Name: visualizing dna damage repair proteins in patient-derived ovarian cancer organoids via immunofluorescence assays
Uploaded: 2023-02-24T14:20:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Visualizing DNA Damage Repair Proteins in Patient-Derived Ovarian Cancer Organoids via Immunofluorescence Assays at JoVE.com

Мы благодарны Павлу Лобачевскому, доктору философии, за руководство в создании этого протокола. Мы также хотели бы поблагодарить Медицинскую школу Вашингтонского университета на кафедре акушерства и гинекологии Сент-Луиса и отделение гинекологической онкологии, Стипендиальную программу декана Вашингтонского университета, Фонд группы гинекологической онкологии и Программу развития репродуктологов за поддержку этого проекта.

Опухолевая ткань и асцит были получены после получения согласия пациента в рамках биорепозитория гинекологической онкологии, который был одобрен Институциональным наблюдательным советом (IRB) Вашингтонского университета в Сент-Луисе. Пациенты были включены, если у них была поздняя ст?...

<ol>
	<li>Lheureux, S., Gourley, C., Vergote, I., Oza, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Epithelial+ovarian+cancer.">Epithelial ovarian cancer.</a> Lancet Oncology. 393 (10177), 1240-1253 (2019).</li><li>Tew, W. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PARP+inhibitors+in+the+management+of+ovarian+cancer:+ASCO+guideline.">PARP inhibitors in the management of ovarian cancer: ASCO guideline.</a> Journal of Clinical Oncology. 38 (30), 3468-3493 (2020).</li><li>Tomasova, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DNA+repair+and+ovarian+carcinogenesis:+impact+on+risk,+prognosis+and+therapy+outcome.">DNA repair and ovarian carcinogenesis: impact on risk, prognosis and therapy outcome.</a> Cancers. 12 (7), 1713 (2020).</li><li>Mukhopadhyay, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+a+functional+assay+for+homologous+recombination+status+in+primary+cultures+of+epithelial+ovarian+tumor+and+correlation+with+sensitivity+to+poly(ADP-Ribose)+polymerase+inhibitors.">Development of a functional assay for homologous recombination status in primary cultures of epithelial ovarian tumor and correlation with sensitivity to poly(ADP-Ribose) polymerase inhibitors.</a> Clinical Cancer Research. 16 (8), 2344-2351 (2010).</li><li>Graeser, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+marker+of+homologous+recombination+predicts+pathologic+complete+response+to+neoadjuvant+chemotherapy+in+primary+breast+cancer.">A marker of homologous recombination predicts pathologic complete response to neoadjuvant chemotherapy in primary breast cancer.</a> Clinical Cancer Research. 16 (24), 6159-6168 (2010).</li><li>Hill, S. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Prediction+of+DNA+repair+inhibitor+response+in+short-term+patient-derived+ovarian+cancer+organoids.">Prediction of DNA repair inhibitor response in short-term patient-derived ovarian cancer organoids.</a> Cancer Discovery. 8 (11), 1404-1421 (2018).</li><li>Naipal, K. A. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+ex+vivo+assay+to+select+homologous+recombination-deficient+breast+tumors+for+PARP+inhibitor+treatment.">Functional ex vivo assay to select homologous recombination-deficient breast tumors for PARP inhibitor treatment.</a> Clinical Cancer Research. 20 (18), 4816-4826 (2014).</li><li>Tumiati, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+functional+homologous+recombination+assay+predicts+primary+chemotherapy+response+and+long-term+survival+in+ovarian+cancer+patients.">A functional homologous recombination assay predicts primary chemotherapy response and long-term survival in ovarian cancer patients.</a> Clinical Cancer Research. 24 (18), 4482-4493 (2018).</li><li>Mukhopadhyay, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Clinicopathological+features+of+homologous+recombination-deficient+epithelial+ovarian+cancers:+sensitivity+to+PARP+inhibitors,+platinum,+and+survival.">Clinicopathological features of homologous recombination-deficient epithelial ovarian cancers: sensitivity to PARP inhibitors, platinum, and survival.</a> Cancer Research. 72 (22), 5675-5682 (2012).</li><li>Johnson, S. W., Laub, P. B., Beesley, J. S., Ozols, R. F., Hamilton, T. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Increased+platinum-DNA+damage+tolerance+is+associated+with+cisplatin+resistance+and+cross-resistance+to+various+chemotherapeutic+agents+in+unrelated+human+ovarian+cancer+cell+lines.">Increased platinum-DNA damage tolerance is associated with cisplatin resistance and cross-resistance to various chemotherapeutic agents in unrelated human ovarian cancer cell lines.</a> Cancer Research. 57 (5), 850-856 (1997).</li><li>Stefanou, D. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Aberrant+DNA+damage+response+pathways+may+predict+the+outcome+of+platinum+chemotherapy+in+ovarian+cancer.">Aberrant DNA damage response pathways may predict the outcome of platinum chemotherapy in ovarian cancer.</a> PLoS One. 10 (2), 0117654 (2015).</li><li>Helleday, T., Petermann, E., Lundin, C., Hodgson, B., Sharma, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DNA+repair+pathways+as+targets+for+cancer+therapy.">DNA repair pathways as targets for cancer therapy.</a> Nature Reviews Cancer. 8 (3), 193-204 (2008).</li><li>Ivashkevich, A., Redon, C. E., Nakamura, A. J., Martin, R. F., Martin, O. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Use+of+the+&#947;-H2AX+assay+to+monitor+DNA+damage+and+repair+in+translational+cancer+research.">Use of the &#947;-H2AX assay to monitor DNA damage and repair in translational cancer research.</a> Cancer Letters. 327 (1-2), 123-133 (2012).