Name: visualizing dna damage repair proteins in patient-derived ovarian cancer organoids via immunofluorescence assays
Uploaded: 2023-02-24T14:20:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Visualizing DNA Damage Repair Proteins in Patient-Derived Ovarian Cancer Organoids via Immunofluorescence Assays at JoVE.com

Siamo grati per la guida di Pavel Lobachevsky, PhD nello stabilire questo protocollo. Vorremmo anche ringraziare la School of Medicine della Washington University nel Dipartimento di Ostetricia e Ginecologia di St. Louis e la Divisione di Oncologia Ginecologica, il Dean's Scholar Program della Washington University, la Gynecologic Oncology Group Foundation e il Reproductive Scientist Development Program per il loro sostegno a questo progetto.

Il tessuto tumorale e l'ascite sono stati ottenuti dopo aver ottenuto il consenso del paziente come parte di un biorepository di oncologia ginecologica approvato dal Washington University in St. Louis Institutional Review Board (IRB). Le pazienti sono state incluse se avevano un carcinoma ovarico sieroso di alto grado in stadio avanzato (HGSOC). Tutte le procedure sono state eseguite a temperatura ambiente sul banco, se non diversamente specificato. Tutti i reagenti sono stati preparati a temperatura ambiente (salvo dive...

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	<li>Lheureux, S., Gourley, C., Vergote, I., Oza, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Epithelial+ovarian+cancer.">Epithelial ovarian cancer.</a> Lancet Oncology. 393 (10177), 1240-1253 (2019).</li><li>Tew, W. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PARP+inhibitors+in+the+management+of+ovarian+cancer:+ASCO+guideline.">PARP inhibitors in the management of ovarian cancer: ASCO guideline.</a> Journal of Clinical Oncology. 38 (30), 3468-3493 (2020).</li><li>Tomasova, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DNA+repair+and+ovarian+carcinogenesis:+impact+on+risk,+prognosis+and+therapy+outcome.">DNA repair and ovarian carcinogenesis: impact on risk, prognosis and therapy outcome.</a> Cancers. 12 (7), 1713 (2020).</li><li>Mukhopadhyay, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+a+functional+assay+for+homologous+recombination+status+in+primary+cultures+of+epithelial+ovarian+tumor+and+correlation+with+sensitivity+to+poly(ADP-Ribose)+polymerase+inhibitors.">Development of a functional assay for homologous recombination status in primary cultures of epithelial ovarian tumor and correlation with sensitivity to poly(ADP-Ribose) polymerase inhibitors.</a> Clinical Cancer Research. 16 (8), 2344-2351 (2010).</li><li>Graeser, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+marker+of+homologous+recombination+predicts+pathologic+complete+response+to+neoadjuvant+chemotherapy+in+primary+breast+cancer.">A marker of homologous recombination predicts pathologic complete response to neoadjuvant chemotherapy in primary breast cancer.</a> Clinical Cancer Research. 16 (24), 6159-6168 (2010).</li><li>Hill, S. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Prediction+of+DNA+repair+inhibitor+response+in+short-term+patient-derived+ovarian+cancer+organoids.">Prediction of DNA repair inhibitor response in short-term patient-derived ovarian cancer organoids.</a> Cancer Discovery. 8 (11), 1404-1421 (2018).</li><li>Naipal, K. A. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+ex+vivo+assay+to+select+homologous+recombination-deficient+breast+tumors+for+PARP+inhibitor+treatment.">Functional ex vivo assay to select homologous recombination-deficient breast tumors for PARP inhibitor treatment.</a> Clinical Cancer Research. 20 (18), 4816-4826 (2014).</li><li>Tumiati, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+functional+homologous+recombination+assay+predicts+primary+chemotherapy+response+and+long-term+survival+in+ovarian+cancer+patients.">A functional homologous recombination assay predicts primary chemotherapy response and long-term survival in ovarian cancer patients.</a> Clinical Cancer Research. 24 (18), 4482-4493 (2018).</li><li>Mukhopadhyay, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Clinicopathological+features+of+homologous+recombination-deficient+epithelial+ovarian+cancers:+sensitivity+to+PARP+inhibitors,+platinum,+and+survival.">Clinicopathological features of homologous recombination-deficient epithelial ovarian cancers: sensitivity to PARP inhibitors, platinum, and survival.</a> Cancer Research. 72 (22), 5675-5682 (2012).</li><li>Johnson, S. W., Laub, P. B., Beesley, J. S., Ozols, R. F., Hamilton, T. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Increased+platinum-DNA+damage+tolerance+is+associated+with+cisplatin+resistance+and+cross-resistance+to+various+chemotherapeutic+agents+in+unrelated+human+ovarian+cancer+cell+lines.">Increased platinum-DNA damage tolerance is associated with cisplatin resistance and cross-resistance to various chemotherapeutic agents in unrelated human ovarian cancer cell lines.</a> Cancer Research. 57 (5), 850-856 (1997).</li><li>Stefanou, D. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Aberrant+DNA+damage+response+pathways+may+predict+the+outcome+of+platinum+chemotherapy+in+ovarian+cancer.">Aberrant DNA damage response pathways may predict the outcome of platinum chemotherapy in ovarian cancer.</a> PLoS One. 10 (2), 0117654 (2015).