Name: visualizing dna damage repair proteins in patient-derived ovarian cancer organoids via immunofluorescence assays
Uploaded: 2023-02-24T14:20:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Visualizing DNA Damage Repair Proteins in Patient-Derived Ovarian Cancer Organoids via Immunofluorescence Assays at JoVE.com

Vi er takknemlige for veiledningen fra Pavel Lobachevsky, PhD i etableringen av denne protokollen. Vi vil også gjerne anerkjenne Washington University's School of Medicine i St. Louis Department of Obstetrics and Gynecology og Division of Gynecologic Oncology, Washington Universitys Dean's Scholar Program, Gynecologic Oncology Group Foundation og Reproductive Scientist Development Program for deres støtte til dette prosjektet.

Tumorvev og ascites ble oppnådd etter å ha innhentet pasientens samtykke som en del av et gynekologisk onkologisk biorepositorium som ble godkjent av Washington University i St. Louis Institutional Review Board (IRB). Pasienter ble inkludert hvis de hadde avansert stadium høygradig serøs ovariekreft (HGSOC). Alle prosedyrer ble utført ved romtemperatur på benken med mindre annet er spesifisert. Alle reagenser ble tilberedt ved romtemperatur (med mindre annet er angitt) og oppbevart ved 4 °C.
<p class="jove_tit...

