arbete stöds av National Institutes of Health (1R01HL151738) och American Heart Association (18TPA34170169).

Följande protokoll har godkänts av Institutional Animal Care and Use Committee vid Wayne State University. Protokollet beskriver här steg för att använda gnagare försökspersoner, men kan anpassas för användning i andra modellorganismer.
1. Förberedelse
<ol><li>Hämta det experimentella ämnet och låt det acklimatisera sig till labbet.</li>
	<li>Bered 250 ml perfusionslösning och 250 ml modifierad Tyrodes lösning (tabell 1) genom att syresätta var och en till 10-20 ppmO2 med pH 7,3.</li>
	<li>Förbered en 5 ml spruta med en kanyl fäst. Fyll sprutan med perfusionslösning. Använd kanyler som är 23 G för en mus respektive 18 eller 16 G för en liten eller stor råtta. Skjut en 1 mm längd av polyetenslang (PE) på änden av en trubbig nål (Table of Materials), för att förhindra att aortan glider av kanylen efter att ha bundits.</li>
	<li>Fullständig förberedelse av dissektions- och kanyleringsområdet (figur 1)<ol><li>Fyll två rena vägningsbåtar minst halvvägs med perfusionslösning. Sänk ner kanylspetsen i perfusionslösning med minst en dubbelöglad sutur placerad runt kanylen. Håll sprutan på plats med en stångklämma.</li>
		<li>Placera kirurgisk sax, en hemostat, irispett, ett par små böjda saxar och två # 3 pincett för enkel åtkomst.</li>
	</ol></li>
	<li>Förbered experimentsystemet (figur 2) genom att grunda och cirkulera den modifierade Tyrodes lösning genom hela experimentsystemet. Se till att kammaren är helt full och stabil.</li>
	<li>Slå på alla datainsamlingsrutor, inklusive kraftgivaren, längdmotorn, stimuleringssystemet, temperaturkontrollsystemet och datainsamlingsdatorn.</li>
	<li>Kopiera och byt namn på en mallmapp som innehåller de *.dap- och pekarfiler som krävs för att referera till det aktuella experimentet. Öppna datainsamlingsprogramvaran.</li>
	<li>Förbered trabeculaisoleringsverktygen (Vannas sax, # 5 eller # 55 pincett, glassond) genom att sänka ner sina spetsar i 10% (w / v) bovint serumalbumin (BSA) i ultrarent vatten eller perfusionslösning, för att belägga metallen med protein (figur 2B). OBS: Hela experimentsystemet måste förberedas före dissektion.</li>
</ol>2. Grov dissektion och kanylering
<ol><li>Anteckna identifiering, kroppsvikt och annan relevant information om försökspersonen.</li>
	<li>Alternativt injicera 1 000 E/kg heparin i steril saltlösning till gnagaren via intraperitoneal injektion minst 10 minuter före avlivning, för att minimera risken för koagulering före koronar perfusion.</li>
	<li>Placera djuret i en induktionskammare och inducera generell anestesi med 3% -5% isofluran förångat i 100% syre, enligt standardprocedur. OBS: Slå på alla externa asätare, dunbord eller dragskåp som används för att minimera exponeringen för isofluran.</li>
	<li>När gnagaren förlorar sin rätande reflex och andningsfrekvensen har avtagit:<ol><li>(För en råtta) ta bort djuret från induktionskammaren och placera det liggande på en dissektionsdyna, med fortsatt anestesi genom en noskon.</li>
		<li>(För en mus) utför cervikal dislokation omedelbart efter att djuret har tagits bort från induktionskammaren. Näskonen är inte nödvändig. Vrid isofluranförångaren till 0%.</li>
	</ol></li>
	<li>Om det behövs, fäst gnagarnas övre extremiteter på dissektionsdynan bort från bröstväggen med tejp som stöds av stift, var försiktig så att du inte tränger in i djuret. Kontrollera om det finns korrekt anestesidjup (brist på tå-klämrespons) innan du fortsätter till dissektionen.</li>
	<li>Använd kirurgisk sax (Mayo för råttor, Metzenbaum för möss), strax under xyphoidprocessen, skär huden tvärs över hela bredden av gnagarens buk in i bukhinnan.</li>
	<li>Använd kirurgisk sax, gör två vertikala snitt parasagittala (upp på sidorna av bröstväggen) på både vänster och höger sida av bröstväggen från tvärsnittet. Skär sedan över membranet, anslut de parasagittala snitten och frigör bröstutrymmet.</li>
	<li>Kläm fast och lyft xyphoidprocessen med hjälp av en hemostat mot gnagarens huvud, för att flytta bröstbenet och bröstväggen upp mot gnagarens huvud och exponera bröstkorgsutrymmet och hjärtat. Om det behövs, förläng snabbt de parasagittala snitten till nära det andra ryggradsutrymmet, för att helt exponera hjärtat och / eller bryta perikardmembranet.</li>
	<li>Använd böjda iriscett, lyft försiktigt hjärtat för att visualisera de stora kärlen. Placera pincetten mellan myokardiet och ryggraden på gnagaren, kläm ner på de större kärlen och lyft hjärtat, var försiktig så att du inte klämmer fast atrierna eller ventrikulära segmenten.<ol><li>Medan du lyfter hjärtat något, placera snabbt den böjda irissaxen (konkav upp) mellan de böjda iriscincetten och gnagarnas ryggrad och skär de stora kärlen och lungorna bort från hjärtat. Flytta snabbt hjärtat till en vågbåt eller bägare som innehåller färsk perfusionslösning och skaka för att rensa bort blod från hjärtat.</li>
	</ol></li>
	<li>Vrid isofluranförångaren till 0%, om det inte redan är gjort. Om stora segment av lung-, perikardiala eller andra vävnader förblir fästa vid hjärtat, skär försiktigt bort och kassera dem vid denna tidpunkt för att minimera störningar i kannulationen.</li>
	<li>Använd de böjda iriscettetten, flytta hjärtat till en ren vägbåt eller bägare, med den förberedda kanylen nedsänkt. Kanylera aortan, säkra aortan genom att dra åt den öglade silkesuturen och spola med upp till 5 ml perfusionslösning.</li>
	<li>Ta bort hjärtat från kanylen och lägg det i en silikonelastomerbelagd vägningsform för att förbereda sig för trabeculaisolering.</li>
</ol>3. Isolering och jämvikt av trabecula
<ol><li>Placera hjärtat i silikonelastomerbelagd skål under ett stereomikroskop och belysa det.</li>
	<li>Leta reda på höger ventrikulärt utflödeskanal. Fäst vänster förmak och kammartoppen på silikonelastomeren i skålen.</li>
	<li>Använd en lång Vannas-sax och skär från höger kammares utflödeskanal till toppen längs septumet. Skär från höger ventrikulärt utflödeskanal till höger atrium nära aortan och skär sedan genom höger atrium (figur 3B).</li>
	<li>Använd pincett och dra försiktigt upp den högra ventrikulära (RV) fria väggen från utflödeskanalen, var försiktig så att du inte sträcker vävnaden. OBS: Experimenter kan hitta tunna, vita bindvävsträngar, som kan skäras utan oro. Större, rosa (vävnad) färgade trådar bör utvärderas med försiktighet, eftersom de kan vara trabeculae som kan isoleras.</li>
	<li>Fäst den fria väggen i triangeln med höger kammare på skålen för att exponera höger kammare (figur 3C).</li>
	<li>Sök i det exponerade endokardiet med en fristående trabeculae med en tunn (<500 μm diameter) men inte skarp ände med en glaspipett som har smälts och formats med en tunn (500 μm diameter) (figur 3C). OBS: En fristående trabecula är en muskelremsa som man helt kan sondera under. Använd trabeculae som har parallella sidor (konstant bredd), undvik triangulära papillära muskler. Var försiktig under denna process och efterföljande dissektion, eftersom applicering av belastning på trabecula kan orsaka skador, vilket minskar den utvecklade kraften.</li>
