Name: visualizing dna damage repair proteins in patient-derived ovarian cancer organoids via immunofluorescence assays
Uploaded: 2023-02-24T14:20:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Visualizing DNA Damage Repair Proteins in Patient-Derived Ovarian Cancer Organoids via Immunofluorescence Assays at JoVE.com

Wir sind dankbar für die Anleitung von Pavel Lobachevsky, PhD, bei der Erstellung dieses Protokolls. Wir möchten uns auch bei der School of Medicine der Washington University in St. Louis, der Abteilung für Geburtshilfe und Gynäkologie und der Abteilung für gynäkologische Onkologie, dem Dean's Scholar Program der Washington University, der Gynäkologischen Onkologie Group Foundation und dem Reproductive Scientist Development Program für ihre Unterstützung dieses Projekts bedanken.

Tumorgewebe und Aszites wurden nach Einholung der Zustimmung der Patientin im Rahmen eines gynäkologischen Onkologie-Biorepositorys gewonnen, das vom Institutional Review Board (IRB) der Washington University in St. Louis zugelassen wurde. Es wurden Patienten eingeschlossen, die einen hochgradigen serösen Ovarialkarzinom (HGSOC) im fortgeschrittenen Stadium hatten. Alle Eingriffe wurden bei Raumtemperatur auf der Werkbank durchgeführt, sofern nicht anders angegeben. Alle Reagenzien wurden bei Raumtemperatur (sofern ni...