</li><li>Fuh, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Homologous+recombination+deficiency+real-time+clinical+assays,+ready+or+not.">Homologous recombination deficiency real-time clinical assays, ready or not.</a> Gynecologic Oncology. 159 (3), 877-886 (2020).</li><li>Cong, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Replication+gaps+are+a+key+determinant+of+PARP+inhibitor+synthetic+lethality+with+BRCA+deficiency.">Replication gaps are a key determinant of PARP inhibitor synthetic lethality with BRCA deficiency.</a> Molecular Cell. 81 (15), 3128-3144 (2021).</li><li>Lee, E. K., Matulonis, U. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PARP+inhibitor+resistance+mechanisms+and+implications+for+post-progression+combination+therapies.">PARP inhibitor resistance mechanisms and implications for post-progression combination therapies.</a> Cancers. 12 (8), 2054 (2020).</li><li>Panzarino, N. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Replication+gaps+underlie+BRCA+deficiency+and+therapy+response.">Replication gaps underlie BRCA deficiency and therapy response.</a> Cancer Research. 81 (5), 1388-1397 (2021).</li><li>Yee, C., Dickson, K. A., Muntasir, M. N., Ma, Y., Marsh, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Three-dimensional+modelling+of+ovarian+cancer:+from+cell+lines+to+organoids+for+discovery+and+personalized+medicine.">Three-dimensional modelling of ovarian cancer: from cell lines to organoids for discovery and personalized medicine.</a> Frontiers in Bioengineering and Biotechnology. 10, 836984 (2022).</li><li>Regan, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immunofluorescence+staining+of+colorectal+cancer+patient-derived+organoids.">Immunofluorescence staining of colorectal cancer patient-derived organoids.</a> Methods Cell Biology. 171, 163-171 (2022).</li><li>Graham, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+and+culturing+of+high-grade+serous+ovarian+cancer+patient+derived+organoids.">Generation and culturing of high-grade serous ovarian cancer patient derived organoids.</a> Journal of Visualized Experiments. (191), (2023).</li><li>Jakl, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Validation+of+JCountPro+software+for+efficient+assessment+of+ionizing+radiation-induced+foci+in+human+lymphocytes.">Validation of JCountPro software for efficient assessment of ionizing radiation-induced foci in human lymphocytes.</a> International Journal of Radiation Biology. 92 (12), 766-773 (2016).</li><li>Mullen, M. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=GAS6/AXL+inhibition+enhances+ovarian+cancer+sensitivity+to+chemotherapy+and+PARP+inhibition+through+increased+DNA+damage+and+enhanced+replication+stress.">GAS6/AXL inhibition enhances ovarian cancer sensitivity to chemotherapy and PARP inhibition through increased DNA damage and enhanced replication stress.</a> Molecular Cancer Research. 20 (2), 265-279 (2022).</li><li>van Ineveld, R. L., Ariese, H. C. R., Wehrens, E. J., Dekkers, J. F., Rios, A. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-cell+resolution+three-dimensional+imaging+of+intact+organoids.">Single-cell resolution three-dimensional imaging of intact organoids.</a> Journal of Visualized Experiments. (160), e60709 (2020).</li><li>Dekkers, J. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-resolution+3D+imaging+of+fixed+and+cleared+organoids.">High-resolution 3D imaging of fixed and cleared organoids.</a> Nature Protocols. 14 (6), 1756-1771 (2019).</li><li>O'Rourke, K. P., Dow, L. E., Lowe, S. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immunofluorescent+staining+of+mouse+intestinal+stem+cells.">Immunofluorescent staining of mouse intestinal stem cells.</a> Bio Protocols. 6 (4), 1732 (2016).</li><li>Nwani, N. G., Sima, L. E., Nieves-Neira, W., Matei, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeting+the+microenvironment+in+high+grade+serous+ovarian+cancer.">Targeting the microenvironment in high grade serous ovarian cancer.</a> Cancers. 10 (8), 266 (2018).</li><li>Ghoneum, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Exploring+the+clinical+value+of+tumor+microenvironment+in+platinum-resistant+ovarian+cancer.">Exploring the clinical value of tumor microenvironment in platinum-resistant ovarian cancer.</a> Seminars in Cancer Biology. 77, 83-98 (2021).</li><li>Yang, Y., Yang, Y., Yang, J., Zhao, X., Wei, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tumor+microenvironment+in+ovarian+cancer:+function+and+therapeutic+strategy.">Tumor microenvironment in ovarian cancer: function and therapeutic strategy.</a> Frontiers in Cell and Developmental Biology. 8, 758 (2020).</li><li>van de Wetering, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Prospective+derivation+of+a+living+organoid+biobank+of+colorectal+cancer+patients.">Prospective derivation of a living organoid biobank of colorectal cancer patients.</a> Cell. 161 (4), 933-945 (2015).</li><li>Broutier, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+primary+liver+cancer-derived+organoid+cultures+for+disease+modeling+and+drug+screening.">Human primary liver cancer-derived organoid cultures for disease modeling and drug screening.</a> Nature Medicine. 23 (12), 1424-1435 (2017).</li><li>Drost, J., Clevers, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Organoids+in+cancer+research.">Organoids in cancer research.</a> Nature Reviews Cancer. 18 (7), 407-418 (2018).</li><li>Cybulla, E., Vindigni, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Leveraging+the+replication+stress+response+to+optimize+cancer+therapy.">Leveraging the replication stress response to optimize cancer therapy.</a> Nature Reviews. , (2022).</li></ol>