</li><li>Helleday, T., Petermann, E., Lundin, C., Hodgson, B., Sharma, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DNA+repair+pathways+as+targets+for+cancer+therapy.">DNA repair pathways as targets for cancer therapy.</a> Nature Reviews Cancer. 8 (3), 193-204 (2008).</li><li>Ivashkevich, A., Redon, C. E., Nakamura, A. J., Martin, R. F., Martin, O. 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K., Matulonis, U. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PARP+inhibitor+resistance+mechanisms+and+implications+for+post-progression+combination+therapies.">PARP inhibitor resistance mechanisms and implications for post-progression combination therapies.</a> Cancers. 12 (8), 2054 (2020).</li><li>Panzarino, N. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Replication+gaps+underlie+BRCA+deficiency+and+therapy+response.">Replication gaps underlie BRCA deficiency and therapy response.</a> Cancer Research. 81 (5), 1388-1397 (2021).</li><li>Yee, C., Dickson, K. A., Muntasir, M. N., Ma, Y., Marsh, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Three-dimensional+modelling+of+ovarian+cancer:+from+cell+lines+to+organoids+for+discovery+and+personalized+medicine.">Three-dimensional modelling of ovarian cancer: from cell lines to organoids for discovery and personalized medicine.</a> Frontiers in Bioengineering and Biotechnology. 10, 836984 (2022).</li><li>Regan, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immunofluorescence+staining+of+colorectal+cancer+patient-derived+organoids.">Immunofluorescence staining of colorectal cancer patient-derived organoids.</a> Methods Cell Biology. 171, 163-171 (2022).</li><li>Graham, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+and+culturing+of+high-grade+serous+ovarian+cancer+patient+derived+organoids.">Generation and culturing of high-grade serous ovarian cancer patient derived organoids.</a> Journal of Visualized Experiments. (191), (2023).</li><li>Jakl, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Validation+of+JCountPro+software+for+efficient+assessment+of+ionizing+radiation-induced+foci+in+human+lymphocytes.">Validation of JCountPro software for efficient assessment of ionizing radiation-induced foci in human lymphocytes.</a> International Journal of Radiation Biology. 92 (12), 766-773 (2016).</li><li>Mullen, M. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=GAS6/AXL+inhibition+enhances+ovarian+cancer+sensitivity+to+chemotherapy+and+PARP+inhibition+through+increased+DNA+damage+and+enhanced+replication+stress.">GAS6/AXL inhibition enhances ovarian cancer sensitivity to chemotherapy and PARP inhibition through increased DNA damage and enhanced replication stress.</a> Molecular Cancer Research. 20 (2), 265-279 (2022).</li><li>van Ineveld, R. L., Ariese, H. C. R., Wehrens, E. J., Dekkers, J. F., Rios, A. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-cell+resolution+three-dimensional+imaging+of+intact+organoids.">Single-cell resolution three-dimensional imaging of intact organoids.</a> Journal of Visualized Experiments. (160), e60709 (2020).</li><li>Dekkers, J. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-resolution+3D+imaging+of+fixed+and+cleared+organoids.">High-resolution 3D imaging of fixed and cleared organoids.</a> Nature Protocols. 14 (6), 1756-1771 (2019).</li><li>O'Rourke, K. P., Dow, L. E., Lowe, S. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immunofluorescent+staining+of+mouse+intestinal+stem+cells.">Immunofluorescent staining of mouse intestinal stem cells.</a> Bio Protocols. 6 (4), 1732 (2016).</li><li>Nwani, N. G., Sima, L. E., Nieves-Neira, W., Matei, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeting+the+microenvironment+in+high+grade+serous+ovarian+cancer.">Targeting the microenvironment in high grade serous ovarian cancer.</a> Cancers. 10 (8), 266 (2018).</li><li>Ghoneum, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Exploring+the+clinical+value+of+tumor+microenvironment+in+platinum-resistant+ovarian+cancer.">Exploring the clinical value of tumor microenvironment in platinum-resistant ovarian cancer.</a> Seminars in Cancer Biology. 77, 83-98 (2021).</li><li>Yang, Y., Yang, Y., Yang, J., Zhao, X., Wei, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tumor+microenvironment+in+ovarian+cancer:+function+and+therapeutic+strategy.">Tumor microenvironment in ovarian cancer: function and therapeutic strategy.</a> Frontiers in Cell and Developmental Biology. 8, 758 (2020).</li><li>van de Wetering, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Prospective+derivation+of+a+living+organoid+biobank+of+colorectal+cancer+patients.">Prospective derivation of a living organoid biobank of colorectal cancer patients.</a> Cell. 161 (4), 933-945 (2015).</li><li>Broutier, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+primary+liver+cancer-derived+organoid+cultures+for+disease+modeling+and+drug+screening.">Human primary liver cancer-derived organoid cultures for disease modeling and drug screening.</a> Nature Medicine. 23 (12), 1424-1435 (2017).</li><li>Drost, J., Clevers, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Organoids+in+cancer+research.">Organoids in cancer research.</a> Nature Reviews Cancer. 18 (7), 407-418 (2018).</li><li>Cybulla, E., Vindigni, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Leveraging+the+replication+stress+response+to+optimize+cancer+therapy.">Leveraging the replication stress response to optimize cancer therapy.</a> Nature Reviews. , (2022).</li></ol>