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	<li>Lheureux, S., Gourley, C., Vergote, I., Oza, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Epithelial+ovarian+cancer.">Epithelial ovarian cancer.</a> Lancet Oncology. 393 (10177), 1240-1253 (2019).</li><li>Tew, W. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PARP+inhibitors+in+the+management+of+ovarian+cancer:+ASCO+guideline.">PARP inhibitors in the management of ovarian cancer: ASCO guideline.</a> Journal of Clinical Oncology. 38 (30), 3468-3493 (2020).</li><li>Tomasova, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DNA+repair+and+ovarian+carcinogenesis:+impact+on+risk,+prognosis+and+therapy+outcome.">DNA repair and ovarian carcinogenesis: impact on risk, prognosis and therapy outcome.</a> Cancers. 12 (7), 1713 (2020).</li><li>Mukhopadhyay, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+a+functional+assay+for+homologous+recombination+status+in+primary+cultures+of+epithelial+ovarian+tumor+and+correlation+with+sensitivity+to+poly(ADP-Ribose)+polymerase+inhibitors.">Development of a functional assay for homologous recombination status in primary cultures of epithelial ovarian tumor and correlation with sensitivity to poly(ADP-Ribose) polymerase inhibitors.</a> Clinical Cancer Research. 16 (8), 2344-2351 (2010).</li><li>Graeser, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+marker+of+homologous+recombination+predicts+pathologic+complete+response+to+neoadjuvant+chemotherapy+in+primary+breast+cancer.">A marker of homologous recombination predicts pathologic complete response to neoadjuvant chemotherapy in primary breast cancer.</a> Clinical Cancer Research. 16 (24), 6159-6168 (2010).</li><li>Hill, S. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Prediction+of+DNA+repair+inhibitor+response+in+short-term+patient-derived+ovarian+cancer+organoids.">Prediction of DNA repair inhibitor response in short-term patient-derived ovarian cancer organoids.</a> Cancer Discovery. 8 (11), 1404-1421 (2018).</li><li>Naipal, K. A. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+ex+vivo+assay+to+select+homologous+recombination-deficient+breast+tumors+for+PARP+inhibitor+treatment.">Functional ex vivo assay to select homologous recombination-deficient breast tumors for PARP inhibitor treatment.</a> Clinical Cancer Research. 20 (18), 4816-4826 (2014).</li><li>Tumiati, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+functional+homologous+recombination+assay+predicts+primary+chemotherapy+response+and+long-term+survival+in+ovarian+cancer+patients.">A functional homologous recombination assay predicts primary chemotherapy response and long-term survival in ovarian cancer patients.</a> Clinical Cancer Research. 24 (18), 4482-4493 (2018).</li><li>Mukhopadhyay, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Clinicopathological+features+of+homologous+recombination-deficient+epithelial+ovarian+cancers:+sensitivity+to+PARP+inhibitors,+platinum,+and+survival.">Clinicopathological features of homologous recombination-deficient epithelial ovarian cancers: sensitivity to PARP inhibitors, platinum, and survival.</a> Cancer Research. 72 (22), 5675-5682 (2012).</li><li>Johnson, S. W., Laub, P. B., Beesley, J. S., Ozols, R. F., Hamilton, T. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Increased+platinum-DNA+damage+tolerance+is+associated+with+cisplatin+resistance+and+cross-resistance+to+various+chemotherapeutic+agents+in+unrelated+human+ovarian+cancer+cell+lines.">Increased platinum-DNA damage tolerance is associated with cisplatin resistance and cross-resistance to various chemotherapeutic agents in unrelated human ovarian cancer cell lines.</a> Cancer Research. 57 (5), 850-856 (1997).</li><li>Stefanou, D. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Aberrant+DNA+damage+response+pathways+may+predict+the+outcome+of+platinum+chemotherapy+in+ovarian+cancer.">Aberrant DNA damage response pathways may predict the outcome of platinum chemotherapy in ovarian cancer.</a> PLoS One. 10 (2), 0117654 (2015).</li><li>Helleday, T., Petermann, E., Lundin, C., Hodgson, B., Sharma, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DNA+repair+pathways+as+targets+for+cancer+therapy.">DNA repair pathways as targets for cancer therapy.</a> Nature Reviews Cancer. 8 (3), 193-204 (2008).</li><li>Ivashkevich, A., Redon, C. E., Nakamura, A. J., Martin, R. F., Martin, O. 