Name: visualizing dna damage repair proteins in patient-derived ovarian cancer organoids via immunofluorescence assays
Uploaded: 2023-02-24T14:20:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Visualizing DNA Damage Repair Proteins in Patient-Derived Ovarian Cancer Organoids via Immunofluorescence Assays at JoVE.com

نحن ممتنون لتوجيهات بافل لوباتشيفسكي ، دكتوراه في إنشاء هذا البروتوكول. نود أيضا أن نعرب عن تقديرنا لكلية الطب بجامعة واشنطن في قسم أمراض النساء والتوليد في سانت لويس وقسم الأورام النسائية ، وبرنامج العميد للباحثين بجامعة واشنطن ، ومؤسسة مجموعة الأورام النسائية ، وبرنامج تطوير علماء الإنجاب لدعمهم لهذا المشروع.

تم الحصول على أنسجة الورم والاستسقاء بعد الحصول على موافقة المريض كجزء من المستودع الحيوي لأورام النساء الذي تمت الموافقة عليه من قبل مجلس المراجعة المؤسسية بجامعة واشنطن في سانت لويس (IRB). تم تضمين المرضى إذا كان لديهم مرحلة متقدمة من سرطان المبيض المصلي عالي الدرجة (HGSOC). تم تنفيذ جميع الإ...