	<li>Dissekera trabecula med en liten Vannas-sax. Lämna en ≥1 mm tärnad bit vävnad i varje ände av trabecula för att möjliggöra fastsättning. Sträck inte trabecula där det är möjligt och minimera kontakt med metallverktyg, eftersom båda också kan orsaka skador på muskeln. Flytta stiften som håller hjärtat efter behov för att minimera belastningen på muskeln nära de identifierade trabeculae.</li>
	<li>Skär ~ 2 tum av änden av en 7 ml överföringspipett, dra långsamt trabecula i pipetten och överför den till en ny vågskål innehållande 50% perfusionslösning och 50% modifierad Tyrodes lösning. Låt muskeln balansera till ökningen av extracellulärt kalcium i den blandade lösningen i flera minuter.<ol><li>Upprepa steg 3.7-3.8 för att dissekera ytterligare trabecula just nu, för att få ytterligare trabecula som säkerhetskopia.</li>
	</ol></li>
	<li>Stäng av pumpen som levererar superfusion och/eller sug till experimentkammaren. Använd den stora borröverföringspipetten och flytta trabecula till experimentkammaren fylld med Tyrodes lösning.</li>
	<li>Fäst en >1 mm kubbit vävnad i slutet av trabecula till en krok på kraftgivaren och fäst sedan den andra kuben på motorn. OBS: Separera motorn och kraftgivaren när du monterar den första sidan för bättre åtkomst till givaren, flytta sedan krokarna så nära varandra som möjligt när du monterar den andra kuben av vävnad medan trabecula förblir slak.</li>
	<li>Starta om superfusion och börja stimulera muskeln för att bestämma tröskelspänningen. Takt vid 20% över tröskelspänningen i cirka 1 h för att tillåta trabecula att balansera.</li>
	<li>I slutet av denna jämviktsperiod, sträck långsamt muskeln med hjälp av mikrometern ansluten till motorn tills optimal utvecklad spänningsgenerering uppnås genom att observera den utvecklade (minsta till topp) spänningen. Sluta öka muskellängden när den passiva diastoliska spänningen stiger snabbare än toppspänningen, vilket indikerar att den optimala längden har passerats.</li>
	<li>Stäng av den överförda mikroskopbelysningen och belysa trabecula med en svanhalsbelysning i en brant vinkel. Använd en kamera ansluten via mikroskopoptiken som tidigare har kalibrerats, fånga en bild av trabecula under diastole i experimentmappen. Om trabecula är bredare än kamerans synfält, ta flera bilder över muskeln.</li>
	<li>Öppna bilden/bilderna i ett bildhanteringsprogram som rapporterar pixelavstånd.<ol><li>Mät pixlarnas avstånd för muskeldiametern fyra gånger längs dess längd. Mät muskellängden (trabecula) i pixlar, exklusive den stora kuben av vävnad.</li>
		<li>Om muskellängden är längre än synfältet, använd referenspunkter längs muskeln för att mäta hela längden.</li>
	</ol></li>
	<li>Använd mallen i experimentmappen, beräkna medelvärdet av diametermåtten och konvertera diametern och längderna från pixlar till mm med hjälp av en tidigare erhållen kalibrering. Beräkna tvärsnittsarean som π * diameter 2/4 i mm2 och muskellängden i μm.</li>
</ol>4. Insamling av uppgifter
<ol><li>När muskeln är i jämvikt öppnar du datainsamlingsprogramvaran, väljer Experiment | Längdkontroll och ange den kalibrerade trabeculalängden (FL) och tvärsnittsarean (area [m2]) i rutan Kalibrering.</li>
	<li>Från mallmappen (steg 1.7) kontrollerar du att freeform_file.txt pekar på rätt mapp och öppnar filen freeform.dap i en textredigerare. Ange isotonisk nivå (isoton) till 32 000 i *.dap-filen.</li>
	<li>I rutan Längdkontroll väljer du fliken Frihand och bläddrar till lämplig frihandslistfil. Se till att sökvägen för dataarkivering också är rätt mapp för att spara data. Börja hämta data från helt isometriska ryckningar genom att trycka på Run Experiment innan du hämtar belastningsklämdata med hjälp av en återkopplingskontroll med proportionella parametrar och integreringsförstärkningsparametrar.</li>
	<li>Hämta belastningsfastklämda data genom att definiera efterbelastningen (isoton) i *.dap-filen och iterera värden för proportionella förstärknings- (propgain) och integrationsparametrar (Ki) genom att spara filen i textredigeraren. Tryck på Kör experiment i gränssnittet för datainsamlingsprogramvaran.<ol><li>Se till att klämman inkluderar förlängning tillbaka till sin ursprungliga längd (ibland kallad avkopplingsbelastning5) under denna iteration för att uppnå maximalt töjningshastigheter, genom att ställa in läge (flswitch) från ett och öka tröskeln för att avsluta lastklämman (flthreshold) från noll.</li>
	</ol></li>
	<li>Kontrollera lastklämmans ände genom att ändra läget (flswitch) från ett till noll. Upprepa förvärvet medan du ändrar änden av lastklämman från nollförlängning till fullständig förlängning tillbaka till startlängden.<ol><li>För att öka längden, öka stegvis tröskeln för att avsluta belastningsklämman (flthreshold) från noll tills muskeln nästan förlängs tillbaka till sin ursprungliga längd.</li>
	</ol></li>
	<li>Återställ läget (flswitch = 1) och tröskeln (flthreshold = 0) och kör en sista datainsamling.</li>
	<li>Om så önskas, modifiera efterbelastningen i studien genom att upprepa steg 4.4-4.6. Detta förvärv kan ske omedelbart.</li>
	<li>Om så önskas, modifiera förspänningen genom att sträcka eller förkorta muskeln, eller behandla muskeln genom att tillsätta föreningar till Tyrodes lösning. Om du ändrar förspänningen eller lägger till föreningar, vänta minst 20 minuter för att säkerställa att den långsamma kraftresponsen 9,15 har stabiliserats och/eller för att föreningen ska tränga in i muskeln helt.</li>
	<li>När datainsamlingen är klar tar du bort trabecula. Om det behövs, frys eller fixa trabecula för biokemisk eller histologisk analys.</li>
	<li>Rengör arbetsområdena och experimentsystemet, spola alla slangar med vatten och stäng av alla komponenter.</li>
</ol>5. Analys av data
<ol><li>Öppna datafilerna med ett kvantitativt analysprogram genom att rikta programmet till lämplig filväg.</li>
	<li>Kvantifiera avslappning genom att säkerställa att dataanalysprogrammet analyserar det fastspända slaget och att programmet korrekt förvärvar starten av belastningsklämman.<ol><li>Se till att belastningsklämmans ände identifieras, så att relaxeringshastigheten (1/τ) kvantifieras från det maximala negativa spänningsderivatet under en isometrisk avkoppling.</li>
		<li>Använd Glantz-metoden16 för att bestämma denna exponentiella tidskonstant, eller annan lämplig kvantifiering av avkoppling (minsta derivat av stress, logistisk tidskonstant17 eller kinematisk modell18).</li>
	</ol></li>
	<li>Se till att dataanalysprogrammet beräknar töjningshastigheten genom att ta tidsderivatan av stammen, där töjningen beräknas som längden som en funktion av tiden dividerat med längden vid optimal sammandragning.</li>
	<li>Upprepa stegen ovan för alla spår av ett givet tillstånd.</li>
	<li>Plotta förhållandet mellan relaxeringshastigheten och töjningshastigheten, vilket begränsar maximala data till en fysiologisk töjningshastighet på mindre än 1 s-1. Exkludera data vid låga töjningshastigheter (figur 4C), eftersom avslappningsfasen kanske inte återspeglar det exponentiella sönderfallet17,18.</li>
	<li>Hämta lutningen på linjen mellan avkopplingshastigheten och töjningshastigheten och registrera lutningen som index för MCR.</li>
	<li>Upprepa ovanstående analys för varje förhörd tillstånd.</li>
</ol>