La risposta al danno del DNA svolge un ruolo fondamentale sia nello sviluppo del cancro ovarico che nella resistenza alla chemioterapia. Pertanto, una conoscenza approfondita dei meccanismi di riparazione del DNA è imperativa. Qui viene presentata una metodologia per studiare le proteine di riparazione del danno al DNA in organoidi intatti 3D. Viene sviluppato un protocollo riproducibile e affidabile che utilizza anticorpi caratteristici per valutare il danno al DNA, la ricombinazione omologa, l'unione finale non omolog...

Il cancro ovarico è la principale causa di morte a causa di tumori maligni ginecologici. La maggior parte dei pazienti è trattata con farmaci dannosi per il DNA come il carboplatino, e quelli con tumori con deficit di riparazione della ricombinazione omologa (HRR) possono ricevere inibitori della poli (ADP-ribosio) polimerasi (PARP) 1,2. Tuttavia, la maggior parte dei pazienti sviluppa resistenza a queste terapie e muore entro 5 anni dalla diagnosi. La disregolazione della risposta al danno del DNA (DDR) è stata associata allo sviluppo del cancro ovarico e alla chemioterapia e alla resistenza agli inibitori di PARP3. Pertanto, lo studio della DDR è fondamentale per comprendere la fisiopatologia del cancro ovarico, i potenziali biomarcatori e le nuove terapie mirate.
Gli attuali metodi per valutare il DDR utilizzano l'immunofluorescenza (IF), in quanto ciò consente l'identificazione accurata e la localizzazione delle proteine danneggiate dal DNA e degli analoghi nucleotidici. Una volta che c'è una rottura a doppio filamento (DSB) nel DNA, la proteina istonica H2AX viene rapidamente fosforilata, formando un punto focale in cui si riuniscono le proteine di riparazione del danno al DNA4. Questa fosforilazione può essere facilmente identificata utilizzando IF; infatti, il saggio ɣ-H2AX è stato comunemente impiegato per confermare l'induzione di un DSB 5,6,7,8,9. Un aumento del danno al DNA è stato associato alla sensibilità al platino e all'efficacia degli agenti dannosi per il DNA 10,11,12 e ɣ-H2AX è stato proposto come biomarcatore associato alla risposta alla chemioterapia in altri trattamenti antitumorali 13. Su un DSB, una cellula esperta in HRR esegue una serie di eventi che portano BRCA1 e BRCA2 a reclutare RAD51 per sostituire la proteina di replicazione A (RPA) e legarsi al DNA. La riparazione HRR utilizza un modello di DNA per riparare fedelmente il DSB. Tuttavia, quando i tumori sono carenti di HRR, si basano su percorsi di riparazione alternativi come l'unione finale non omologa (NHEJ). NHEJ è noto per essere soggetto a errori e crea un elevato carico mutazionale sulla cellula, che utilizza 53BP1 come regolatore positivo14. Queste proteine danneggiano il DNA possono essere accuratamente identificate come focolai usando IF. Oltre alla colorazione per le proteine, l'IF può essere utilizzato per studiare la protezione della forcella e la formazione di gap di DNA a singolo filamento. La capacità di avere forcelle stabili è stata correlata con la risposta al platino e, recentemente, i saggi gap hanno mostrato il potenziale per prevedere la risposta agli inibitori PARP 6,15,16,17. Pertanto, la colorazione per gli analoghi nucleotidici dopo l'introduzione nel genoma è un altro modo per studiare il DDR.
Ad oggi, la valutazione della DDR nel carcinoma ovarico è stata in gran parte limitata a linee cellulari 2D omogenee che non ricapitolano l'eterogeneità clonale, il microambiente o l'architettura dei tumori in vivo 18,19. Recenti ricerche suggeriscono che gli organoidi sono superiori alle linee cellulari 2D nello studio di processi biologici complessi come i meccanismi DDR6. La presente metodologia valuta RAD51, ɣ-H2AX, 53BP1, RPA e geminina nelle DOP. Questi metodi valutano l'organoide intatto e consentono lo studio dei meccanismi DDR in un contesto più simile al microambiente tumorale in vivo. Insieme alla microscopia confocale e al conteggio automatico dei fuochi, questa metodologia può aiutare a comprendere il percorso DDR nel cancro ovarico e personalizzare i piani di trattamento per le pazienti.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>1x phosphate buffered saline with calcium and magnesium (PBS++)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>14-040-133</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1x phosphate buffered saline without calcium and magnesium (PBS)</td>
			<td>Fisher Scientific&#160;</td>
			<td>ICN1860454</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ant-53BP1 Antibody&#160;</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>612522</td>
			<td>diluted to 1:500 in staining buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ant-Geminin Antibody&#160;</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab104306</td>