<ol>
	<li>Lheureux, S., Gourley, C., Vergote, I., Oza, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Epithelial+ovarian+cancer.">Epithelial ovarian cancer.</a> Lancet Oncology. 393 (10177), 1240-1253 (2019).</li><li>Tew, W. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PARP+inhibitors+in+the+management+of+ovarian+cancer:+ASCO+guideline.">PARP inhibitors in the management of ovarian cancer: ASCO guideline.</a> Journal of Clinical Oncology. 38 (30), 3468-3493 (2020).</li><li>Tomasova, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DNA+repair+and+ovarian+carcinogenesis:+impact+on+risk,+prognosis+and+therapy+outcome.">DNA repair and ovarian carcinogenesis: impact on risk, prognosis and therapy outcome.</a> Cancers. 12 (7), 1713 (2020).</li><li>Mukhopadhyay, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+a+functional+assay+for+homologous+recombination+status+in+primary+cultures+of+epithelial+ovarian+tumor+and+correlation+with+sensitivity+to+poly(ADP-Ribose)+polymerase+inhibitors.">Development of a functional assay for homologous recombination status in primary cultures of epithelial ovarian tumor and correlation with sensitivity to poly(ADP-Ribose) polymerase inhibitors.</a> Clinical Cancer Research. 16 (8), 2344-2351 (2010).</li><li>Graeser, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+marker+of+homologous+recombination+predicts+pathologic+complete+response+to+neoadjuvant+chemotherapy+in+primary+breast+cancer.">A marker of homologous recombination predicts pathologic complete response to neoadjuvant chemotherapy in primary breast cancer.</a> Clinical Cancer Research. 16 (24), 6159-6168 (2010).</li><li>Hill, S. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Prediction+of+DNA+repair+inhibitor+response+in+short-term+patient-derived+ovarian+cancer+organoids.">Prediction of DNA repair inhibitor response in short-term patient-derived ovarian cancer organoids.</a> Cancer Discovery. 8 (11), 1404-1421 (2018).</li><li>Naipal, K. A. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+ex+vivo+assay+to+select+homologous+recombination-deficient+breast+tumors+for+PARP+inhibitor+treatment.">Functional ex vivo assay to select homologous recombination-deficient breast tumors for PARP inhibitor treatment.</a> Clinical Cancer Research. 20 (18), 4816-4826 (2014).</li><li>Tumiati, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+functional+homologous+recombination+assay+predicts+primary+chemotherapy+response+and+long-term+survival+in+ovarian+cancer+patients.">A functional homologous recombination assay predicts primary chemotherapy response and long-term survival in ovarian cancer patients.</a> Clinical Cancer Research. 24 (18), 4482-4493 (2018).</li><li>Mukhopadhyay, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Clinicopathological+features+of+homologous+recombination-deficient+epithelial+ovarian+cancers:+sensitivity+to+PARP+inhibitors,+platinum,+and+survival.">Clinicopathological features of homologous recombination-deficient epithelial ovarian cancers: sensitivity to PARP inhibitors, platinum, and survival.</a> Cancer Research. 72 (22), 5675-5682 (2012).</li><li>Johnson, S. W., Laub, P. B., Beesley, J. S., Ozols, R. F., Hamilton, T. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Increased+platinum-DNA+damage+tolerance+is+associated+with+cisplatin+resistance+and+cross-resistance+to+various+chemotherapeutic+agents+in+unrelated+human+ovarian+cancer+cell+lines.">Increased platinum-DNA damage tolerance is associated with cisplatin resistance and cross-resistance to various chemotherapeutic agents in unrelated human ovarian cancer cell lines.</a> Cancer Research. 57 (5), 850-856 (1997).</li><li>Stefanou, D. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Aberrant+DNA+damage+response+pathways+may+predict+the+outcome+of+platinum+chemotherapy+in+ovarian+cancer.">Aberrant DNA damage response pathways may predict the outcome of platinum chemotherapy in ovarian cancer.</a> PLoS One. 10 (2), 0117654 (2015).</li><li>Helleday, T., Petermann, E., Lundin, C., Hodgson, B., Sharma, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DNA+repair+pathways+as+targets+for+cancer+therapy.">DNA repair pathways as targets for cancer therapy.</a> Nature Reviews Cancer. 8 (3), 193-204 (2008).</li><li>Ivashkevich, A., Redon, C. E., Nakamura, A. J., Martin, R. F., Martin, O. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Use+of+the+&#947;-H2AX+assay+to+monitor+DNA+damage+and+repair+in+translational+cancer+research.">Use of the &#947;-H2AX assay to monitor DNA damage and repair in translational cancer research.</a> Cancer Letters. 327 (1-2), 123-133 (2012).</li><li>Fuh, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Homologous+recombination+deficiency+real-time+clinical+assays,+ready+or+not.">Homologous recombination deficiency real-time clinical assays, ready or not.</a> Gynecologic Oncology. 159 (3), 877-886 (2020).</li><li>Cong, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Replication+gaps+are+a+key+determinant+of+PARP+inhibitor+synthetic+lethality+with+BRCA+deficiency.">Replication gaps are a key determinant of PARP inhibitor synthetic lethality with BRCA deficiency.