<ol>
	<li>Iribe, G., Helmes, M., Kohl, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Force-length+relations+in+isolated+intact+cardiomyocytes+subjected+to+dynamic+changes+in+mechanical+load.">Force-length relations in isolated intact cardiomyocytes subjected to dynamic changes in mechanical load.</a> American Journal of Physiology. Heart and Circulatory Physiology. 292 (3), 1487-1497 (2007).</li><li>Dowrick, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Work-loop+contractions+reveal+that+the+afterload-dependent+time+course+of+cardiac+Ca(2+)+transients+is+modulated+by+preload.">Work-loop contractions reveal that the afterload-dependent time course of cardiac Ca(2+) transients is modulated by preload.</a> Journal of Applied Physiology. 133 (3), 663-675 (2022).</li><li>ter Keurs, H. E., Rijnsburger, W. H., van Heuningen, R., Nagelsmit, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tension+development+and+sarcomere+length+in+rat+cardiac+trabeculae.+Evidence+of+length-dependent+activation.">Tension development and sarcomere length in rat cardiac trabeculae. Evidence of length-dependent activation.</a> Circulation Research. 46 (5), 703-714 (1980).</li><li>Sonnenblick, E. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Force-velocity+relations+in+mammalian+heart+muscle.">Force-velocity relations in mammalian heart muscle.</a> The American Journal of Physiology. 202, 931-939 (1962).</li><li>Brutsaert, D. L., Rademakers, F. E., Sys, S. U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Triple+control+of+relaxation:+implications+in+cardiac+disease.">Triple control of relaxation: implications in cardiac disease.</a> Circulation. 69 (1), 190-196 (1984).</li><li>Taberner, A. J., Han, J. C., Loiselle, D. S., Nielsen, P. M. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+innovative+work-loop+calorimeter+for+in+vitro+measurement+of+the+mechanics+and+energetics+of+working+cardiac+trabeculae.">An innovative work-loop calorimeter for in vitro measurement of the mechanics and energetics of working cardiac trabeculae.</a> Journal of Applied Physiology. 111 (6), 1798-1803 (2011).</li><li>De Tombe, P. P., Little, W. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inotropic+effects+of+ejection+are+myocardial+properties.">Inotropic effects of ejection are myocardial properties.</a> Am J Physiol. 266, 1202-1213 (1994).</li><li>Chung, C. S., Hoopes, C. W., Campbell, K. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Myocardial+relaxation+is+accelerated+by+fast+stretch,+not+reduced+afterload.">Myocardial relaxation is accelerated by fast stretch, not reduced afterload.</a> Journal of Molecular and Cellular Cardiology. 103, 65-73 (2017).</li><li>Schick, B. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reduced+preload+increases+Mechanical+Control+(strain-rate+dependence)+of+Relaxation+by+modifying+myosin+kinetics.">Reduced preload increases Mechanical Control (strain-rate dependence) of Relaxation by modifying myosin kinetics.</a> Archives of Biochemistry and Biophysics. 707, 108909 (2021).</li><li>Parikh, S. S., Zou, S. Z., Tung, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Contraction+and+relaxation+of+isolated+cardiac+myocytes+of+the+frog+under+varying+mechanical+loads.">Contraction and relaxation of isolated cardiac myocytes of the frog under varying mechanical loads.</a> Circulation Research. 72 (2), 297-311 (1993).</li><li>Dowrick, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Simultaneous+brightfield,+fluorescence,+and+optical+coherence+tomographic+imaging+of+contracting+cardiac+trabeculae+ex+vivo.">Simultaneous brightfield, fluorescence, and optical coherence tomographic imaging of contracting cardiac trabeculae ex vivo.</a> Journal of Visualized Experiments. (176), e62799 (2021).</li><li>Wiggers, C. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Studies+on+the+consecutive+phases+of+the+cardiac+cycle+I.+The+duration+of+the+consecutive+phases+of+the+cardiac+cycle+and+the+criteria+for+their+precise+determination.">Studies on the consecutive phases of the cardiac cycle I. The duration of the consecutive phases of the cardiac cycle and the criteria for their precise determination.</a> American Journal of Physiology-Legacy Content. 56 (3), 415-438 (1921).</li><li>Rosen, B. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Late+systolic+onset+of+regional+LV+relaxation+demonstrated+in+three-dimensional+space+by+MRI+tissue+tagging.">Late systolic onset of regional LV relaxation demonstrated in three-dimensional space by MRI tissue tagging.</a> American Journal of Physiology. Heart and Circulatory Physiology. 287 (4), 1740-1746 (2004).</li><li>Saito, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+differences+in+left+ventricular+torsional+behavior+between+patients+with+hypertrophic+cardiomyopathy+and+hypertensive+heart+disease.">The differences in left ventricular torsional behavior between patients with hypertrophic cardiomyopathy and hypertensive heart disease.</a> International Journal of Cardiology. 150 (3), 301-306 (2011).</li><li>Monasky, M. M., Biesiadecki, B. J., Janssen, P. M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Increased+phosphorylation+of+tropomyosin,+troponin+I,+and+myosin+light+chain-2+after+stretch+in+rabbit+ventricular+myocardium+under+physiological+conditions.">Increased phosphorylation of tropomyosin, troponin I, and myosin light chain-2 after stretch in rabbit ventricular myocardium under physiological conditions.</a> Journal of Molecular and Cellular Cardiology. 48 (5), 1023-1028 (2010).</li><li>Raff, G. L., Glantz, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Volume+loading+slows+left+ventricular+isovolumic+relaxation+rate.+Evidence+of+load-dependent+relaxation+in+the+intact+dog+heart.">Volume loading slows left ventricular isovolumic relaxation rate. Evidence of load-dependent relaxation in the intact dog heart.</a> Circulation Research. 48, 813-824 (1981).</li><li>Matsubara, H., Takaki, M., Yasuhara, S., Araki, J., Suga, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Logistic+time+constant+of+isovolumic+relaxation+pressure-time+curve+in+the+canine+left+ventricle.+Better+alternative+to+exponential+time+constant.">Logistic time constant of isovolumic relaxation pressure-time curve in the canine left ventricle. Better alternative to exponential time constant.</a> Circulation. 92 (8), 2318-2326 (1995).</li><li>Chung, C. S., Kovacs, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Physical+determinants+of+left+ventricular+isovolumic+pressure+decline:+model+prediction+with+in+vivo+validation.">Physical determinants of left ventricular isovolumic pressure decline: model prediction with in vivo validation.</a> American Journal of Physiology. Heart and Circulatory Physiology. 294 (4), 1589-1596 (2008).</li><li>Campbell, K. B., Kirkpatrick, R. D., Tobias, A. H., Taheri, H., Shroff, S. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Series+coupled+non-contractile+elements+are+functionally+unimportant+in+the+isolated+heart.">Series coupled non-contractile elements are functionally unimportant in the isolated heart.</a> Cardiovascular Research. 28 (2), 242-251 (1994).</li><li>Raman, S., Kelley, M. A., Janssen, P. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effect+of+muscle+dimensions+on+trabecular+contractile+performance+under+physiological+conditions.">Effect of muscle dimensions on trabecular contractile performance under physiological conditions.</a> Pflugers Archiv: European Journal of Physiology. 451 (5), 625-630 (2006).</li><li>Czeiszperger, T. L., Wang, M. P., Chung, C. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Membrane+stabilizer+Poloxamer+188+improves+yield+of+primary+isolated+rat+cardiomyocytes+without+impairing+function.">Membrane stabilizer Poloxamer 188 improves yield of primary isolated rat cardiomyocytes without impairing function.</a> Physiol Rep. 8 (4), 14382 (2020).</li><li>Louch, W. E., Sheehan, K. A., Wolska, B. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Methods+in+cardiomyocyte+isolation,+culture,+and+gene+transfer.">Methods in cardiomyocyte isolation, culture, and gene transfer.</a> Journal of Molecular and Cellular Cardiology. 51 (3), 288-298 (2011).</li><li>Loiselle, D. S., Johnston, C. M., Han, J. C., Nielsen, P. M. F., Taberner, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Muscle+heat:+a+window+into+the+thermodynamics+of+a+molecular+machine.">Muscle heat: a window into the thermodynamics of a molecular machine.</a> American Journal of Physiology. Heart and Circulatory Physiology. 310 (3), 311-325 (2016).</li><li>de Tombe, P. P., ter Keurs, H. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Force+and+velocity+of+sarcomere+shortening+in+trabeculae+from+rat+heart.+Effects+of+temperature.">Force and velocity of sarcomere shortening in trabeculae from rat heart. Effects of temperature.</a> Circulation Research. 66 (5), 1239-1254 (1990).</li><li>Palmer, B. M., Bell, S. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preparing+excitable+cardiac+papillary+muscle+and+cardiac+slices+for+functional+analyses.">Preparing excitable cardiac papillary muscle and cardiac slices for functional analyses.</a> Frontiers in Physiology. 13, 817205 (2022).</li><li>Brunello, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Myosin+filament-based+regulation+of+the+dynamics+of+contraction+in+heart+muscle.">Myosin filament-based regulation of the dynamics of contraction in heart muscle.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 117 (14), 8177-8186 (2020).</li></ol>