			<td>diluted to 1:200 in staining buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Geminin Antibody&#160;</td>
			<td>ProteinTech</td>
			<td>10802-1-AP</td>
			<td>diluted to 1:400 in staining buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-RAD51 Antibody&#160;</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab133534</td>
			<td>diluted to 1:1000 in staining buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-yH2AX Antibody&#160;</td>
			<td>Millipore-Sigma</td>
			<td>05-636</td>
			<td>diluted to 1:500 in staining buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ant-phospho-RPA32 (S4/S8) Antibody</td>
			<td>Bethyl Laboratories&#160;</td>
			<td>A300-245A-M</td>
			<td>diluted to 1:200 in staining buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine Serum Albumin (BSA)</td>
			<td>Fisher Scientific&#160;</td>
			<td>BP1605 100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge; Sorvall St 16R Centrifuge</td>
			<td>Thermo Scientific&#160;</td>
			<td>75004240</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Confocal Microscope, Leica SP5 confocal system DMI4000</td>
			<td>Leica&#160;</td>
			<td>389584</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Conical Tubes, 15 mL</td>
			<td>Corning&#160;</td>
			<td>14-959-53A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Countess 3 FL Automated Cell Counter (Cell Counting Machine)&#160;</td>
			<td>Thermo Scientific&#160;</td>
			<td>AMQAF2000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Countess Cell Counting Chamber Slides</td>
			<td>Thermo Scientific&#160;</td>
			<td>C10228</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cover Slip</td>
			<td>LA Colors</td>
			<td></td>
			<td>Any clear nail polish will suffice</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cultrex&#160;RGF Basement Membrane Extract, Type 2</td>
			<td>&#160;R&#38;D Systems&#160;</td>
			<td>3533-010-02</td>
			<td>Could probably use Matrigel or other BME Matrix&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DAPI&#160;</td>
			<td>Thermo Scientific&#160;</td>
			<td>&#160;R37606</td>
			<td>NucBlue Fixed Cell ReadyProbes Reagent, Diluted in 1x PBS&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycine&#160;</td>
			<td>Fisher Scientific&#160;</td>
			<td>NC0756056</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>JCountPro</td>
			<td>JCountPro</td>
			<td></td>
			<td>For access to the software, Email: jcountpro@gmail.com&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microcentrifuge Tubes&#160;</td>
			<td>Fisher Scientific&#160;</td>
			<td>07-000-243</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nail Polish&#160;</td>
			<td>StatLab</td>
			<td>SL102450</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Parafomraldehyde (PFA), 2%&#160;</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences&#160;</td>
			<td>157-4</td>
			<td>Dilute to 4% PFA in PBS++ to obtain 2% PFA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Permeabilization Buffer</td>
			<td>Made in Lab</td>
			<td></td>
			<td>0.2% X-100 Triton in PBS++&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipette</td>
			<td>Rainin</td>
			<td>17014382</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipette Tips&#160;</td>
			<td>Rainin&#160;</td>
			<td>17014967</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ProLong Gold Antifade Mountant</td>
			<td>Thermo Scientific&#160;</td>
			<td>&#160;P36930</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Staining Buffer&#160;</td>
			<td>Made in Lab</td>
			<td></td>
			<td>0.5% BSA, 0.15% Glycine, 0.1% X-100 Triton in PBS++&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thermo Scientific Nunc Lab-Tek II Chamber Slide System&#160;</td>
			<td>Thermo Scientific&#160;</td>
			<td>12-565-8</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>Sigma-Alderich&#160;</td>
			<td>11332481001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypan Blue Solution, 0.4%</td>
			<td>Thermo Scientific&#160;</td>
			<td>15250061</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TrypLE Express</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>12604013</td>
			<td>animal origin-free, recombinant enzyme</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>X-RAD 320 Biological Irradiator&#160;</td>
			<td>Precision X-Ray Irradiation&#160;</td>
			<td>X-RAD320</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
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visualizing dna damage repair proteins in patient-derived ovarian cancer organoids via immunofluorescence assays