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J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Three-dimensional+modelling+of+ovarian+cancer:+from+cell+lines+to+organoids+for+discovery+and+personalized+medicine.">Three-dimensional modelling of ovarian cancer: from cell lines to organoids for discovery and personalized medicine.</a> Frontiers in Bioengineering and Biotechnology. 10, 836984 (2022).</li><li>Regan, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immunofluorescence+staining+of+colorectal+cancer+patient-derived+organoids.">Immunofluorescence staining of colorectal cancer patient-derived organoids.</a> Methods Cell Biology. 171, 163-171 (2022).</li><li>Graham, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+and+culturing+of+high-grade+serous+ovarian+cancer+patient+derived+organoids.">Generation and culturing of high-grade serous ovarian cancer patient derived organoids.</a> Journal of Visualized Experiments. (191), (2023).</li><li>Jakl, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Validation+of+JCountPro+software+for+efficient+assessment+of+ionizing+radiation-induced+foci+in+human+lymphocytes.">Validation of JCountPro software for efficient assessment of ionizing radiation-induced foci in human lymphocytes.</a> International Journal of Radiation Biology. 92 (12), 766-773 (2016).</li><li>Mullen, M. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=GAS6/AXL+inhibition+enhances+ovarian+cancer+sensitivity+to+chemotherapy+and+PARP+inhibition+through+increased+DNA+damage+and+enhanced+replication+stress.">GAS6/AXL inhibition enhances ovarian cancer sensitivity to chemotherapy and PARP inhibition through increased DNA damage and enhanced replication stress.</a> Molecular Cancer Research. 20 (2), 265-279 (2022).</li><li>van Ineveld, R. L., Ariese, H. C. R., Wehrens, E. J., Dekkers, J. F., Rios, A. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-cell+resolution+three-dimensional+imaging+of+intact+organoids.">Single-cell resolution three-dimensional imaging of intact organoids.</a> Journal of Visualized Experiments. (160), e60709 (2020).</li><li>Dekkers, J. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-resolution+3D+imaging+of+fixed+and+cleared+organoids.">High-resolution 3D imaging of fixed and cleared organoids.</a> Nature Protocols. 14 (6), 1756-1771 (2019).</li><li>O'Rourke, K. P., Dow, L. E., Lowe, S. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immunofluorescent+staining+of+mouse+intestinal+stem+cells.">Immunofluorescent staining of mouse intestinal stem cells.</a> Bio Protocols. 6 (4), 1732 (2016).</li><li>Nwani, N. G., Sima, L. E., Nieves-Neira, W., Matei, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeting+the+microenvironment+in+high+grade+serous+ovarian+cancer.">Targeting the microenvironment in high grade serous ovarian cancer.</a> Cancers. 10 (8), 266 (2018).</li><li>Ghoneum, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Exploring+the+clinical+value+of+tumor+microenvironment+in+platinum-resistant+ovarian+cancer.">Exploring the clinical value of tumor microenvironment in platinum-resistant ovarian cancer.</a> Seminars in Cancer Biology. 77, 83-98 (2021).</li><li>Yang, Y., Yang, Y., Yang, J., Zhao, X., Wei, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tumor+microenvironment+in+ovarian+cancer:+function+and+therapeutic+strategy.">Tumor microenvironment in ovarian cancer: function and therapeutic strategy.</a> Frontiers in Cell and Developmental Biology. 8, 758 (2020).</li><li>van de Wetering, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Prospective+derivation+of+a+living+organoid+biobank+of+colorectal+cancer+patients.">Prospective derivation of a living organoid biobank of colorectal cancer patients.</a> Cell. 161 (4), 933-945 (2015).</li><li>Broutier, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+primary+liver+cancer-derived+organoid+cultures+for+disease+modeling+and+drug+screening.">Human primary liver cancer-derived organoid cultures for disease modeling and drug screening.</a> Nature Medicine. 23 (12), 1424-1435 (2017).</li><li>Drost, J., Clevers, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Organoids+in+cancer+research.">Organoids in cancer research.</a> Nature Reviews Cancer. 18 (7), 407-418 (2018).</li><li>Cybulla, E., Vindigni, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Leveraging+the+replication+stress+response+to+optimize+cancer+therapy.">Leveraging the replication stress response to optimize cancer therapy.</a> Nature Reviews. , (2022).</li></ol>