Mekanisk kontroll av avslappning (MCR) kvantifierar beroendet av myokardavslappningshastigheten på muskelns spänningshastighetsom fortsätter avslappning 8,9. Töjningshastighet, snarare än efterbelastning, är både nödvändig och tillräcklig för att modifiera avkopplingshastigheten8. Eftersom interventioner för att modifiera kalciumhastigheten inte har visat sig avsevärt förbättra hjärtavslappning, kan mekanisk intervention ge nya insikter i mekanismen och ge en ny behandling för diastolisk dysfunktion.
Protokollet för att modifiera myokardbelastningshastigheten som beskrivs här använder en isoton belastningsklämma 8,9. En styrka hos den isotoniska belastningsklämman är den kvantitativa kontrollen av efterbelastningsspänningen. Windkessel-liknande protokoll kan användas för att ytterligare undersöka förändringar i efterbelastning, förspänning och hjärtarbete 2,6,7. En ramp som inte styrs av lastklämman kan också användas för att bättre isolera förändringen i töjning från töjningshastighet. Oavsett verkar efterbelastningen i sig inte vara en stark modifierare av avkopplingsgraden8.
Protokollet kan också anpassas för att närma sig mer fysiologiska förhållanden för temperatur och tempohastighet. De aktuella protokolldetaljerna användes för att visa förekomsten av MCR. Genomförande av experiment under fysiologiska förhållanden rekommenderas generellt beroende på experimentfrågan. Experiment som utförs vid 37 ° C, eller vid höga tempohastigheter, kan dock snabbare inducera rundown (skada) på muskeln. En lösning med förbättrad syrebärande kapacitet kan behövas. Vidare måste datainsamlingen kunna sampla längden och kraften tillräckligt snabbt för att lösa de snabba ryckningarna och ge återkopplingskontroll.
Det nuvarande protokollet beskriver inte mätningen av kalcium eller mätningen och kontrollen av sarkomerlängder. Kalciummätningar har behandlats i andra protokoll11, medan sarkomerlängdmätning kan läggas till med lämplig utrustning. Sarkomerlängdkontroll används inte i nuvarande MCR-studier, eftersom muskellängd är den mest korrelativa parametern till det kliniska tillståndet19. Ytterligare sarkomerlängdskontroll (kontra muskellängdskontroll) skulle ge specifika svar på kinetiska frågor, men det är osannolikt att det kommer att lägga till translationell kunskap på grund av variation mellan sarkomer och minsta förståelse av sarkomerlängdförändringar in vivo.
Tre experimentella överväganden belyses här för att öka reproducerbarheten av data.
För det första kan fristående hjärttrabeculae vara svåra att hitta hos vissa djur (opublicerade resultat och meddelanden). Medan ryckande muskler kan hittas hos de flesta råttor, är en rimlig framgångsgrad för att erhålla data från trabecula hos råttor en av tre. Trabecula framgång kan vara högre med Brown Norway x Lewis F1 råttor, som också har använts historiskt20 och rapporterats ha fler trabeculae (opublicerade meddelanden). För möss är framgångsgraden sannolikt lägre, med mindre än en av 10 förväntas för möss från en BL / 6-bakgrund; En högre frekvens förväntas dock för möss med FVBN-bakgrund (opublicerad kommunikation och observationer).
För det andra kan skador på musklerna minska produktionen. Om de utvecklade krafterna är mindre än 10 mN mm-2 vid 25 °C och 0,5 Hz pacing, kan utredare behöva utföra felsökning för att bedöma om oavsiktlig sträckning eller kontakt mellan metallpincett och muskler uppstår, om lösningar inte är ordentligt förberedda eller om pacing eller experimentell utrustning fungerar korrekt. Andra protokoll som använder intakt trabecula har föreslagit att använda Luer-lock-sprutor som överföringskärl11. Även om detta är möjligt, särskilt om användaren kontrollerar en mycket långsam flödeshastighet eller mindre muskelsegment, använder det nuvarande protokollet en mycket större borrningsöverföringspipett för att minimera eventuella skador. Ett annat steg där ischemisk skada kan uppstå är under dissektion. Aortan ska kanyleras och spolas med perfusionslösning inom 3 minuter efter det första buksnittet (råtta) eller cervikal dislokation (mus), liknande gränserna som anges i kardiomyocytisoleringsprotokoll21,22. Detta minimerar tiden då hjärtvävnaden inte utsätts för den kardioplegiliknande perfusionslösningen. Vidare producerar dissektioner som varar mer än 30 minuter i allmänhet inte ryckande trabecula. Således bör operatörerna öva snabb men noggrann dissektion för att minimera skador. En tvärsnittsarea över 0,2 mm 2 (2 x 10-7 m2) kan drabbas av kärnischemi20.
För det tredje bör det sätt på vilket muskler är fästa vid motor- och kraftgivaren beaktas. Detta protokoll fokuserar för närvarande på krokar och fristående trabeculae. Den ibland snabba belastningshastigheten för sträckan före avslappning kan få en muskel att glida om den inte fästs ordentligt, varför det nuvarande protokollet inte använder "korgar" för att hålla trabecula23,24. Alternativa monteringsmetoder (lim, klämmor etc25,26) kan också övervägas och valideras. Protokollet som beskrivs här använder trabeculae och inte papillära muskler. Papillärmuskelns ackordae inducerar en serieelasticitet som kan hämma förändringar i MCR9. Det är dock osannolikt att den exakta placeringen av fästena i muskeln påverkar åtgärderna, eftersom trabeculalängden (och diametern) varierar avsevärt.
En begränsning med att genomborra muskeländarna med krokar är att själva monteringspunkten också kan skadas. Möjlig rivning av den fästa muskelvävnaden med frekventa sammandragningar (beroende på deras styrka) kan ändra längden eller seriens elasticitet. Denna rivhastighet är svår att kontrollera. På samma sätt kan skador på vävnaden och kroken förvärras under sträckning, vilket också kan orsaka problem. Okulär inspektion och de utvecklade kraftvärden som återstår >80% av den jämviktade isometriska kraften bör användas för att bedöma om preparatet är skadat och bör uteslutas.
En annan begränsning eller övervägande påverkar vilka experimentella frågor som kan besvaras med metoden. Tänk till exempel på användningen av 2,3-butandionmonoxim (BDM) i perfusionslösningen. BDM är ett fosfatas, vilket kan förändra muskelns funktion. Dessutom innebär den långa lossningsperioden och bristen på pacing att det latenta fosforyleringstillståndet sannolikt har förändrats. Således bör försiktighet iakttas om man försöker direkt bedöma ett djurs muskelkontraktilitet (jämfört med skillnader mellan genotyper eller behandlingar), eftersom kontraktiltillståndet sannolikt har förändrats. Effekten av fosforylering kan dock bedömas farmakologiskt genom tillägg av en agonist eller antagonist till vägen.
Sammanfattningsvis ger MCR insikt i hur avslappning regleras av muskelrörelser (töjningshastighet). MCR kan bidra till att ge bättre insikt i diagnos och övervakning av diastolisk sjukdom, tillsammans med mål för farmakologisk intervention, såsom modifiering av myosinkinetik. Protokollet och råden som beskrivs här beskriver kunskap som utvecklats under flera års försök och bör vara tillämpliga på andra system och modeller av hjärtsjukdom.