</a> Molecular Cell. 81 (15), 3128-3144 (2021).</li><li>Lee, E. K., Matulonis, U. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PARP+inhibitor+resistance+mechanisms+and+implications+for+post-progression+combination+therapies.">PARP inhibitor resistance mechanisms and implications for post-progression combination therapies.</a> Cancers. 12 (8), 2054 (2020).</li><li>Panzarino, N. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Replication+gaps+underlie+BRCA+deficiency+and+therapy+response.">Replication gaps underlie BRCA deficiency and therapy response.</a> Cancer Research. 81 (5), 1388-1397 (2021).</li><li>Yee, C., Dickson, K. A., Muntasir, M. N., Ma, Y., Marsh, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Three-dimensional+modelling+of+ovarian+cancer:+from+cell+lines+to+organoids+for+discovery+and+personalized+medicine.">Three-dimensional modelling of ovarian cancer: from cell lines to organoids for discovery and personalized medicine.</a> Frontiers in Bioengineering and Biotechnology. 10, 836984 (2022).</li><li>Regan, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immunofluorescence+staining+of+colorectal+cancer+patient-derived+organoids.">Immunofluorescence staining of colorectal cancer patient-derived organoids.</a> Methods Cell Biology. 171, 163-171 (2022).</li><li>Graham, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+and+culturing+of+high-grade+serous+ovarian+cancer+patient+derived+organoids.">Generation and culturing of high-grade serous ovarian cancer patient derived organoids.</a> Journal of Visualized Experiments. (191), (2023).</li><li>Jakl, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Validation+of+JCountPro+software+for+efficient+assessment+of+ionizing+radiation-induced+foci+in+human+lymphocytes.">Validation of JCountPro software for efficient assessment of ionizing radiation-induced foci in human lymphocytes.</a> International Journal of Radiation Biology. 92 (12), 766-773 (2016).</li><li>Mullen, M. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=GAS6/AXL+inhibition+enhances+ovarian+cancer+sensitivity+to+chemotherapy+and+PARP+inhibition+through+increased+DNA+damage+and+enhanced+replication+stress.">GAS6/AXL inhibition enhances ovarian cancer sensitivity to chemotherapy and PARP inhibition through increased DNA damage and enhanced replication stress.</a> Molecular Cancer Research. 20 (2), 265-279 (2022).</li><li>van Ineveld, R. L., Ariese, H. C. R., Wehrens, E. J., Dekkers, J. F., Rios, A. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-cell+resolution+three-dimensional+imaging+of+intact+organoids.">Single-cell resolution three-dimensional imaging of intact organoids.</a> Journal of Visualized Experiments. (160), e60709 (2020).</li><li>Dekkers, J. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-resolution+3D+imaging+of+fixed+and+cleared+organoids.">High-resolution 3D imaging of fixed and cleared organoids.</a> Nature Protocols. 14 (6), 1756-1771 (2019).</li><li>O'Rourke, K. P., Dow, L. E., Lowe, S. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immunofluorescent+staining+of+mouse+intestinal+stem+cells.">Immunofluorescent staining of mouse intestinal stem cells.</a> Bio Protocols. 6 (4), 1732 (2016).</li><li>Nwani, N. G., Sima, L. E., Nieves-Neira, W., Matei, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeting+the+microenvironment+in+high+grade+serous+ovarian+cancer.">Targeting the microenvironment in high grade serous ovarian cancer.</a> Cancers. 10 (8), 266 (2018).</li><li>Ghoneum, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Exploring+the+clinical+value+of+tumor+microenvironment+in+platinum-resistant+ovarian+cancer.">Exploring the clinical value of tumor microenvironment in platinum-resistant ovarian cancer.</a> Seminars in Cancer Biology. 77, 83-98 (2021).</li><li>Yang, Y., Yang, Y., Yang, J., Zhao, X., Wei, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tumor+microenvironment+in+ovarian+cancer:+function+and+therapeutic+strategy.">Tumor microenvironment in ovarian cancer: function and therapeutic strategy.</a> Frontiers in Cell and Developmental Biology. 8, 758 (2020).</li><li>van de Wetering, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Prospective+derivation+of+a+living+organoid+biobank+of+colorectal+cancer+patients.">Prospective derivation of a living organoid biobank of colorectal cancer patients.</a> Cell. 161 (4), 933-945 (2015).</li><li>Broutier, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+primary+liver+cancer-derived+organoid+cultures+for+disease+modeling+and+drug+screening.">Human primary liver cancer-derived organoid cultures for disease modeling and drug screening.</a> Nature Medicine. 23 (12), 1424-1435 (2017).</li><li>Drost, J., Clevers, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Organoids+in+cancer+research.">Organoids in cancer research.</a> Nature Reviews Cancer. 18 (7), 407-418 (2018).</li><li>Cybulla, E., Vindigni, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Leveraging+the+replication+stress+response+to+optimize+cancer+therapy.">Leveraging the replication stress response to optimize cancer therapy.</a> Nature Reviews. , (2022).</li></ol>