L'immunofluorescenza è una delle tecniche più utilizzate per visualizzare antigeni bersaglio con elevata sensibilità e specificità, consentendo l'identificazione accurata e la localizzazione di proteine, glicani e piccole molecole. Mentre questa tecnica è ben consolidata nella coltura cellulare bidimensionale (2D), si sa meno del suo uso in modelli cellulari tridimensionali (3D). Gli organoidi del cancro ovarico sono modelli tumorali 3D che ricapitolano l'eterogeneità clonale delle cellule tumorali, il microambiente tumorale e le interazioni cellula-cellula e cellula-matrice. Pertanto, sono superiori alle linee cellulari per la valutazione della sensibilità ai farmaci e dei biomarcatori funzionali. Pertanto, la capacità di utilizzare l'immunofluorescenza sugli organoidi del cancro ovarico primario è estremamente utile per comprendere la biologia di questo cancro. L'attuale studio descrive la tecnica di immunofluorescenza per rilevare le proteine di riparazione del danno al DNA in organoidi di cancro ovarico (PDO) sierosi di alto grado derivati da pazienti. Dopo aver esposto le DOP a radiazioni ionizzanti, l'immunofluorescenza viene eseguita su organoidi intatti per valutare le proteine nucleari come focolai. Le immagini vengono raccolte utilizzando l'imaging z-stack al microscopio confocale e analizzate utilizzando un software di conteggio automatico dei fuochi. I metodi descritti consentono l'analisi del reclutamento temporale e speciale di proteine di riparazione del danno al DNA e la colocalizzazione di queste proteine con marcatori del ciclo cellulare.