Hjärtavslappningen är nedsatt vid nästan alla former av hjärtsvikt (inklusive hjärtsvikt med reducerad ejektionsfraktion) och vid många hjärt-kärlsjukdomar. Förutom många metoder för att utvärdera hjärtfunktionen i permeabiliserade muskler blir utvärderingen av intakta hjärtmuskler intressant. Sådana vävnader bedöms lossade (ändarna är fria att dra ihop sig) eller laddade (längd eller kraft kontrolleras). Historiskt har intakta isolerade myocyter utvärderats i ett obelastat tillstånd, där cellkroppen är fri att förkorta under sammandragning. Intakta hjärttrabeculae utvärderas ofta under isometriska förhållanden, där längden inte får ändras, men stress (kraft per tvärsnittsarea) genereras. Både intakta myocyt- och trabeculae-metoder börjar konvergera med modifieringar av belastning 1,2.
Protokoll för belastningsklämning av en muskel (dvs. kontroll av en muskels utvecklade spänning vid ett specificerat värde som simulerar fysiologiska efterbelastningar) har utvecklats under flera decennier 3,4,5. I intakta hjärtvävnader tillåter belastningsklämmor forskare att närmare efterlikna in vivo-hjärtcykeln med isotonisk eller Windkessel-liknande efterbelastning 6,7,8,9. Målet med detta protokoll är att erhålla data som används för att kvantifiera MCR (dvs. töjningsfrekvensberoendet av relaxeringshastigheten)8,9.
Medan MCR-protokollet har anpassats från tidigare arbete, är fokus för detta protokoll (jämfört med liknande protokoll som använder intakta hjärtvävnader) på biomekaniska mekanismer som modifierar avkoppling. Det finns flera protokoll som använder lastklämning 3,4,5,7,10 och protokoll som fokuserar på Windkessel-modellerna 1,2,11, men detta protokoll beskriver specifikt hur stretch före avkoppling modifierar avslappningshastigheten. Vi har visat att denna kontroll sker under en proto-diastolisk period8, en fas som ursprungligen beskrevs av Wiggers12. I normala friska hjärtan genomgår myokardiet en förlängande belastning under utstötning före stängning av aortaklaffen (dvs. före isovolumisk avkoppling)13. Detta efterliknas genom att förlänga varaktigheten av efterbelastningskontrollen tills muskeln börjar sträcka sig. Kliniska bevis tyder på att denna förlängning kan försvagas eller förloras i sjukdomstillstånd14, och konsekvenserna och mekanismerna för förändrade endsystoliska stamhastigheter har inte helt klarlagts. Med tanke på de glesa behandlingsalternativen för diastoliska sjukdomar och hjärtsvikt med en bevarad ejektionsfraktion, menar vi att MCR kan ge insikt i nya mekanismer som ligger bakom nedsatt avslappning.
Medan den grova dissektionen som beskrivs här fokuserar på gnagare, kan trabeculaisolering utföras från vilket intakt hjärta som helst och har tidigare använts med en human hjärttrabecula8. På samma sätt kan datainsamlingen och analysen också tillämpas på kardiomyocyter eller andra isolerade muskeltyper 1,10. Diskussionen innehåller kommentarer om möjliga förändringar och anpassningar av metoden, tillsammans med begränsningar, såsom försiktighet mot att använda papillära muskler på grund av de mekaniska egenskaperna hos chordae9.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>18 or 16 gauge blunted needle/canula</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>for cannulation of rat aorta, use 1mm of PE160 or PE205 tubing as stop</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2,3-Butanedione Monoxime</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>B0753-25G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>23 gauge blunted needle/canula</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>for cannulation of mouse aorta, use 1mm of PE50 tubing as stop</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5 mL syringe</td>
			<td>BD Luer-Lock</td>
			<td>309646</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>95% Oxygen/5% CO2</td>
			<td>AirGas</td>
			<td>Z02OX9522000043</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anethesia system</td>
			<td>EZ Systems</td>
			<td>EZ-SA800</td>
			<td>Can use any appropriate anethesia method/system</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine Serum Albumin</td>
			<td>Fisher BioReagents</td>
			<td>BP-1600</td>
			<td>to coat tips of fine forcepts, scissors</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Calcium Chloride Dihydrate</td>
			<td>Fisher Chemical</td>
			<td>C79-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Containers/dissection dishes</td>
			<td>FisherBrand</td>
			<td>08-732-113</td>
			<td>Weigh dishes for creating dissection plates</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Crile Hemostat</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>13005-14</td>
			<td>for mouse gross dissection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D-(+)-Glucose</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G8270-1KG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Data acquisition software</td>
			<td>SLControl</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Data acquisition system</td>
			<td>MicrostarLabs</td>
			<td>DAP5216a</td>
			<td>Can use any DAQ.&#160; This is a PCI based data acqusition for use with SLControl; must have a PC with a PCI slot</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Data analysis software</td>
			<td>Mathworks</td>
			<td>Matlab</td>
			<td>Custom Script</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dumont #3 Forceps</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>11231-30</td>
			<td>2x for cannulation of aorta</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dumont #5 Forceps</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>11254-20</td>
			<td>2x for trabecula isolation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Experimental system</td>
			<td>Aurora Scientific</td>
			<td>801C</td>
			<td>Can use any appropriate experimental chamber with force and length control</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fine Scissors, curved</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>14061-09</td>
			<td>for removal of heart</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gooseneck Piggyback Illuminator</td>
			<td>AmScope</td>
			<td>LED-6WA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>H3375-250G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Imaging software</td>
			<td>IrfanView</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Iris Forceps</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>15915</td>
			<td>for removal of heart</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isoflurane</td>
			<td>VetOne</td>
			<td>502017</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnesium Chloride Hexahydrate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>M2670-100G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnesium Sulfate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>M7506-500G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mayo Scissors</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>14110-15</td>
			<td>for rat gross dissection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Metzenbaum Scissors</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>14116-14</td>
			<td>for mouse gross dissection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope connected camera</td>
			<td>Flir</td>
			<td>BFS-U3-27S5M-C</td>
			<td>Includes acquisition software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope/digital imaging system</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>IX-73</td>
			<td>Can use any appropriate microscope.&#160; Needed to measure muscle length, cross sectional area</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mounting Pin/Needle</td>
			<td>BD PrecisionGlide</td>
			<td>305136</td>
			<td>For holding heart to dish.&#160; 27 G x 1-1/4</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mounting Pin/Needle</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>26000-40</td>
			<td>For holding heart to dish. 0.4mm diameter insect pin (Alt to 27G needle)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Oxygen (O2)</td>
			<td>AirGas</td>
			<td>OX USP300</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Peristaltic Pump</td>
			<td>Rainin</td>
			<td>Rabbit</td>
			<td>Can be any means to create flow in experimental chamber</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pH and Oxygen sensor</td>
			<td>Mettler Toledo</td>
			<td>SevenGo pH and DO</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium Bicarbonate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>237205-100G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium Chloride</td>
			<td>Fisher Chemical</td>
			<td>P217-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium Phosphate Monobasic</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>795488-500G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rochester-pean Hemostat</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>501708</td>
			<td>for rat gross dissection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Silk Suture, Size: 4/0</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>18020-40</td>
			<td>cut to ~1.5 inch pieces, soaked in water</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Bicarbonate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S6297-250G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Chloride</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S9888-1KG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Hydroxide</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S8045-500G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Phosphate Dibasic</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S7907-100G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stereomicroscope</td>
			<td>AmScope</td>
			<td>SM-1TX</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Student Vannas Spring Scissors&#160;</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>91500-09</td>
			<td>for opening of the RV</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SYLGARD 184 Silicone Elastomer Base</td>
			<td>Dow Corning</td>
			<td>3097358-1004</td>
			<td>For creating dissection plates</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringe Holder</td>
			<td>Harbor Frieght</td>
			<td>Helping Hands 60501</td>
			<td>Can be used as alternate for ring stand</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Taurine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T0625-1KG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Transfer Pipette</td>
			<td>FisherBrand</td>
			<td>13-711-7M</td>
			<td>cut ~1&#34; from tip to widen bore</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vannas Spring Scissors</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>15000-00</td>
			<td>for trabecula isolation</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