<ol>
	<li>Lheureux, S., Gourley, C., Vergote, I., Oza, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Epithelial+ovarian+cancer.">Epithelial ovarian cancer.</a> Lancet Oncology. 393 (10177), 1240-1253 (2019).</li><li>Tew, W. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PARP+inhibitors+in+the+management+of+ovarian+cancer:+ASCO+guideline.">PARP inhibitors in the management of ovarian cancer: ASCO guideline.</a> Journal of Clinical Oncology. 38 (30), 3468-3493 (2020).</li><li>Tomasova, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DNA+repair+and+ovarian+carcinogenesis:+impact+on+risk,+prognosis+and+therapy+outcome.">DNA repair and ovarian carcinogenesis: impact on risk, prognosis and therapy outcome.</a> Cancers. 12 (7), 1713 (2020).</li><li>Mukhopadhyay, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+a+functional+assay+for+homologous+recombination+status+in+primary+cultures+of+epithelial+ovarian+tumor+and+correlation+with+sensitivity+to+poly(ADP-Ribose)+polymerase+inhibitors.">Development of a functional assay for homologous recombination status in primary cultures of epithelial ovarian tumor and correlation with sensitivity to poly(ADP-Ribose) polymerase inhibitors.</a> Clinical Cancer Research. 16 (8), 2344-2351 (2010).</li><li>Graeser, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+marker+of+homologous+recombination+predicts+pathologic+complete+response+to+neoadjuvant+chemotherapy+in+primary+breast+cancer.">A marker of homologous recombination predicts pathologic complete response to neoadjuvant chemotherapy in primary breast cancer.</a> Clinical Cancer Research. 16 (24), 6159-6168 (2010).</li><li>Hill, S. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Prediction+of+DNA+repair+inhibitor+response+in+short-term+patient-derived+ovarian+cancer+organoids.">Prediction of DNA repair inhibitor response in short-term patient-derived ovarian cancer organoids.</a> Cancer Discovery. 8 (11), 1404-1421 (2018).</li><li>Naipal, K. A. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+ex+vivo+assay+to+select+homologous+recombination-deficient+breast+tumors+for+PARP+inhibitor+treatment.">Functional ex vivo assay to select homologous recombination-deficient breast tumors for PARP inhibitor treatment.</a> Clinical Cancer Research. 20 (18), 4816-4826 (2014).</li><li>Tumiati, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+functional+homologous+recombination+assay+predicts+primary+chemotherapy+response+and+long-term+survival+in+ovarian+cancer+patients.">A functional homologous recombination assay predicts primary chemotherapy response and long-term survival in ovarian cancer patients.</a> Clinical Cancer Research. 24 (18), 4482-4493 (2018).</li><li>Mukhopadhyay, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Clinicopathological+features+of+homologous+recombination-deficient+epithelial+ovarian+cancers:+sensitivity+to+PARP+inhibitors,+platinum,+and+survival.">Clinicopathological features of homologous recombination-deficient epithelial ovarian cancers: sensitivity to PARP inhibitors, platinum, and survival.</a> Cancer Research. 72 (22), 5675-5682 (2012).</li><li>Johnson, S. W., Laub, P. B., Beesley, J. S., Ozols, R. F., Hamilton, T. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Increased+platinum-DNA+damage+tolerance+is+associated+with+cisplatin+resistance+and+cross-resistance+to+various+chemotherapeutic+agents+in+unrelated+human+ovarian+cancer+cell+lines.">Increased platinum-DNA damage tolerance is associated with cisplatin resistance and cross-resistance to various chemotherapeutic agents in unrelated human ovarian cancer cell lines.</a> Cancer Research. 57 (5), 850-856 (1997).</li><li>Stefanou, D. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Aberrant+DNA+damage+response+pathways+may+predict+the+outcome+of+platinum+chemotherapy+in+ovarian+cancer.">Aberrant DNA damage response pathways may predict the outcome of platinum chemotherapy in ovarian cancer.</a> PLoS One. 10 (2), 0117654 (2015).</li><li>Helleday, T., Petermann, E., Lundin, C., Hodgson, B., Sharma, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DNA+repair+pathways+as+targets+for+cancer+therapy.">DNA repair pathways as targets for cancer therapy.</a> Nature Reviews Cancer. 8 (3), 193-204 (2008).</li><li>Ivashkevich, A., Redon, C. E., Nakamura, A. J., Martin, R. F., Martin, O. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Use+of+the+&#947;-H2AX+assay+to+monitor+DNA+damage+and+repair+in+translational+cancer+research.">Use of the &#947;-H2AX assay to monitor DNA damage and repair in translational cancer research.</a> Cancer Letters. 327 (1-2), 123-133 (2012).</li><li>Fuh, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Homologous+recombination+deficiency+real-time+clinical+assays,+ready+or+not.">Homologous recombination deficiency real-time clinical assays, ready or not.</a> Gynecologic Oncology. 159 (3), 877-886 (2020).</li><li>Cong, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Replication+gaps+are+a+key+determinant+of+PARP+inhibitor+synthetic+lethality+with+BRCA+deficiency.">Replication gaps are a key determinant of PARP inhibitor synthetic lethality with BRCA deficiency.