Il protocollo presentato può colorare, visualizzare e quantificare con successo le proteine di riparazione del danno al DNA nucleare negli organoidi. Questa tecnica è stata utilizzata per colorare e valutare le DOP sia prima che dopo l'irradiazione. Le PDO sono state esposte a 10 Gy di radiazioni e valutate per i seguenti biomarcatori: ɣ-H2AX (Figura 1), un marker di danno al DNA; RAD51 (Figura 2), un indicatore per HRR; 53BP1, un marcatore di NHEJ; RPA, un m...

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Visualizing DNA Damage Repair Proteins in Patient-Derived Ovarian Cancer Organoids via Immunofluorescence Assays

Il presente protocollo descrive i metodi per valutare le proteine di riparazione del danno al DNA negli organoidi di cancro ovarico derivati da pazienti. Qui sono inclusi metodi completi di placcatura e colorazione, nonché procedure di quantificazione dettagliate e oggettive.

Visualizzazione delle proteine di riparazione del danno al DNA negli organoidi del cancro ovarico derivati dal paziente tramite saggi di immunofluorescenza

Immunofluorescence is one of the most widely used techniques to visualize target antigens with high sensitivity and specificity, allowing for the accurate ...

Lo studio della risposta al danno del DNA è necessario per comprendere la fisiopatologia dei potenziali biomarcatori del cancro ovarico in nuove terapie mirate. Questa tecnica consente al campione di rimanere intatto e consente l'esame degli antigeni nella loro posizione d'azione. Questo protocollo è rapido e può essere adattato a qualsiasi antigene suscettibile di immunofluorescenza.Questo metodo fornisce informazioni sul cancro ovarico e sui processi di riparazione del danno al DNA coinvolti nella resistenza chemioterapica e agli inibitori PARP. Questi metodi possono essere applicati ad altre aree di studio che prevedono l'uso di colture 3D e organoidi. Per iniziare, aspirare il mezzo dagli organoidi irradiati e incubati senza interrompere la matrice 3D.Quindi lavare con 300 microlitri di PBS. Fissare gli organoidi in 300 microlitri di paraformaldeide al 2% per 10 minuti. Dopo il fissaggio, lavare gli organoidi con 300 microlitri di tampone anticolorante e metterli su uno shaker per cinque minuti.Quindi permeabilizzare l'organoide aggiungendo delicatamente 300 microlitri di tampone di permeabilizzazione. Dopo 20 minuti di incubazione, rimuovere il tampone e lavare con 300 microlitri di tampone colorante. Posizionare gli organoidi su uno shaker per cinque minuti.Quindi, aggiungere 300 microlitri di tampone colorante per bloccare la fase di permeabilizzazione. Posizionare sullo shaker per 30 minuti e aspirare il tampone anticolorante con una pipetta. Quindi aggiungere 300 microlitri di anticorpi primari diluiti in tampone colorante.Incubare a quattro gradi Celsius per 16 ore. Dopo l'incubazione, rimuovere la soluzione anticorpale primaria. Eseguire tre lavaggi con 300 microlitri di tampone anticolorante per cinque minuti ciascuno sullo shaker.Aggiungere 300 microlitri di soluzione anticorpale secondaria diluita in tampone colorante e incubare per un'ora al buio. Dopo un'ora, aspirare la soluzione anticorpale secondaria e aggiungere 300 microlitri di DAPI diluito. Mettere sullo shaker per cinque minuti.Eseguire tre lavaggi con 300 microlitri di tampone anticolorante per cinque minuti ciascuno sullo shaker. Rimuovere il tampone anticolorante e staccare le camere utilizzando il kit di rimozione fornito con le guide della camera. Tagliare la punta di una punta di pipetta P200 e utilizzarla per aggiungere un mezzo di montaggio per coprire ciascun pozzetto contenente una linguetta organoide.Posizionare una linguetta di copertura sul campione evitando le bolle. Prendi lo smalto trasparente e dipingilo sui lati del vetro di copertura per sigillare il vetrino. Lasciare indurire per un'ora e poi posizionarlo a 20 gradi Celsius.Acquisisci immagini utilizzando un microscopio confocale utilizzando un obiettivo 63X con olio ad immersione. Utilizzando questo protocollo, gli organoidi di cancro ovarico derivati dal paziente sono stati colorati per le proteine di riparazione del danno al DNA prima e dopo l'irradiazione e valutati per biomarcatori come gamma H2AX, un marker di danno al DNA, e RAD51, un marker per la riparazione della ricombinazione omologa. Anche RPA, un marker dello stress di replicazione, 53BP1, un marker di ingiunzione non omologa, e Geminin, un marcatore del ciclo cellulare di fase GS2 sono stati valutati utilizzando questa tecnica.Le linguette BME tendono a depolimerizzare, quindi prestare molta attenzione dopo il fissaggio e l'aspirazione è vitale. L'analisi degli antigeni per determinare il danno agli organoidi e la capacità di montare una risposta al danno del DNA potrebbe aiutare nella valutazione della resistenza chemioterapica.