mechanical control of relaxation using intact cardiac trabeculae

Diastolisk dysfunktion är en vanlig fenotyp över kardiovaskulära sjukdomspresentationer. Förutom förhöjd hjärtstyvhet (förhöjt slutdiastoliskt slutdiastoliskt tryck i vänster kammare) är nedsatt hjärtavslappning en viktig diagnostisk indikator på diastolisk dysfunktion. Medan avkoppling kräver avlägsnande av cytosoliskt kalcium och deaktivering av sarkomeriska tunna filament, har inriktning på sådana mekanismer ännu inte gett effektiva behandlingar. Mekaniska mekanismer, såsom blodtryck (dvs efterbelastning), har teoretiserats för att modifiera avslappning. Nyligen visade vi att modifiering av töjningshastigheten för en sträcka, inte efterbelastning, var både nödvändig och tillräcklig för att modifiera den efterföljande avslappningshastigheten för myokardvävnad. Spänningsberoendet av avkoppling, kallad mekanisk kontroll av avkoppling (MCR), kan bedömas med hjälp av intakta hjärttrabeculae. Detta protokoll beskriver beredningen av en liten djurmodell, experimentellt system och kammare, isolering av hjärtat och efterföljande isolering av en trabecula, förberedelse av experimentkammaren och experimentella och analysprotokoll. Bevis för att förlänga stammar i det intakta hjärtat tyder på att MCR kan ge nya arenor för bättre karakterisering av farmakologiska behandlingar, tillsammans med en metod för att bedöma myofilamentkinetik i intakta muskler. Därför kan studier av MCR belysa en väg till nya tillvägagångssätt och nya gränser vid behandling av hjärtsvikt.