Die DNA-Schadensantwort spielt eine wesentliche Rolle sowohl bei der Entwicklung von Eierstockkrebs als auch bei der Chemotherapieresistenz. Daher ist ein gründliches Verständnis der DNA-Reparaturmechanismen unerlässlich. Hier wird eine Methodik vorgestellt, um DNA-Schadensreparaturproteine in intakten 3D-Organoiden zu untersuchen. Es wird ein reproduzierbares, zuverlässiges Protokoll entwickelt, das charakteristische Antikörper verwendet, um DNA-Schäden, homologe Rekombination, nicht-homologe Endverbindungen und R...

Eierstockkrebs ist die häufigste Todesursache aufgrund gynäkologischer Malignität. Die Mehrzahl der Patienten wird mit DNA-schädigenden Medikamenten wie Carboplatin behandelt, und Patienten mit Tumoren mit homologer Rekombinationsreparatur (HRR) können Poly (ADP-Ribose) Polymerase (PARP) -Inhibitoren 1,2 verabreicht werden. Die meisten Patienten entwickeln jedoch eine Resistenz gegen diese Therapien und sterben innerhalb von 5 Jahren nach der Diagnose. Eine Dysregulation der DNA-Schadensantwort (DDR) wurde mit der Entwicklung von Eierstockkrebs und sowohl Chemotherapie als auch PARP-Inhibitor-Resistenz in Verbindung gebracht3. Daher ist die Untersuchung der DDR unerlässlich, um die Pathophysiologie von Eierstockkrebs, potenzielle Biomarker und neuartige zielgerichtete Therapien zu verstehen.
Aktuelle Methoden zur Bewertung der DDR verwenden Immunfluoreszenz (IF), da dies die genaue Identifizierung und Lokalisierung von DNA-schädigenden Proteinen und Nukleotidanaloga ermöglicht. Sobald es einen Doppelstrangbruch (DSB) in der DNA gibt, wird das Histonprotein H2AX schnell phosphoryliert und bildet einen Fokus, in dem sich DNA-Schadensreparaturproteine versammeln4. Diese Phosphorylierung kann leicht mit Hilfe von IF identifiziert werden; Tatsächlich wurde der ɣ-H2AX-Assay üblicherweise verwendet, um die Induktion eines DSB 5,6,7,8,9 zu bestätigen. Erhöhte DNA-Schäden wurden mit der Platinsensitivität und Wirksamkeit von DNA-schädigenden Stoffen in Verbindung gebracht 10,11,12, und ɣ-H2AX wurde als Biomarker vorgeschlagen, der mit dem Ansprechen auf eine Chemotherapie bei anderen Krebsbehandlungen assoziiert ist 13. Bei einem DSB führt eine Zelle, die HRR beherrscht, eine Reihe von Ereignissen durch, die dazu führen, dass BRCA1 und BRCA2 RAD51 rekrutieren, um das Replikationsprotein A (RPA) zu ersetzen und an die DNA zu binden. Bei der HRR-Reparatur wird eine DNA-Vorlage verwendet, um das DSB originalgetreu zu reparieren. Wenn Tumoren jedoch einen Mangel an HRR aufweisen, sind sie auf alternative Reparaturwege wie die nicht-homologe Endverbindung (NHEJ) angewiesen. Es ist bekannt, dass NHEJ fehleranfällig ist und eine hohe Mutationslast für die Zelle erzeugt, die 53BP1 als positiven Regulator verwendet14. Diese DNA-schädigenden Proteine können alle mit Hilfe von IF genau als Herde identifiziert werden. Zusätzlich zur Färbung von Proteinen kann IF verwendet werden, um den Gabelschutz und die Bildung einzelsträngiger DNA-Lücken zu untersuchen. Die Fähigkeit, stabile Gabeln zu haben, wurde mit dem Ansprechen von Platin korreliert, und in jüngster Zeit haben Gap-Assays das Potenzial gezeigt, das Ansprechen auf PARP-Inhibitoren 6,15,16,17 vorherzusagen. Daher ist die Färbung der Nukleotidanaloga nach der Einführung in das Genom eine weitere Möglichkeit, die DDR zu untersuchen.
Bisher war die Bewertung der DDR bei Ovarialkarzinomen weitgehend auf homogene 2D-Zelllinien beschränkt, die die klonale Heterogenität, Mikroumgebung oder Architektur von In-vivo-Tumoren nicht rekapitulieren18,19. Neuere Forschungsergebnisse deuten darauf hin, dass Organoide 2D-Zelllinien bei der Untersuchung komplexer biologischer Prozesse wie DDR-Mechanismen überlegen sind6. Die vorliegende Methodik bewertet RAD51, ɣ-H2AX, 53BP1, RPA und Geminin in PDOs. Diese Methoden beurteilen das intakte Organoid und ermöglichen die Untersuchung von DDR-Mechanismen in einer Umgebung, die der Mikroumgebung des In-vivo-Tumors ähnlicher ist. Zusammen mit der konfokalen Mikroskopie und der automatisierten Herdzählung kann diese Methodik dazu beitragen, den DDR-Signalweg bei Eierstockkrebs zu verstehen und Behandlungspläne für Patienten zu personalisieren.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>1x phosphate buffered saline with calcium and magnesium (PBS++)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>14-040-133</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1x phosphate buffered saline without calcium and magnesium (PBS)</td>
			<td>Fisher Scientific&#160;</td>
			<td>ICN1860454</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ant-53BP1 Antibody&#160;</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>612522</td>