Research

JoVE Journal

Cancer Research

Visualizing DNA Damage Repair Proteins in Patient-Derived Ovarian Cancer Organoids via Immunofluorescence Assays

Evaluating In Vitro DNA Damage Using Comet Assay

Evaluating In Vitro DNA Damage Using Comet Assay

Valutazione In Vitro del DNA danni utilizzando test della cometa

DNA damage is a common phenomenon for each cell during its lifespan, and is defined as an alteration of the chemical structure of genomic DNA. Cancer ...

Ricerca

Ricerca sul cancro

Characterizing DNA Repair Processes at Transient and Long-lasting Double-strand DNA Breaks by Immunofluorescence Microscopy

Che caratterizzano i processi di riparazione del DNA alle rotture del DNA transitori e duraturo doppio filo da microscopia di immunofluorescenza

The repair of double-stranded breaks (DSBs) in DNA is a highly coordinated process, necessitating the formation and resolution of multi-protein repair ...

Establishment of Gastric Cancer Patient-derived Xenograft Models and Primary Cell Lines

Stabilimento di modelli Xenograft derivati dal paziente derivato dal paziente e linee cellulari primarie

The use of preclinical models to advance our understanding of tumor biology and investigate the efficacy of therapeutic agents is key to cancer research. ...

Testing Targeted Therapies in Cancer using Structural DNA Alteration Analysis and Patient-Derived Xenografts

Test delle terapie mirate nel cancro utilizzando l'analisi dell'alterazione strutturale del DNA e gli Xenogrini derivati dal paziente

We present here an integrative approach for testing efficacy of targeted therapies that combines the next generation sequencing technolo-gies, therapeutic ...

Immunofluorescence Imaging of DNA Damage and Repair Foci in Human Colon Cancer Cells

Immunofluorescenza Immagini di danno al DNA e riparazione Foci nelle cellule tumorali del colon umano

The purpose of the manuscript is to provide a step-by-step protocol for performing immunofluorescence microscopy to study the radiation-induced DNA damage ...

High-Throughput In Vitro Assay using Patient-Derived Tumor Organoids

High-Throughput In Vitro Assay using Patient-Derived Tumor Organoids

Test in vitro ad alto rendimento utilizzando organoidi tumorali derivati dal paziente

Patient-derived tumor organoids (PDOs) are expected to be a preclinical cancer model with better reproducibility of disease than traditional cell culture ...

Profiling Sensitivity to Targeted Therapies in EGFR-Mutant NSCLC Patient-Derived Organoids

Profilazione della sensibilità alle terapie mirate negli organoidi derivati dal paziente NSCLC EGFR-Mutant

Novel 3D cancer organoid cultures derived from clinical patient specimens represent an important model system to evaluate intratumor heterogeneity and ...

Generation and Culturing of High-Grade Serous Ovarian Cancer Patient-Derived Organoids

Generazione e coltura di organoidi di alto grado derivati da pazienti con carcinoma ovarico sieroso

Organoids are 3D dynamic tumor models that can be grown successfully from patient-derived ovarian tumor tissue, ascites, or pleural fluid and aid in the ...

Quantifying Replication Stress in Ovarian Cancer Cells Using Single-Stranded DNA Immunofluorescence

Quantificazione dello stress di replicazione nelle cellule tumorali ovariche mediante immunofluorescenza del DNA a singolo filamento

Replication stress is a hallmark of several ovarian cancers. Replication stress can emerge from multiple sources, including double-strand breaks, ...

Establishment and Culture of Patient-Derived Breast Organoids

Istituzione e coltura di organoidi mammari derivati da pazienti

Breast cancer is a complex disease that has been classified into several different histological and molecular subtypes. Patient-derived breast tumor ...