En representativ datauppsättning visas i figur 4, och ytterligare resultat finns i tidigare publikationer 8,9. Kortfattat beräknas töjningshastigheten från derivatet av stammen, strax före isometrisk avkoppling. Töjning är längden som en funktion av tiden dividerat med muskelns längd vid optimal längd. Relaxeringshastigheten beräknas som 1/τ, där τ är den exponentiella tidskonstanten16. Flera töjningshastigheter och deras resulterande avslappningshastigheter krävs för att bestämma den mekaniska kontrollen av avkoppling (MCR). Dessa data plottas på en avslappningshastighet kontra töjningshastighet. Linjens lutning ger MCR-indexet.
Observera att slutet systolisk och diastolisk stam priser är inte sannolikt att överstiga 1 s-1. Därför bör lutningen endast innehålla töjningshastigheter < 1 s-1. Relaxeringshastigheten vid låga töjningshastigheter kan förväxlas av förändringar i minimitidsderivatan av stress (dStress/dtmin), och i dessa fall kan data från sträckor mindre än cirka 0,15 s-1 ignoreras.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64879/64879fig01.jpg"> Figur 1: Inställning av grov dissektion och hjärtkanyleringsområde. Från höger till vänster: a. Anestesiinduktionskammaren för djuret ligger nära dissektionsområdet. b. En snorkel för valfri flyktig gasavskiljare. c. En dissektionsdyna, där djuret kommer att placeras liggande, flankeras av (medurs) d. en noskon, för att ge fortsatt anestesi till gnagaren, e. hemostater, f. kirurgisk sax, g. böjd fin sax placerad för enkel åtkomst med den dominerande (skärande) handen, h. böjda iriscett placerade för enkel åtkomst med den icke-dominerande handen. Gnagarens övre extremiteter kan fästas på dissektionsdynan med tejp, och i. en dissektionsskål (eller liten bägare) med perfusionslösning bör placeras i närheten för att skölja hjärtat. j. Ett område iscensatt för kanylering måste placeras i närheten. En spruta med lämplig kanyl är monterad på ett ringstativ. k. (Infälld) En närmare bild av en 16 G kanyl, med 1 mm PE205-slang fäst och en sutur löst knuten. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64879/64879fig01large.jpg" target="_blank">Klicka här för att se en större version av denna figur.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64879/64879fig02.jpg"> Figur 2: Försöksområde och verktyg . (A) Försöksområde. Experimentkammaren och datainsamlingssystemet förbereds på ett närliggande inverterat mikroskop (vänster). Trabecula isolering och montering sker under ett stereoskop (höger). (B) Tips på två pincett, stora och små Vannas sax och en anpassad glassond bereds genom blötläggning i 10% BSA-lösning. (C) Ytterligare dissektionsverktyg. En silikonelastomerpläterad skål gör det möjligt att montera hjärtat under fin dissektion. En 7 ml överföringspipett med ändskärning visas under skålen och glassonden. Överföringspipettens skärspets kasseras och en förstorad borrning används för att överföra muskeln, med minimal risk för sträckning eller uttorkning. (D) Förstorad bild av änden av en glaspipett, som är ungefär 2 mm lång och 0,25-0,5 mm i diameter. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64879/64879fig02large.jpg" target="_blank">Klicka här för att se en större version av denna figur.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64879/64879fig03.jpg"> Figur 3: Guide till dissektion. (A) Grov dissektion bör börja med ett tvärsnitt (1. grönt) genom huden in i bukhålan under xyphoidprocessen (nedre revben och xyphoid indikeras med en tunn grå linje). Parasagittala snitt från bukhålan upp i bröstkorgen bör följa (2. kricka och 3. blå linjer), varefter membranet ska skäras. En hemostat kan sedan användas för att klämma fast xyphoidprocessen och höja bröstväggen mot huvudet. (B) Ett intakt råtthjärta fäst vid en kisel-elastomerskål, orienterad med utsikt över höger ventrikulär utflödeskanal (RVOT), höger förmak (RA), aorta (Ao) och vänster förmak (LA). Den första uppsättningen nedskärningar bör vara från RVOT till toppen längs septum (1. Gul linje). En andra uppsättning nedskärningar bör vara från RVOT längs hjärtats bas och sedan över höger förmak (2. orange linje). (C) RVOT kan försiktigt dras bort från aortan för att öppna hjärtat och fästa det tillbaka. Gula och orange linjer motsvarar de styckningsdelar som beskrivs i B. Fristående trabeculae finns ofta nära basen av RV-fri vägg och nära septum, men kan förekomma var som helst (röda linjer indikerar vanliga platser). (D) Förstorad bild av glassonden under en trabecula (gul pil indikerar skärningspunkten mellan trabecula och sond). (E) En trabecula (röd pil) är monterad på experimentsystemet mellan en kraftgivare (vänster) och motor (mitt-höger) och flankeras av två pacingledningar (horisontellt ovanför och under trabecula). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64879/64879fig03large.jpg" target="_blank">Klicka här för att se en större version av denna figur.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64879/64879fig04.jpg"> Figur 4: Representativa spår och resultat . (A) En enda hjärttrabecula upplyst med en svanhals LED-lampa i en brant (~ 75 °) vinkel från mikroskoplinsens axel, vilket förbättrar kontrasten hos trabecula. I det här exemplet är två bilder sida vid sida för att visa trabeculas fulla längd. (B) Stresstid (överst) och töjningstid (nederst) kurvor för samma trabecula. En isometrisk ryckning, tillsammans med tre belastningsklämryckningar vid ökande systoliska töjningshastigheter visas. c) Representativ MCR-beräkning. MCR definieras som lutningen på linjen mellan relaxeringshastigheten och töjningshastigheten. Som noterats i diskussionen kan töjningshastigheterna begränsas för att ge en kvantitativ, reproducerbar MCR. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64879/64879fig04large.jpg" target="_blank">Klicka här för att se en större version av denna figur.</a>
Tabell 1: Lösningar. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64879/64879_Table1.xlsx" target="_blank">Klicka här för att ladda ner denna tabell.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Mechanical Control of Relaxation Using Intact Cardiac Trabeculae at JoVE.com

Mechanical Control of Relaxation Using Intact Cardiac Trabeculae

Snabb myokard- och hjärtavslappning är avgörande för normal fysiologi. Mekaniska avslappningsmekanismer är nu kända för att vara beroende av töjningshastigheten. Detta protokoll ger en översikt över förvärv och analys av experiment för att ytterligare studera den mekaniska kontrollen av avkoppling.

Mekanisk kontroll av avslappning med intakta hjärttrabeculae

Diastolic dysfunction is a common phenotype across cardiovascular disease presentations. In addition to elevated cardiac stiffness (elevated left ...