			<td>diluted to 1:500 in staining buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ant-Geminin Antibody&#160;</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab104306</td>
			<td>diluted to 1:200 in staining buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Geminin Antibody&#160;</td>
			<td>ProteinTech</td>
			<td>10802-1-AP</td>
			<td>diluted to 1:400 in staining buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-RAD51 Antibody&#160;</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab133534</td>
			<td>diluted to 1:1000 in staining buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-yH2AX Antibody&#160;</td>
			<td>Millipore-Sigma</td>
			<td>05-636</td>
			<td>diluted to 1:500 in staining buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ant-phospho-RPA32 (S4/S8) Antibody</td>
			<td>Bethyl Laboratories&#160;</td>
			<td>A300-245A-M</td>
			<td>diluted to 1:200 in staining buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine Serum Albumin (BSA)</td>
			<td>Fisher Scientific&#160;</td>
			<td>BP1605 100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge; Sorvall St 16R Centrifuge</td>
			<td>Thermo Scientific&#160;</td>
			<td>75004240</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Confocal Microscope, Leica SP5 confocal system DMI4000</td>
			<td>Leica&#160;</td>
			<td>389584</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Conical Tubes, 15 mL</td>
			<td>Corning&#160;</td>
			<td>14-959-53A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Countess 3 FL Automated Cell Counter (Cell Counting Machine)&#160;</td>
			<td>Thermo Scientific&#160;</td>
			<td>AMQAF2000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Countess Cell Counting Chamber Slides</td>
			<td>Thermo Scientific&#160;</td>
			<td>C10228</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cover Slip</td>
			<td>LA Colors</td>
			<td></td>
			<td>Any clear nail polish will suffice</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cultrex&#160;RGF Basement Membrane Extract, Type 2</td>
			<td>&#160;R&#38;D Systems&#160;</td>
			<td>3533-010-02</td>
			<td>Could probably use Matrigel or other BME Matrix&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DAPI&#160;</td>
			<td>Thermo Scientific&#160;</td>
			<td>&#160;R37606</td>
			<td>NucBlue Fixed Cell ReadyProbes Reagent, Diluted in 1x PBS&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycine&#160;</td>
			<td>Fisher Scientific&#160;</td>
			<td>NC0756056</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>JCountPro</td>
			<td>JCountPro</td>
			<td></td>
			<td>For access to the software, Email: jcountpro@gmail.com&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microcentrifuge Tubes&#160;</td>
			<td>Fisher Scientific&#160;</td>
			<td>07-000-243</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nail Polish&#160;</td>
			<td>StatLab</td>
			<td>SL102450</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Parafomraldehyde (PFA), 2%&#160;</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences&#160;</td>
			<td>157-4</td>
			<td>Dilute to 4% PFA in PBS++ to obtain 2% PFA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Permeabilization Buffer</td>
			<td>Made in Lab</td>
			<td></td>
			<td>0.2% X-100 Triton in PBS++&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipette</td>
			<td>Rainin</td>
			<td>17014382</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipette Tips&#160;</td>
			<td>Rainin&#160;</td>
			<td>17014967</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ProLong Gold Antifade Mountant</td>
			<td>Thermo Scientific&#160;</td>
			<td>&#160;P36930</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Staining Buffer&#160;</td>
			<td>Made in Lab</td>
			<td></td>
			<td>0.5% BSA, 0.15% Glycine, 0.1% X-100 Triton in PBS++&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thermo Scientific Nunc Lab-Tek II Chamber Slide System&#160;</td>
			<td>Thermo Scientific&#160;</td>
			<td>12-565-8</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>Sigma-Alderich&#160;</td>
			<td>11332481001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypan Blue Solution, 0.4%</td>
			<td>Thermo Scientific&#160;</td>
			<td>15250061</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TrypLE Express</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>12604013</td>
			<td>animal origin-free, recombinant enzyme</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>X-RAD 320 Biological Irradiator&#160;</td>
			<td>Precision X-Ray Irradiation&#160;</td>
			<td>X-RAD320</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