DNA-skaderesponsen spiller en integrert rolle i både utviklingen av eggstokkreft og kjemoterapiresistens. Derfor er en grundig forståelse av DNA-reparasjonsmekanismer avgjørende. Her presenteres en metodikk for å studere DNA-skadereparasjonsproteiner i 3D, intakte organoider. En reproduserbar, pålitelig protokoll er utviklet ved hjelp av kjennetegn antistoffer for å evaluere DNA-skade, homolog rekombinasjon, ikke-homolog slutt sammenføyning, og replikasjonsstress. Det er viktig at disse metodene valideres ved hjel...

Eggstokkreft er den viktigste dødsårsaken på grunn av gynekologisk malignitet. De fleste pasienter behandles med DNA-skadelige legemidler som karboplatin, og de med homolog rekombinasjonsreparasjon (HRR) -mangelfulle svulster kan gis poly (ADP-ribose) polymerase (PARP) hemmere 1,2. Imidlertid utvikler de fleste pasienter motstand mot disse terapiene og dør innen 5 år etter diagnosen. Dysregulering av DNA-skaderesponsen (DDR) har vært assosiert med utvikling av eggstokkreft og både kjemoterapi og PARP-hemmerresistens3. Dermed er studiet av DDR viktig for å forstå patofysiologien til eggstokkreft, potensielle biomarkører og nye målrettede terapier.
Nåværende metoder for å evaluere DDR benytter immunfluorescens (IF), da dette muliggjør nøyaktig identifisering og lokalisering av DNA-skadeproteiner og nukleotidanaloger. Når det er en dobbeltstrenget pause (DSB) i DNA, blir histonproteinet H2AX raskt fosforylert, og danner et fokus der DNA-skadereparasjonsproteiner samles4. Denne fosforyleringen kan lett identifiseres ved hjelp av IF; faktisk har ɣ-H2AX-analysen ofte blitt brukt for å bekrefte induksjonen av en DSB 5,6,7,8,9. Økt DNA-skade har vært assosiert med platinafølsomhet og effekt av DNA-skadelige midler 10,11,12, og ɣ-H2AX har blitt foreslått som en biomarkør assosiert med kjemoterapirespons i andre kreftbehandlinger 13. På en DSB utfører en celle dyktig i HRR en rekke hendelser som fører til at BRCA1 og BRCA2 rekrutterer RAD51 for å erstatte replikasjonsprotein A (RPA) og binde seg til DNA. HRR-reparasjon bruker en DNA-mal for å reparere DSB trofast. Men når svulster er mangelfull i HRR, er de avhengige av alternative reparasjonsveier som ikke-homolog endekobling (NHEJ). NHEJ er kjent for å være utsatt for feil og skaper en høy mutasjonsbelastning på cellen, som bruker 53BP1 som en positiv regulator14. Disse DNA-skadeproteinene kan alle nøyaktig identifiseres som foci ved hjelp av IF. I tillegg til farging for proteiner, kan IF brukes til å studere gaffelbeskyttelse og enkeltstrenget DNA-gapdannelse. Evnen til å ha stabile gafler har vært korrelert med platinarespons, og nylig har gapanalyser vist potensialet til å forutsi responsen på PARP-hemmere 6,15,16,17. Derfor er farging for nukleotidanalogene etter innføring i genomet en annen måte å studere DDR på.
Hittil har evaluering av DDR i eggstokkreft i stor grad vært begrenset til homogene 2D-cellelinjer som ikke rekapitulerer den klonale heterogeniteten, mikromiljøet eller arkitekturen til in vivo-svulster 18,19. Nyere forskning tyder på at organoider er overlegne 2D-cellelinjer når de studerer komplekse biologiske prosesser som DDR-mekanismer6. Den nåværende metodikken evaluerer RAD51, ɣ-H2AX, 53BP1, RPA og geminin i PUD. Disse metodene vurderer den intakte organoiden og tillater studier av DDR-mekanismer i en setting som ligner mer på in vivo-tumormikromiljøet. Sammen med konfokalmikroskopi og automatisert foci-telling, kan denne metoden hjelpe til med å forstå DDR-banen i eggstokkreft og tilpasse behandlingsplaner for pasienter.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>1x phosphate buffered saline with calcium and magnesium (PBS++)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>14-040-133</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1x phosphate buffered saline without calcium and magnesium (PBS)</td>
			<td>Fisher Scientific&#160;</td>
			<td>ICN1860454</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ant-53BP1 Antibody&#160;</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>612522</td>
			<td>diluted to 1:500 in staining buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ant-Geminin Antibody&#160;</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab104306</td>
			<td>diluted to 1:200 in staining buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Geminin Antibody&#160;</td>
			<td>ProteinTech</td>
			<td>10802-1-AP</td>
			<td>diluted to 1:400 in staining buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-RAD51 Antibody&#160;</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab133534</td>
			<td>diluted to 1:1000 in staining buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-yH2AX Antibody&#160;</td>
			<td>Millipore-Sigma</td>
			<td>05-636</td>
			<td>diluted to 1:500 in staining buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ant-phospho-RPA32 (S4/S8) Antibody</td>
			<td>Bethyl Laboratories&#160;</td>
			<td>A300-245A-M</td>
			<td>diluted to 1:200 in staining buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine Serum Albumin (BSA)</td>
			<td>Fisher Scientific&#160;</td>
			<td>BP1605 100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge; Sorvall St 16R Centrifuge</td>
			<td>Thermo Scientific&#160;</td>
			<td>75004240</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Confocal Microscope, Leica SP5 confocal system DMI4000</td>
			<td>Leica&#160;</td>
			<td>389584</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Conical Tubes, 15 mL</td>
			<td>Corning&#160;</td>
			<td>14-959-53A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Countess 3 FL Automated Cell Counter (Cell Counting Machine)&#160;</td>
			<td>Thermo Scientific&#160;</td>
			<td>AMQAF2000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Countess Cell Counting Chamber Slides</td>
			<td>Thermo Scientific&#160;</td>
			<td>C10228</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cover Slip</td>
			<td>LA Colors</td>
			<td></td>
			<td>Any clear nail polish will suffice</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cultrex&#160;RGF Basement Membrane Extract, Type 2</td>
			<td>&#160;R&#38;D Systems&#160;</td>
			<td>3533-010-02</td>
			<td>Could probably use Matrigel or other BME Matrix&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DAPI&#160;</td>
			<td>Thermo Scientific&#160;</td>
			<td>&#160;R37606</td>
			<td>NucBlue Fixed Cell ReadyProbes Reagent, Diluted in 1x PBS&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycine&#160;</td>
			<td>Fisher Scientific&#160;</td>
			<td>NC0756056</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>JCountPro</td>
			<td>JCountPro</td>
			<td></td>
			<td>For access to the software, Email: jcountpro@gmail.com&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microcentrifuge Tubes&#160;</td>
			<td>Fisher Scientific&#160;</td>
			<td>07-000-243</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nail Polish&#160;</td>
			<td>StatLab</td>
			<td>SL102450</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Parafomraldehyde (PFA), 2%&#160;</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences&#160;</td>
			<td>157-4</td>
			<td>Dilute to 4% PFA in PBS++ to obtain 2% PFA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Permeabilization Buffer</td>
			<td>Made in Lab</td>
			<td></td>
			<td>0.2% X-100 Triton in PBS++&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipette</td>
			<td>Rainin</td>
			<td>17014382</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipette Tips&#160;</td>
			<td>Rainin&#160;</td>
			<td>17014967</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ProLong Gold Antifade Mountant</td>
			<td>Thermo Scientific&#160;</td>
			<td>&#160;P36930</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Staining Buffer&#160;</td>
			<td>Made in Lab</td>
			<td></td>
			<td>0.5% BSA, 0.15% Glycine, 0.1% X-100 Triton in PBS++&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thermo Scientific Nunc Lab-Tek II Chamber Slide System&#160;</td>
			<td>Thermo Scientific&#160;</td>
			<td>12-565-8</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>Sigma-Alderich&#160;</td>
			<td>11332481001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypan Blue Solution, 0.4%</td>
			<td>Thermo Scientific&#160;</td>
			<td>15250061</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TrypLE Express</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>12604013</td>
			<td>animal origin-free, recombinant enzyme</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>X-RAD 320 Biological Irradiator&#160;</td>
			<td>Precision X-Ray Irradiation&#160;</td>
			<td>X-RAD320</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