</a> Molecular Cell. 81 (15), 3128-3144 (2021).</li><li>Lee, E. K., Matulonis, U. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PARP+inhibitor+resistance+mechanisms+and+implications+for+post-progression+combination+therapies.">PARP inhibitor resistance mechanisms and implications for post-progression combination therapies.</a> Cancers. 12 (8), 2054 (2020).</li><li>Panzarino, N. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Replication+gaps+underlie+BRCA+deficiency+and+therapy+response.">Replication gaps underlie BRCA deficiency and therapy response.</a> Cancer Research. 81 (5), 1388-1397 (2021).</li><li>Yee, C., Dickson, K. A., Muntasir, M. N., Ma, Y., Marsh, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Three-dimensional+modelling+of+ovarian+cancer:+from+cell+lines+to+organoids+for+discovery+and+personalized+medicine.">Three-dimensional modelling of ovarian cancer: from cell lines to organoids for discovery and personalized medicine.</a> Frontiers in Bioengineering and Biotechnology. 10, 836984 (2022).</li><li>Regan, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immunofluorescence+staining+of+colorectal+cancer+patient-derived+organoids.">Immunofluorescence staining of colorectal cancer patient-derived organoids.</a> Methods Cell Biology. 171, 163-171 (2022).</li><li>Graham, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+and+culturing+of+high-grade+serous+ovarian+cancer+patient+derived+organoids.">Generation and culturing of high-grade serous ovarian cancer patient derived organoids.</a> Journal of Visualized Experiments. (191), (2023).</li><li>Jakl, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Validation+of+JCountPro+software+for+efficient+assessment+of+ionizing+radiation-induced+foci+in+human+lymphocytes.">Validation of JCountPro software for efficient assessment of ionizing radiation-induced foci in human lymphocytes.</a> International Journal of Radiation Biology. 92 (12), 766-773 (2016).</li><li>Mullen, M. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=GAS6/AXL+inhibition+enhances+ovarian+cancer+sensitivity+to+chemotherapy+and+PARP+inhibition+through+increased+DNA+damage+and+enhanced+replication+stress.">GAS6/AXL inhibition enhances ovarian cancer sensitivity to chemotherapy and PARP inhibition through increased DNA damage and enhanced replication stress.</a> Molecular Cancer Research. 20 (2), 265-279 (2022).</li><li>van Ineveld, R. L., Ariese, H. C. R., Wehrens, E. J., Dekkers, J. F., Rios, A. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-cell+resolution+three-dimensional+imaging+of+intact+organoids.">Single-cell resolution three-dimensional imaging of intact organoids.</a> Journal of Visualized Experiments. (160), e60709 (2020).</li><li>Dekkers, J. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-resolution+3D+imaging+of+fixed+and+cleared+organoids.">High-resolution 3D imaging of fixed and cleared organoids.</a> Nature Protocols. 14 (6), 1756-1771 (2019).</li><li>O'Rourke, K. P., Dow, L. E., Lowe, S. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immunofluorescent+staining+of+mouse+intestinal+stem+cells.">Immunofluorescent staining of mouse intestinal stem cells.</a> Bio Protocols. 6 (4), 1732 (2016).</li><li>Nwani, N. G., Sima, L. E., Nieves-Neira, W., Matei, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeting+the+microenvironment+in+high+grade+serous+ovarian+cancer.">Targeting the microenvironment in high grade serous ovarian cancer.</a> Cancers. 10 (8), 266 (2018).</li><li>Ghoneum, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Exploring+the+clinical+value+of+tumor+microenvironment+in+platinum-resistant+ovarian+cancer.">Exploring the clinical value of tumor microenvironment in platinum-resistant ovarian cancer.</a> Seminars in Cancer Biology. 77, 83-98 (2021).</li><li>Yang, Y., Yang, Y., Yang, J., Zhao, X., Wei, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tumor+microenvironment+in+ovarian+cancer:+function+and+therapeutic+strategy.">Tumor microenvironment in ovarian cancer: function and therapeutic strategy.</a> Frontiers in Cell and Developmental Biology. 8, 758 (2020).</li><li>van de Wetering, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Prospective+derivation+of+a+living+organoid+biobank+of+colorectal+cancer+patients.">Prospective derivation of a living organoid biobank of colorectal cancer patients.</a> Cell. 161 (4), 933-945 (2015).</li><li>Broutier, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+primary+liver+cancer-derived+organoid+cultures+for+disease+modeling+and+drug+screening.">Human primary liver cancer-derived organoid cultures for disease modeling and drug screening.</a> Nature Medicine. 23 (12), 1424-1435 (2017).</li><li>Drost, J., Clevers, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Organoids+in+cancer+research.">Organoids in cancer research.</a> Nature Reviews Cancer. 18 (7), 407-418 (2018).</li><li>Cybulla, E., Vindigni, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Leveraging+the+replication+stress+response+to+optimize+cancer+therapy.">Leveraging the replication stress response to optimize cancer therapy.</a> Nature Reviews. , (2022).</li></ol>