visualizing dna damage repair proteins in patient-derived ovarian cancer organoids via immunofluorescence assays

Die Immunfluoreszenz ist eine der am weitesten verbreiteten Techniken zur Visualisierung von Zielantigenen mit hoher Sensitivität und Spezifität, die die genaue Identifizierung und Lokalisierung von Proteinen, Glykanen und kleinen Molekülen ermöglicht. Während diese Technik in der zweidimensionalen (2D) Zellkultur gut etabliert ist, ist weniger über ihre Verwendung in dreidimensionalen (3D) Zellmodellen bekannt. Ovarialkarzinom-Organoide sind 3D-Tumormodelle, die die klonale Heterogenität von Tumorzellen, die Tumormikroumgebung sowie Zell-Zell- und Zell-Matrix-Interaktionen rekapitulieren. Damit sind sie Zelllinien bei der Bewertung von Wirkstoffsensitivität und funktionellen Biomarkern überlegen. Daher ist die Fähigkeit, Immunfluoreszenz an primären Ovarialkarzinom-Organoiden zu verwenden, äußerst vorteilhaft für das Verständnis der Biologie dieses Krebses. Die aktuelle Studie beschreibt die Technik der Immunfluoreszenz zum Nachweis von Proteinen zur Reparatur von DNA-Schäden in hochgradigen serösen, von Patientinnen stammenden Ovarialkarzinom-Organoiden (PDOs). Nachdem die PDOs ionisierender Strahlung ausgesetzt wurden, wird eine Immunfluoreszenz an intakten Organoiden durchgeführt, um Kernproteine als Herde zu bewerten. Die Bilder werden mit Hilfe der Z-Stack-Bildgebung auf konfokaler Mikroskopie gesammelt und mit einer automatisierten Herdzählsoftware analysiert. Die beschriebenen Methoden ermöglichen die Analyse der zeitlichen und speziellen Rekrutierung von DNA-Schadensreparaturproteinen und die Kolokalisation dieser Proteine mit Zellzyklusmarkern.

Das vorgestellte Protokoll kann erfolgreich Proteine zur Reparatur von DNA-Schäden in Organoiden färben, visualisieren und quantifizieren. Diese Technik wurde verwendet, um PDOs sowohl vor als auch nach der Bestrahlung zu färben und zu bewerten. PDOs wurden 10 Gy Strahlung ausgesetzt und auf die folgenden Biomarker untersucht: ɣ-H2AX (Abbildung 1), ein Marker für DNA-Schäden; RAD51 (Abbildung 2), ein Marker für HRR; 53BP1, ein Marker für NHEJ; RPA, ein M...

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Visualizing DNA Damage Repair Proteins in Patient-Derived Ovarian Cancer Organoids via Immunofluorescence Assays

Das vorliegende Protokoll beschreibt Methoden zur Bewertung von DNA-Schadensreparaturproteinen in von Patientinnen stammenden Ovarialkarzinom-Organoiden. Dazu gehören umfassende Plattierungs- und Färbemethoden sowie detaillierte, objektive Quantifizierungsverfahren.

Visualisierung von Proteinen zur Reparatur von DNA-Schäden in patienteneigenen Ovarialkarzinom-Organoiden mittels Immunfluoreszenz-Assays

Immunofluorescence is one of the most widely used techniques to visualize target antigens with high sensitivity and specificity, allowing for the accurate ...