visualizing dna damage repair proteins in patient-derived ovarian cancer organoids via immunofluorescence assays

Immunfluorescens er en av de mest brukte teknikkene for å visualisere målantigener med høy følsomhet og spesifisitet, noe som muliggjør nøyaktig identifisering og lokalisering av proteiner, glykaner og små molekyler. Mens denne teknikken er veletablert i todimensjonal (2D) cellekultur, er mindre kjent om bruken i tredimensjonale (3D) cellemodeller. Eggstokkreftorganoider er 3D-tumormodeller som rekapitulerer tumorcelle klonal heterogenitet, tumormikromiljøet og cellecelle- og cellematriseinteraksjoner. Dermed er de overlegne cellelinjer for evaluering av legemiddelfølsomhet og funksjonelle biomarkører. Derfor er evnen til å utnytte immunfluorescens på primære eggstokkreftorganoider ekstremt gunstig for å forstå biologien til denne kreften. Den nåværende studien beskriver teknikken for immunfluorescens for å oppdage DNA-skadereparasjonsproteiner i høyverdige serøse pasientavledede eggstokkreftorganoider (PUD). Etter å ha utsatt PUDene for ioniserende stråling, utføres immunfluorescens på intakte organoider for å evaluere nukleære proteiner som foci. Bilder samles inn ved hjelp av z-stack-avbildning på konfokalmikroskopi og analyseres ved hjelp av automatisert programvare for focitelling. De beskrevne metodene tillater analyse av tidsmessig og spesiell rekruttering av DNA-skadereparasjonsproteiner og samlokalisering av disse proteinene med cellesyklusmarkører.