تلعب استجابة تلف الحمض النووي دورا أساسيا في كل من تطور سرطان المبيض ومقاومة العلاج الكيميائي. لذلك ، فإن الفهم الشامل لآليات إصلاح الحمض النووي أمر حتمي. هنا ، يتم تقديم منهجية لدراسة بروتينات إصلاح تلف الحمض النووي في 3D ، عضويات سليمة. تم تطوير بروتوكول موثوق وقابل للتكرار باستخدام الأج?...

سرطان المبيض هو السبب الرئيسي للوفاة بسبب الأورام الخبيثة النسائية. يتم علاج غالبية المرضى بالأدوية الضارة بالحمض النووي مثل كاربوبلاتين ، ويمكن إعطاء أولئك الذين يعانون من نقص في إصلاح إعادة التركيب المتماثل (HRR) مثبطات بوليميراز بولي (ADP-ribose) (PARP) 1,2. ومع ذلك ، فإن معظم المرضى يطورون مقاومة لهذه العلاجات ويموتون في غضون 5 سنوات من التشخيص. ارتبط عدم تنظيم استجابة تلف الحمض النووي (DDR) بتطور سرطان المبيض ومقاومة كل من العلاج الكيميائي ومثبطات PARP3. وبالتالي ، فإن دراسة نزع السلاح والتسريح وإعادة الإدماج أمر حتمي في فهم الفيزيولوجيا المرضية لسرطان المبيض ، والمؤشرات الحيوية المحتملة ، والعلاجات المستهدفة الجديدة.
تستخدم الطرق الحالية لتقييم نزع السلاح والتسريح وإعادة الإدماج التألق المناعي (IF) ، حيث يسمح ذلك بالتحديد الدقيق وتوطين بروتينات تلف الحمض النووي ونظائر النوكليوتيدات. بمجرد حدوث كسر مزدوج تقطعت به السبل (DSB) في الحمض النووي ، يتم فسفرة بروتين هيستون H2AX بسرعة ، مما يشكل تركيزا حيث تتجمع بروتينات إصلاح تلف الحمض النووي4. يمكن تحديد هذه الفسفرة بسهولة باستخدام IF. في الواقع ، تم استخدام اختبار ɣ-H2AX بشكل شائع لتأكيد تحريض DSB5،6،7،8،9. ارتبط تلف الحمض النووي المتزايد بحساسية البلاتين وفعالية العوامل الضارة بالحمض النووي10،11،12 ، وقد تم اقتراح ɣ-H2AX كعلامة حيوية مرتبطة باستجابة العلاج الكيميائي في علاجات السرطان الأخرى 13. عند DSB ، تقوم الخلية التي تتقن HRR بإجراء سلسلة من الأحداث التي تؤدي إلى تجنيد BRCA1 و BRCA2 RAD51 ليحل محل بروتين النسخ المتماثل A (RPA) ويرتبط بالحمض النووي. يستخدم إصلاح HRR قالب الحمض النووي لإصلاح DSB بأمانة. ومع ذلك ، عندما تكون الأورام ناقصة في HRR ، فإنها تعتمد على مسارات إصلاح بديلة مثل الانضمام النهائي غير المتماثل (NHEJ). من المعروف أن NHEJ عرضة للخطأ ويخلق عبئا طفريا كبيرا على الخلية ، والتي تستخدم 53BP1 كمنظم إيجابي14. يمكن تحديد جميع بروتينات تلف الحمض النووي هذه بدقة على أنها بؤر باستخدام IF. بالإضافة إلى تلطيخ البروتينات ، يمكن استخدام IF لدراسة حماية الشوكة وتشكيل فجوة الحمض النووي التي تقطعت بها السبل. ارتبطت القدرة على الحصول على شوكات مستقرة باستجابة البلاتين ، ومؤخرا ، أظهرت فحوصات الفجوة إمكانية التنبؤ بالاستجابة لمثبطات PARP6،15،16،17. لذلك ، فإن تلطيخ نظائر النوكليوتيدات بعد إدخالها في الجينوم هو طريقة أخرى لدراسة DDR.
حتى الآن ، اقتصر تقييم DDR في سرطان المبيض إلى حد كبير على خطوط خلايا 2D المتجانسة التي لا تلخص عدم التجانس النسيلي أو البيئة المكروية أو بنية الأورام في الجسم الحي 18,19. تشير الأبحاث الحديثة إلى أن الكائنات العضوية تتفوق على خطوط خلايا 2D في دراسة العمليات البيولوجية المعقدة مثل آليات DDR6. تقيم المنهجية الحالية RAD51 و ɣ-H2AX و 53BP1 و RPA و geminin في PDOs. تقوم هذه الطرق بتقييم العضو العضوي السليم وتسمح بدراسة آليات نزع السلاح والتسريح وإعادة الإدماج في بيئة أكثر تشابها مع البيئة المكروية للورم في الجسم الحي. جنبا إلى جنب مع الفحص المجهري متحد البؤر والعد الآلي للبؤر ، يمكن أن تساعد هذه المنهجية في فهم مسار نزع السلاح والتسريح وإعادة الإدماج في سرطان المبيض وتخصيص خطط العلاج للمرضى.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>1x phosphate buffered saline with calcium and magnesium (PBS++)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>14-040-133</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1x phosphate buffered saline without calcium and magnesium (PBS)</td>
			<td>Fisher Scientific&#160;</td>
			<td>ICN1860454</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ant-53BP1 Antibody&#160;</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>612522</td>
			<td>diluted to 1:500 in staining buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ant-Geminin Antibody&#160;</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab104306</td>
			<td>diluted to 1:200 in staining buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Geminin Antibody&#160;</td>
			<td>ProteinTech</td>
			<td>10802-1-AP</td>
			<td>diluted to 1:400 in staining buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-RAD51 Antibody&#160;</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab133534</td>