Die Untersuchung der DNA-Schadensantwort ist notwendig, um die Pathophysiologie potenzieller Biomarker für Eierstockkrebs in einer neuartigen zielgerichteten Therapie zu verstehen. Diese Technik ermöglicht es, dass die Probe intakt bleibt und die Antigene an ihrem Wirkort untersucht werden können. Dieses Protokoll ist schnell und kann an jedes Antigen angepasst werden, das für die Immunfluoreszenz geeignet ist.Diese Methode gibt Aufschluss über Eierstockkrebs und Reparaturprozesse von DNA-Schäden, die an der Resistenz gegen Chemotherapeutika und PARP-Inhibitoren beteiligt sind. Diese Methoden können auf andere Studienbereiche angewendet werden, in denen 3D-Kulturen und Organoide verwendet werden. Saugen Sie zunächst die Medien aus den bestrahlten und inkubierten Organoiden ab, ohne die 3D-Matrix zu stören.Anschließend mit 300 Mikrolitern PBS waschen. Fixieren Sie die Organoide in 300 Mikrolitern 2% Paraformaldehyd für 10 Minuten. Waschen Sie die Organoide nach dem Fixieren mit 300 Mikrolitern Färbepuffer und legen Sie sie fünf Minuten lang auf einen Shaker.Dann permeabilisieren Sie das Organoid durch vorsichtige Zugabe von 300 Mikrolitern Permeabilisierungspuffer. Entfernen Sie nach 20 Minuten Inkubation den Puffer und waschen Sie ihn mit 300 Mikrolitern Färbepuffer. Legen Sie die Organoide für fünf Minuten auf einen Shaker.Als nächstes fügen Sie 300 Mikroliter Färbepuffer hinzu, um den Permeabilisierungsschritt zu blockieren. 30 Minuten auf den Shaker legen und den Färbepuffer mit einer Pipette absaugen. Fügen Sie dann 300 Mikroliter Primärantikörper hinzu, die in Färbepuffer verdünnt sind.16 Stunden bei vier Grad Celsius inkubieren. Entfernen Sie nach der Inkubation die primäre Antikörperlösung. Führen Sie drei Wäschen mit 300 Mikrolitern Färbepuffer für jeweils fünf Minuten auf dem Shaker durch.Fügen Sie 300 Mikroliter sekundäre Antikörperlösung hinzu, die in Färbepuffer verdünnt ist, und inkubieren Sie eine Stunde lang im Dunkeln. Nach einer Stunde saugen Sie die sekundäre Antikörperlösung ab und fügen Sie 300 Mikroliter verdünntes DAPI hinzu. Fünf Minuten auf den Shaker legen.Führen Sie drei Wäschen mit 300 Mikrolitern Färbepuffer für jeweils fünf Minuten auf dem Shaker durch. Entfernen Sie den Färbepuffer und lösen Sie die Kammern mit dem Entnahmeset, das den Objektträgern beiliegt. Schneiden Sie die Spitze einer P200-Pipettenspitze ab und fügen Sie damit Montagemedium hinzu, um jede Vertiefung mit einer Organoidlasche abzudecken.Legen Sie ein Deckglas über die Probe und vermeiden Sie dabei Blasen. Nehmen Sie durchsichtigen Nagellack und malen Sie ihn auf die Seiten des Deckglases, um den Objektträger zu versiegeln. Lassen Sie es eine Stunde aushärten und legen Sie es dann auf 20 Grad Celsius.Nehmen Sie Bilder mit einem konfokalen Mikroskop mit einem 63X-Objektiv mit Immersionsöl auf. Unter Verwendung dieses Protokolls wurden von Patientinnen stammende Ovarialkarzinom-Organoide vor und nach der Bestrahlung auf Proteine zur Reparatur von DNA-Schäden gefärbt und auf Biomarker wie Gamma-H2AX, einen Marker für DNA-Schäden, und RAD51, einen Marker für die homologe Rekombinationsreparatur, untersucht. RPA, ein Marker für Replikationsstress, 53BP1, ein Marker für nicht-homologes Enstranging, und Geminin, ein GS2-Phasen-Zellzyklusmarker, wurden ebenfalls mit dieser Technik bewertet.Die BME-Tabs neigen zum Depolymerisieren, daher ist es wichtig, nach dem Fixieren und Absaugen genau aufzupassen. Die Analyse der Antigene zur Bestimmung der Organoidschädigung und die Fähigkeit, eine DNA-Schadensreaktion aufzubauen, könnten bei der Bewertung der chemotherapeutischen Resistenz helfen.