Detta protokoll beskriver en metod för att mäta mekanisk kontroll av avslappning eller belastningsberoendet av muskelavslappning i hjärttrabecula. Den största fördelen med denna teknik är att den fokuserar på hjärtavslappning. Med tanke på bristen på behandlingsalternativ för diastoliska sjukdomar kan denna teknik användas för att identifiera nya index och läkemedelsmål relaterade till hjärtavslappning.Denna metod kommer att visas med ett gnagarhjärta, men det kan användas på vilken intakt muskel som helst. Att demonstrera denna procedur kommer att vara jag och Anita Abbo, en forskarassistent i mitt labb. Börja med att ta bort den grovdissekerade smådjursmodellens hjärta från kanylen och placera den i en silikonelastomerbelagd vägskål för att förbereda sig för trabekulär isolering.Placera sedan och belysa hjärtat under ett stereomikroskop. Efter att ha lokaliserat det högra ventrikulära utflödesområdet, stift vänster atrium och ventrikelspetsen till silikonelastomeren i skålen. Använd en lång Vannas-sax och skär från höger kammares utflödeskanal till toppen längs septumet.Därefter skär du från det högra ventrikulära utflödesområdet till det högra atriumet nära aortan och skär sedan genom det högra atriumet. Dra försiktigt upp den högra ventrikulära fria väggen från utflödeskanalen utan att sträcka vävnaden med pincett. Vita tunna bindvävsträngar, om de hittas, kan skäras, men inte de större rosa vävnadssträngarna, eftersom de kan vara trabeculae.Fäst den fria väggen i den högra ventrikeln triangeln till skålen för att exponera höger kammare. Använd en tunn trubbig smält glaspipett och sök i det exponerade endokardiet efter fristående trabeculae utan att applicera tryck. Undvik de triangulära papillära musklerna och välj trabeculae med parallella sidor, som ofta finns nära basen av den högra ventrikulära fria väggen och längs septum.Dissekera trabecula med en liten Vannas-sax och lämna en en millimeter kubisk vävnad i varje ände av trabecula för att möjliggöra fastsättning. Skär sedan ungefär två tum från änden av en sju milliliter överföringspipett, dra långsamt trabecula i pipetten och överför den till en ny vågskål, innehållande 50% perfusionslösning och 50% modifierad Tyrodes lösning. Låt muskeln balansera till ökningen av extracellulärt kalcium i den blandade lösningen i flera minuter.Stäng av pumpen som levererar superfusion eller sug till experimentkammaren. Använd den stora borröverföringspipetten och flytta trabecula till experimentkammaren fylld med Tyrodes lösning. Fäst en kubad bit vävnad i slutet av trabecula till en krok på kraftgivaren och fäst sedan den andra kuben på motorn.Starta om superfusionen och börja stimulera muskeln för att bestämma tröskelspänningen. Tempo vid 20% över tröskelspänningen i ungefär en timme. I slutet av denna jämviktsperiod sträcker du långsamt muskeln med hjälp av mikrometern ansluten till motorn tills optimal utvecklad stressgenerering uppnås genom att observera den utvecklade spänningen.Sluta öka muskellängden när den passiva diastoliska spänningen stiger snabbare än toppspänningen, vilket indikerar att den optimala längden har passerats. Stäng av den överförda mikroskopbelysningen och belysa trabecula med en svanhalsbelysning i en brant vinkel. Använd en tidigare kalibrerad kamera ansluten via mikroskopoptiken, fånga en bild av trabecula under diastole i experimentmappen.Medelvärdet av diametermätningarna och konvertera diametern och längden från pixlar till millimeter med hjälp av en tidigare erhållen kalibrering. Beräkna tvärsnittsarean och muskellängden i mikrometer. I datainsamlingsprogramvaran hämtar du belastningsklämda data genom att definiera efterbelastningen i dap-filen och itererar värden för proportionella förstärknings- och integrationsparametrar genom att spara filen i textredigeraren och tryck sedan på Kör experiment"i gränssnittet.Kontrollera lastklämmans ände genom att ändra läge. Upprepa förvärvet medan du ändrar slutet på lastklämman från noll till komplett, förläng tillbaka till startlängden. För att öka längden, öka stegvis tröskeln för att avsluta lastklämman från noll tills muskeln nästan förlängs tillbaka till sin ursprungliga längd.Om så önskas, ändra efterbelastningen och upprepa förvärvet omedelbart. Om så önskas, modifiera förspänningen genom att sträcka eller förkorta muskeln, eller behandla muskeln genom att tillsätta föreningar till Tyrodes lösning, men vänta minst 20 minuter för att säkerställa att det långsamma kraftsvaret har stabiliserats och för föreningen att helt tränga in i muskeln. När datainsamlingen är klar, ta bort trabecula och rengör experimentsystemet.Kvantifiera avslappning genom att se till att dataanalysprogrammet analyserar den fastspända takten och att programmet korrekt förvärvar starten på lastklämman. Efter kvantifiering av alla spår av ett givet tillstånd, plotta förhållandet mellan relaxeringshastigheten och töjningshastigheten, vilket begränsar maximala data till en fysiologisk töjningshastighet på mindre än en per sekund. Exkludera data vid låga töjningshastigheter, eftersom avslappningsfasen kanske inte återspeglar det exponentiella sönderfallet.Erhåll lutningen på linjen mellan avkopplingshastigheten och töjningshastigheten och registrera lutningen som index för mekanisk styrning av avkoppling. En enda hjärttrabecula upplyst med ett svanhals LED-ljus i en brant vinkel på 75 grader från mikroskoplinsens axel visas här. Spänningstid och töjningstidskurvor för samma trabecula visade en isometrisk ryckning och tre belastningsklämryckningar vid ökande och systoliska töjningshastigheter.Töjningshastigheten beräknas utifrån derivatet av stammen strax före isometrisk avkoppling. Data plottas på en avslappningshastighet kontra töjningshastighetsgraf, där linjens lutning ger mekanisk kontroll av avkoppling, eller MCR-index. Den svåraste komponenten i detta protokoll är en noggrann isolering av hjärttrabecula.Detta protokoll kan kombineras med andra mätningar av muskler, inklusive intracellulärt kalcium, kontraktilitet och sarkomerlängd. Denna metod används också för att identifiera molekylära mekanismer och bättre förstå patofysiologin för nedsatt hjärtavslappning.

Research

JoVE Journal

Medicine

Quantitative Visualization and Detection of Skin Cancer Using Dynamic Thermal Imaging

Kvantitativa Visualisering och detektion av hudcancer Använda dynamiska Värmekameror

In 2010 approximately 68,720 melanomas will be diagnosed in the US alone, with around 8,650 resulting in death 1. To date, the only effective treatment ...

Mesenteric Artery Contraction and Relaxation Studies Using Automated Wire Myography

Mesenteriska Artery kontraktion och Studier Avslappning med hjälp av automatiserade Wire Myography

Proximal resistance vessels, such as the mesenteric arteries, contribute substantially to the peripheral resistance. These small vessels of between ...

Direct Pressure Monitoring Accurately Predicts Pulmonary Vein Occlusion During Cryoballoon Ablation

Direkt Pressure Monitoring förutsäger noggrant Pulmonell venocklusion Under Cryoballoon Ablation

Cryoballoon  ablation (CBA) is an established therapy for atrial fibrillation (AF).  Pulmonary vein (PV) occlusion is essential for achieving antral ...

Early Detection of Drug-Induced Renal Hemodynamic Dysfunction Using Sonographic Technology in Rats

Tidig upptäckt av läkemedelsinducerad njur hemodynamisk dysfunktion Använda sonografisk teknik i råttor

The kidney normally functions to maintain hemodynamic homeostasis and is a major site of damage caused by drug toxicity. Drug-induced nephrotoxicity is ...

Visualization of Streptococcus pneumoniae within Cardiac Microlesions and Subsequent Cardiac Remodeling

Visualization of Streptococcus pneumoniae within Cardiac Microlesions and Subsequent Cardiac Remodeling

Visualisering av<em&gt; Streptococcus pneumoniae</em&gt; Inom Cardiac små sår och efterföljande hjärt ombyggnad

During bacteremia Streptococcus pneumoniae can translocate across the vascular endothelium into the myocardium and form discrete bacteria-filled ...

A Chronic Cardiac Ischemia Model in Swine Using an Ameroid Constrictor

En kronisk kardiell ischemi modell hos svin med en Ameroid Constrictor

Cardiovascular disease remains the number one cause of mortality in the United States. There are numerous approaches to treating these diseases, but ...

Mechanical Ventilation Boot Camp Curriculum

Mekanisk Ventilation Boot Camp läroplan

Medical management of mechanically ventilated patients is challenging to novice providers. Incorrect management of this population may lead to increased ...

Noninvasive Determination of Vortex Formation Time Using Transesophageal Echocardiography During Cardiac Surgery

Icke-invasiv bestämning av Vortex bildandet tid använda Transesophageal ekokardiografi under hjärtkirurgi

Trans-mitral blood flow produces a three-dimensional rotational body of fluid, known as a vortex ring, that enhances the efficiency of left ventricular ...

Normothermic Ex Situ Heart Perfusion in Working Mode: Assessment of Cardiac Function and Metabolism

Normothermic Ex Situ hjärtat Perfusion i arbetar läge: bedömning av hjärtfunktionen och Metabolism

The current standard method for organ preservation (cold storage, CS), exposes the heart to a period of cold ischemia that limits the safe preservation ...

In Vitro Assessment of Cardiac Function Using Skinned Cardiomyocytes

In Vitro Bedömning av hjärtfunktion Använda Skinned Kardiomyocyter

In this article, we describe the steps required to isolate a single permeabilized (&#34;skinned&#34;) cardiomyocyte and attach it to a force-measuring ...