			<td>diluted to 1:1000 in staining buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-yH2AX Antibody&#160;</td>
			<td>Millipore-Sigma</td>
			<td>05-636</td>
			<td>diluted to 1:500 in staining buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ant-phospho-RPA32 (S4/S8) Antibody</td>
			<td>Bethyl Laboratories&#160;</td>
			<td>A300-245A-M</td>
			<td>diluted to 1:200 in staining buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine Serum Albumin (BSA)</td>
			<td>Fisher Scientific&#160;</td>
			<td>BP1605 100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge; Sorvall St 16R Centrifuge</td>
			<td>Thermo Scientific&#160;</td>
			<td>75004240</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Confocal Microscope, Leica SP5 confocal system DMI4000</td>
			<td>Leica&#160;</td>
			<td>389584</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Conical Tubes, 15 mL</td>
			<td>Corning&#160;</td>
			<td>14-959-53A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Countess 3 FL Automated Cell Counter (Cell Counting Machine)&#160;</td>
			<td>Thermo Scientific&#160;</td>
			<td>AMQAF2000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Countess Cell Counting Chamber Slides</td>
			<td>Thermo Scientific&#160;</td>
			<td>C10228</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cover Slip</td>
			<td>LA Colors</td>
			<td></td>
			<td>Any clear nail polish will suffice</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cultrex&#160;RGF Basement Membrane Extract, Type 2</td>
			<td>&#160;R&#38;D Systems&#160;</td>
			<td>3533-010-02</td>
			<td>Could probably use Matrigel or other BME Matrix&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DAPI&#160;</td>
			<td>Thermo Scientific&#160;</td>
			<td>&#160;R37606</td>
			<td>NucBlue Fixed Cell ReadyProbes Reagent, Diluted in 1x PBS&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycine&#160;</td>
			<td>Fisher Scientific&#160;</td>
			<td>NC0756056</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>JCountPro</td>
			<td>JCountPro</td>
			<td></td>
			<td>For access to the software, Email: jcountpro@gmail.com&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microcentrifuge Tubes&#160;</td>
			<td>Fisher Scientific&#160;</td>
			<td>07-000-243</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nail Polish&#160;</td>
			<td>StatLab</td>
			<td>SL102450</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Parafomraldehyde (PFA), 2%&#160;</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences&#160;</td>
			<td>157-4</td>
			<td>Dilute to 4% PFA in PBS++ to obtain 2% PFA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Permeabilization Buffer</td>
			<td>Made in Lab</td>
			<td></td>
			<td>0.2% X-100 Triton in PBS++&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipette</td>
			<td>Rainin</td>
			<td>17014382</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipette Tips&#160;</td>
			<td>Rainin&#160;</td>
			<td>17014967</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ProLong Gold Antifade Mountant</td>
			<td>Thermo Scientific&#160;</td>
			<td>&#160;P36930</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Staining Buffer&#160;</td>
			<td>Made in Lab</td>
			<td></td>
			<td>0.5% BSA, 0.15% Glycine, 0.1% X-100 Triton in PBS++&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thermo Scientific Nunc Lab-Tek II Chamber Slide System&#160;</td>
			<td>Thermo Scientific&#160;</td>
			<td>12-565-8</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>Sigma-Alderich&#160;</td>
			<td>11332481001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypan Blue Solution, 0.4%</td>
			<td>Thermo Scientific&#160;</td>
			<td>15250061</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TrypLE Express</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>12604013</td>
			<td>animal origin-free, recombinant enzyme</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>X-RAD 320 Biological Irradiator&#160;</td>
			<td>Precision X-Ray Irradiation&#160;</td>
			<td>X-RAD320</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