Den presenterte protokollen kan med hell flekke, visualisere og kvantifisere nukleære DNA-skadereparasjonsproteiner i organoider. Denne teknikken ble brukt til å beise og evaluere PUD både før og etter bestråling. PUD ble utsatt for 10 Gy stråling og evaluert for følgende biomarkører: ɣ-H2AX (figur 1), en markør for DNA-skade; RAD51 (figur 2), en markør for HRR; 53BP1, en markør for NHEJ; RPA, en markør for replikasjonsspenning (<strong class="xfig"...

Watch this Scientific Journal Video about Visualizing DNA Damage Repair Proteins in Patient-Derived Ovarian Cancer Organoids via Immunofluorescence Assays at JoVE.com

Visualizing DNA Damage Repair Proteins in Patient-Derived Ovarian Cancer Organoids via Immunofluorescence Assays

Denne protokollen beskriver metoder for evaluering av DNA-skadereparasjonsproteiner i pasientavledede eggstokkreftorganoider. Inkludert her er omfattende pletterings- og fargemetoder, samt detaljerte, objektive kvantifiseringsprosedyrer.

Visualisering av DNA-skadereparasjonsproteiner i pasientavledede eggstokkreftorganoider via immunfluorescensanalyser

Immunofluorescence is one of the most widely used techniques to visualize target antigens with high sensitivity and specificity, allowing for the accurate ...

Studien av DNA-skaderesponsen er nødvendig for å forstå patofysiologien til ovariekreftpotensielle biomarkører i ny målrettet terapi. Denne teknikken gjør det mulig for prøven å forbli intakt og tillater undersøkelse av antigener i deres virkningssted. Denne protokollen er rask og kan tilpasses ethvert antigen som er egnet til immunfluorescens.Denne metoden gir innsikt i reparasjonsprosesser for eggstokkreft og DNA-skader involvert i kjemoterapeutisk resistens og PARP-hemmere. Disse metodene kan brukes på andre studieområder som involverer bruk av 3D-kulturer og organoider. For å begynne, aspirer mediet fra de bestrålte og inkuberte organoider uten å forstyrre 3D-matrisen.Vask deretter med 300 mikroliter PBS. Fest organoider i 300 mikroliter 2% paraformaldehyd i 10 minutter. Etter festing, vask organoider med 300 mikroliter fargebuffer og legg dem på en shaker i fem minutter.Deretter permeabiliserer organoid ved forsiktig å tilsette 300 mikroliter permeabiliseringsbuffer. Etter 20 minutters inkubasjon, fjern bufferen og vask med 300 mikroliter fargebuffer. Legg organoidene på en shaker i fem minutter.Deretter legger du til 300 mikroliter fargebuffer for å blokkere permeabiliseringstrinnet. Sett på shakeren i 30 minutter og aspirer fargebufferen med en pipette. Deretter tilsettes 300 mikroliter primære antistoffer fortynnet i fargebuffer.Inkuber ved fire grader Celsius i 16 timer. Etter inkubering, fjern den primære antistoffløsningen. Utfør tre vasker med 300 mikroliter fargebuffer i fem minutter hver på shakeren.Tilsett 300 mikroliter sekundær antistoffoppløsning fortynnet i fargebuffer, og inkuber i en time i mørket. Etter en time, aspirer den sekundære antistoffoppløsningen og tilsett 300 mikroliter fortynnet DAPI. Legg på shakeren i fem minutter.Utfør tre vasker med 300 mikroliter fargebuffer i fem minutter hver på shakeren. Fjern fargebufferen og løsne kamrene ved hjelp av fjerningssettet som følger med kammerlysbildene. Klipp spissen på en P200-pipettespiss og bruk denne til å legge til monteringsmedium for å dekke hver brønn som inneholder en organoidflik.Legg et deksel over prøven mens du unngår bobler. Ta klar neglelakk og mal den på sidene av dekselglasset for å forsegle lysbildet. La det herde i en time og legg det deretter ved 20 grader Celsius.Ta bilder ved hjelp av et konfokalmikroskop ved hjelp av et 63X-objektiv med nedsenkningsolje. Ved hjelp av denne protokollen ble pasientavledede eggstokkreftorganoider farget for DNA-skadereparasjonsproteiner før og etter bestråling, og evaluert for biomarkører som gamma H2AX, en markør for DNA-skade, og RAD51, en markør for homolog rekombinasjonsreparasjon. RPA, en markør for replikasjonsstress, 53BP1, en markør for ikke-homolog påbud, og Geminin, en GS2-fasecellesyklusmarkør ble også evaluert ved hjelp av denne teknikken.BME-tappene har en tendens til å depolymerisere, så det er viktig å følge nøye med etter fiksering og aspirasjon. Analyse av antigenene for å bestemme organoidskaden og evnen til å montere en DNA-skaderespons kan bidra til å bistå i evalueringen av kjemoterapeutisk resistens.