Research

JoVE Journal

Cancer Research

Visualizing DNA Damage Repair Proteins in Patient-Derived Ovarian Cancer Organoids via Immunofluorescence Assays

Evaluating In Vitro DNA Damage Using Comet Assay

Evaluating In Vitro DNA Damage Using Comet Assay

Bewertung von In-vitro- DNA-Schäden mit Comet-Assay

DNA damage is a common phenomenon for each cell during its lifespan, and is defined as an alteration of the chemical structure of genomic DNA. Cancer ...

Forschung

Krebsforschung

Characterizing DNA Repair Processes at Transient and Long-lasting Double-strand DNA Breaks by Immunofluorescence Microscopy

Charakterisierung von DNA-Reparaturprozesse bei Transienten und langlebige Doppel-Strang DNA-Brüchen durch Immunfluoreszenz-Mikroskopie

The repair of double-stranded breaks (DSBs) in DNA is a highly coordinated process, necessitating the formation and resolution of multi-protein repair ...

Establishment of Gastric Cancer Patient-derived Xenograft Models and Primary Cell Lines

Etablierung von vom Magenkrebs abgeleiteten Xenograft-Modellen und Primärzelllinien

The use of preclinical models to advance our understanding of tumor biology and investigate the efficacy of therapeutic agents is key to cancer research. ...

Testing Targeted Therapies in Cancer using Structural DNA Alteration Analysis and Patient-Derived Xenografts

Testen von gezielten Krebstherapien mit struktureller DNA-Alterationsanalyse und patientenabgeleiteten Xenografts

We present here an integrative approach for testing efficacy of targeted therapies that combines the next generation sequencing technolo-gies, therapeutic ...

Immunofluorescence Imaging of DNA Damage and Repair Foci in Human Colon Cancer Cells

Immunfluoreszenz Bildgebung von DNA-Schäden und Reparatur-Fozien in menschlichen Darmkrebszellen

The purpose of the manuscript is to provide a step-by-step protocol for performing immunofluorescence microscopy to study the radiation-induced DNA damage ...

High-Throughput In Vitro Assay using Patient-Derived Tumor Organoids

High-Throughput In Vitro Assay using Patient-Derived Tumor Organoids

Hochdurchsatz-In-vitro-Assay mit patientenabgeleiteten Tumororganoiden

Patient-derived tumor organoids (PDOs) are expected to be a preclinical cancer model with better reproducibility of disease than traditional cell culture ...

Profiling Sensitivity to Targeted Therapies in EGFR-Mutant NSCLC Patient-Derived Organoids

Profiling der Sensitivität gegenüber zielgerichteten Therapien in EGFR-mutierten NSCLC-patientenabgeleiteten Organoiden

Novel 3D cancer organoid cultures derived from clinical patient specimens represent an important model system to evaluate intratumor heterogeneity and ...

Generation and Culturing of High-Grade Serous Ovarian Cancer Patient-Derived Organoids

Erzeugung und Kultivierung von hochgradigen serösen Ovarialkarzinom-Organoiden, die von Patientinnen stammen

Organoids are 3D dynamic tumor models that can be grown successfully from patient-derived ovarian tumor tissue, ascites, or pleural fluid and aid in the ...

Quantifying Replication Stress in Ovarian Cancer Cells Using Single-Stranded DNA Immunofluorescence

Quantifizierung des Replikationsstresses in Ovarialkarzinomzellen mittels einzelsträngiger DNA-Immunfluoreszenz

Replication stress is a hallmark of several ovarian cancers. Replication stress can emerge from multiple sources, including double-strand breaks, ...

Establishment and Culture of Patient-Derived Breast Organoids

Etablierung und Kultivierung von patienteneigenen Brustorganoiden

Breast cancer is a complex disease that has been classified into several different histological and molecular subtypes. Patient-derived breast tumor ...