visualizing dna damage repair proteins in patient-derived ovarian cancer organoids via immunofluorescence assays

يعد التألق المناعي أحد أكثر التقنيات استخداما لتصور المستضدات المستهدفة ذات الحساسية العالية والنوعية ، مما يسمح بالتحديد الدقيق وتوطين البروتينات والجليكان والجزيئات الصغيرة. في حين أن هذه التقنية راسخة في ثقافة الخلايا ثنائية الأبعاد (2D) ، إلا أنه لا يعرف الكثير عن استخدامها في نماذج الخلايا ثلاثية الأبعاد (3D). عضويات سرطان المبيض هي نماذج ورم 3D تلخص عدم تجانس الخلايا السرطانية النسيلي ، والبيئة المكروية للورم ، وتفاعلات الخلايا الخلوية ومصفوفة الخلايا. وبالتالي ، فهي متفوقة على خطوط الخلايا لتقييم حساسية الدواء والمؤشرات الحيوية الوظيفية. لذلك ، فإن القدرة على استخدام التألق المناعي على عضويات سرطان المبيض الأولية مفيدة للغاية في فهم بيولوجيا هذا السرطان. تصف الدراسة الحالية تقنية التألق المناعي للكشف عن بروتينات إصلاح تلف الحمض النووي في عضويات سرطان المبيض المصلية عالية الجودة المشتقة من المريض (PDOs). بعد تعريض PDOs للإشعاع المؤين ، يتم إجراء التألق المناعي على المواد العضوية السليمة لتقييم البروتينات النووية كبؤر. يتم جمع الصور باستخدام تصوير z-stack على الفحص المجهري متحد البؤر وتحليلها باستخدام برنامج حساب البؤر الآلي. تسمح الطرق الموصوفة بتحليل التوظيف الزمني والخاص لبروتينات إصلاح تلف الحمض النووي وتوطين هذه البروتينات مع علامات دورة الخلية.

يمكن للبروتوكول المقدم أن يلطخ بنجاح بروتينات إصلاح تلف الحمض النووي في المواد العضوية ويتصورها ويحددها كميا. تم استخدام هذه التقنية لتلطيخ وتقييم PDOs قبل وبعد التشعيع. تعرضت PDOs إلى 10 Gy من الإشعاع وتم تقييمها للمؤشرات الحيوية التالية: ɣ-H2AX (الشكل 1) ، علامة على تلف الحمض النو...

Watch this Scientific Journal Video about Visualizing DNA Damage Repair Proteins in Patient-Derived Ovarian Cancer Organoids via Immunofluorescence Assays at JoVE.com

Visualizing DNA Damage Repair Proteins in Patient-Derived Ovarian Cancer Organoids via Immunofluorescence Assays

يصف البروتوكول الحالي طرق تقييم بروتينات إصلاح تلف الحمض النووي في عضويات سرطان المبيض المشتقة من المريض. يتضمن هنا طرق الطلاء والتلوين الشاملة ، بالإضافة إلى إجراءات القياس الكمي التفصيلية والموضوعية.

تصور بروتينات إصلاح تلف الحمض النووي في عضويات سرطان المبيض المشتقة من المريض عن طريق فحوصات التألق المناعي

Immunofluorescence is one of the most widely used techniques to visualize target antigens with high sensitivity and specificity, allowing for the accurate ...