Research

JoVE Journal

Cancer Research

Visualizing DNA Damage Repair Proteins in Patient-Derived Ovarian Cancer Organoids via Immunofluorescence Assays

Evaluating In Vitro DNA Damage Using Comet Assay

Evaluating In Vitro DNA Damage Using Comet Assay

Evaluere In Vitro DNA skade bruk av Comet analysen

DNA damage is a common phenomenon for each cell during its lifespan, and is defined as an alteration of the chemical structure of genomic DNA. Cancer ...

Characterizing DNA Repair Processes at Transient and Long-lasting Double-strand DNA Breaks by Immunofluorescence Microscopy

Karakterisere DNA reparasjon prosesser på forbigående og lang-varer dobbel-strand DNA bryter av Immunofluorescence mikroskopi

The repair of double-stranded breaks (DSBs) in DNA is a highly coordinated process, necessitating the formation and resolution of multi-protein repair ...

Establishment of Gastric Cancer Patient-derived Xenograft Models and Primary Cell Lines

Etablering av magekreft pasient-avledet Xenograft modeller og primær celle Lines

The use of preclinical models to advance our understanding of tumor biology and investigate the efficacy of therapeutic agents is key to cancer research. ...

Testing Targeted Therapies in Cancer using Structural DNA Alteration Analysis and Patient-Derived Xenografts

Testing av målrettede behandlinger mot kreft ved hjelp av strukturell DNA-endringsanalyse og pasientavledede Xenografts

We present here an integrative approach for testing efficacy of targeted therapies that combines the next generation sequencing technolo-gies, therapeutic ...

Immunofluorescence Imaging of DNA Damage and Repair Foci in Human Colon Cancer Cells

Immunofluorescens Avbildning av DNA-skade og reparasjon av foci i humane tykktarmskreftceller

The purpose of the manuscript is to provide a step-by-step protocol for performing immunofluorescence microscopy to study the radiation-induced DNA damage ...

High-Throughput In Vitro Assay using Patient-Derived Tumor Organoids

High-Throughput In Vitro Assay using Patient-Derived Tumor Organoids

High-Throughput In Vitro Assay ved bruk av pasientavledede tumororganoider

Patient-derived tumor organoids (PDOs) are expected to be a preclinical cancer model with better reproducibility of disease than traditional cell culture ...

Profiling Sensitivity to Targeted Therapies in EGFR-Mutant NSCLC Patient-Derived Organoids

Profilering av følsomhet for målrettede terapier i EGFR-mutant NSCLC pasientavledede organoider

Novel 3D cancer organoid cultures derived from clinical patient specimens represent an important model system to evaluate intratumor heterogeneity and ...

Generation and Culturing of High-Grade Serous Ovarian Cancer Patient-Derived Organoids

Generering og dyrking av høygradig serøs eggstokkreft Pasientavledede organoider

Organoids are 3D dynamic tumor models that can be grown successfully from patient-derived ovarian tumor tissue, ascites, or pleural fluid and aid in the ...

Quantifying Replication Stress in Ovarian Cancer Cells Using Single-Stranded DNA Immunofluorescence

Kvantifisering av replikasjonsstress i eggstokkreftceller ved bruk av enkeltstrenget DNA-immunfluorescens

Replication stress is a hallmark of several ovarian cancers. Replication stress can emerge from multiple sources, including double-strand breaks, ...

Establishment and Culture of Patient-Derived Breast Organoids

Etablering og kultur av pasientavledede brystorganoider

Breast cancer is a complex disease that has been classified into several different histological and molecular subtypes. Patient-derived breast tumor ...