تعد دراسة استجابة تلف الحمض النووي ضرورية لفهم الفيزيولوجيا المرضية للمؤشرات الحيوية المحتملة لسرطان المبيض في العلاج الموجه الجديد. تسمح هذه التقنية للعينة بالبقاء سليمة وتسمح بفحص مولدات الضد في موقع عملها. هذا البروتوكول سريع ويمكن تكييفه مع أي مستضد قابل للتألق المناعي.تعطي هذه الطريقة نظرة ثاقبة لسرطان المبيض وعمليات إصلاح تلف الحمض النووي التي تنطوي عليها مقاومة مثبطات العلاج الكيميائي ومثبطات PARP. يمكن تطبيق هذه الأساليب على مجالات أخرى من الدراسة التي تنطوي على استخدام الثقافات 3D والمواد العضوية. للبدء ، استنشاق الوسائط من المواد العضوية المشععة والمحتضنة دون تعطيل مصفوفة 3D.ثم يغسل مع 300 ميكرولتر من برنامج تلفزيوني. إصلاح المواد العضوية في 300 ميكرولتر من 2 ٪ بارافورمالدهيد لمدة 10 دقائق. بعد التثبيت ، اغسل المواد العضوية ب 300 ميكرولتر من المخزن المؤقت للتلطيخ وضعها على شاكر لمدة خمس دقائق.ثم تتخلل العضو العضوي عن طريق إضافة 300 ميكرولتر من المخزن المؤقت للنفاذية برفق. بعد 20 دقيقة من الحضانة ، قم بإزالة المخزن المؤقت واغسله ب 300 ميكرولتر من المخزن المؤقت للتلطيخ. ضع المواد العضوية على شاكر لمدة خمس دقائق.بعد ذلك ، أضف 300 ميكرولتر من المخزن المؤقت للتلطيخ لمنع خطوة النفاذية. ضعه على الخلاط لمدة 30 دقيقة ونضح المخزن المؤقت للتلطيخ باستخدام ماصة. ثم أضف 300 ميكرولتر من الأجسام المضادة الأولية المخففة في مخزن تلطيخ.احتضان في أربع درجات مئوية لمدة 16 ساعة. بعد الحضانة ، قم بإزالة محلول الأجسام المضادة الأساسي. قم بإجراء ثلاث غسلات باستخدام 300 ميكرولتر من المخزن المؤقت للتلطيخ لمدة خمس دقائق لكل منها على شاكر.أضف 300 ميكرولتر من محلول الأجسام المضادة الثانوي المخفف في محلول تلطيخ ، واحتضانه لمدة ساعة واحدة في الظلام. بعد ساعة واحدة ، استنشق محلول الأجسام المضادة الثانوي وأضف 300 ميكرولتر من DAPI المخفف. ضع على شاكر لمدة خمس دقائق.قم بإجراء ثلاث غسلات باستخدام 300 ميكرولتر من المخزن المؤقت للتلطيخ لمدة خمس دقائق لكل منها على شاكر. قم بإزالة المخزن المؤقت للتلطيخ وافصل الغرف باستخدام مجموعة الإزالة المرفقة مع شرائح الحجرة. اقطع طرف طرف ماصة P200 واستخدمه لإضافة وسيط تثبيت لتغطية كل بئر يحتوي على علامة تبويب عضوية.ضع غطاء ينزلق فوق العينة مع تجنب الفقاعات. خذ طلاء الأظافر الشفاف وقم بطلائه على جوانب زجاج الغطاء لإغلاق الشريحة. اتركه يتصلب لمدة ساعة ثم ضعه عند 20 درجة مئوية.التقط الصور باستخدام مجهر متحد البؤر باستخدام هدف 63X مع زيت الغمر. باستخدام هذا البروتوكول ، تم تلطيخ عضويات سرطان المبيض المشتقة من المريض بحثا عن بروتينات إصلاح تلف الحمض النووي قبل وبعد التشعيع ، وتم تقييمها للمؤشرات الحيوية مثل جاما H2AX ، وهي علامة على تلف الحمض النووي ، و RAD51 ، وهي علامة لإصلاح إعادة التركيب المتماثل. كما تم تقييم RPA ، وهي علامة لإجهاد النسخ المتماثل ، و 53BP1 ، وهي علامة على الأمر غير المتماثل ، و Geminin ، علامة دورة خلية الطور GS2 باستخدام هذه التقنية.تميل علامات تبويب BME إلى إزالة البلمرة ، لذا فإن إيلاء اهتمام وثيق بعد التثبيت والشفط أمر حيوي. يمكن أن يساعد تحليل المستضدات لتحديد تلف المواد العضوية والقدرة على تكوين استجابة لتلف الحمض النووي في تقييم مقاومة العلاج الكيميائي.

Research

JoVE Journal

Cancer Research

Visualizing DNA Damage Repair Proteins in Patient-Derived Ovarian Cancer Organoids via Immunofluorescence Assays

Evaluating In Vitro DNA Damage Using Comet Assay

Evaluating In Vitro DNA Damage Using Comet Assay

تقييم أضرار الحمض النووي في المختبر باستخدام مقايسة المذنب

DNA damage is a common phenomenon for each cell during its lifespan, and is defined as an alteration of the chemical structure of genomic DNA. Cancer ...

Characterizing DNA Repair Processes at Transient and Long-lasting Double-strand DNA Breaks by Immunofluorescence Microscopy

وصف عمليات إصلاح الحمض النووي في فواصل الحمض النووي عابرة وطويلة الأمد مزدوجة-حبلا مجهر الفلورة

The repair of double-stranded breaks (DSBs) in DNA is a highly coordinated process, necessitating the formation and resolution of multi-protein repair ...

Establishment of Gastric Cancer Patient-derived Xenograft Models and Primary Cell Lines

إنشاء نماذج Xenograft المستمدة من سرطان المعدة وخطوط الخلايا الأولية

The use of preclinical models to advance our understanding of tumor biology and investigate the efficacy of therapeutic agents is key to cancer research. ...

Testing Targeted Therapies in Cancer using Structural DNA Alteration Analysis and Patient-Derived Xenografts

اختبار العلاجات المستهدفة في السرطان باستخدام تحليل تعديل الحمض النووي الهيكلي وXenografts المستمدة من المريض

We present here an integrative approach for testing efficacy of targeted therapies that combines the next generation sequencing technolo-gies, therapeutic ...

Immunofluorescence Imaging of DNA Damage and Repair Foci in Human Colon Cancer Cells

تصوير الفلورا المناعية لتلف الحمض النووي وإصلاح البؤر في خلايا سرطان القولون البشري

The purpose of the manuscript is to provide a step-by-step protocol for performing immunofluorescence microscopy to study the radiation-induced DNA damage ...

High-Throughput In Vitro Assay using Patient-Derived Tumor Organoids

High-Throughput In Vitro Assay using Patient-Derived Tumor Organoids

عالية الإنتاجية في المختبر المقايسة باستخدام الجهازيات الورم المستمدة من المريض

Patient-derived tumor organoids (PDOs) are expected to be a preclinical cancer model with better reproducibility of disease than traditional cell culture ...

Profiling Sensitivity to Targeted Therapies in EGFR-Mutant NSCLC Patient-Derived Organoids

حساسية التنميط للعلاجات المستهدفة في المواد العضوية المشتقة من المريض NSCLC المتحورة EGFR

Novel 3D cancer organoid cultures derived from clinical patient specimens represent an important model system to evaluate intratumor heterogeneity and ...

Generation and Culturing of High-Grade Serous Ovarian Cancer Patient-Derived Organoids

توليد وزراعة المواد العضوية عالية الجودة المشتقة من سرطان المبيض المصلي

Organoids are 3D dynamic tumor models that can be grown successfully from patient-derived ovarian tumor tissue, ascites, or pleural fluid and aid in the ...

Quantifying Replication Stress in Ovarian Cancer Cells Using Single-Stranded DNA Immunofluorescence

قياس إجهاد النسخ المتماثل في خلايا سرطان المبيض باستخدام التألق المناعي للحمض النووي أحادي الشريط

Replication stress is a hallmark of several ovarian cancers. Replication stress can emerge from multiple sources, including double-strand breaks, ...

Establishment and Culture of Patient-Derived Breast Organoids

إنشاء وثقافة عضويات الثدي المشتقة من المريض

Breast cancer is a complex disease that has been classified into several different histological and molecular subtypes. Patient-derived breast tumor ...