Реакция на повреждение ДНК играет неотъемлемую роль как в развитии рака яичников, так и в резистентности к химиотерапии. Поэтому необходимо глубокое понимание механизмов репарации ДНК. Здесь представлена методология изучения белков репарации повреждений ДНК в 3D-интактных органоидах....

Рак яичников является основной причиной смерти от гинекологических злокачественных новообразований. Большинство пациентов лечатся препаратами, повреждающими ДНК, такими как карбоплатин, а пациентам с гомологичными опухолями, дефицитными рекомбинационной репарацией (HRR), можно назначать ингибиторы поли (АДФ-рибозы) полимеразы (PARP) 1,2. Однако у большинства пациентов развивается резистентность к этим методам лечения, и они умирают в течение 5 лет после постановки диагноза. Нарушение регуляции ответа на повреждение ДНК (DDR) было связано с развитием рака яичников и резистентностью как к химиотерапии, так и к ингибиторам PARP3. Таким образом, изучение РДР необходимо для понимания патофизиологии рака яичников, потенциальных биомаркеров и новых таргетных методов лечения.
Современные методы оценки DDR используют иммунофлуоресценцию (IF), поскольку она позволяет точно идентифицировать и локализовать белки, повреждающие ДНК, и аналоги нуклеотидов. Как только в ДНК происходит двухцепочечный разрыв (DSB), гистоновый белок H2AX быстро фосфорилируется, образуя очаг, в котором собираются белки репарации повреждений ДНК4. Это фосфорилирование можно легко идентифицировать с помощью IF; фактически, анализ ɣ-H2AX обычно используется для подтверждения индукции DSB 5,6,7,8,9. Повышенное повреждение ДНК было связано с чувствительностью платины и эффективностью повреждающих ДНК агентов 10,11,12, и ɣ-H2AX был предложен в качестве биомаркера, связанного с ответом на химиотерапию в других методах лечения рака 13. При DSB клетка, обладающая HRR, выполняет ряд событий, которые приводят к тому, что BRCA1 и BRCA2 рекрутируют RAD51 для замены репликационного белка A (RPA) и связывания с ДНК. Восстановление HRR использует шаблон ДНК для точного восстановления DSB. Однако, когда опухоли испытывают дефицит HRR, они полагаются на альтернативные пути репарации, такие как негомологичное соединение концов (NHEJ). Известно, что NHEJ подвержен ошибкам и создает высокую мутационную нагрузку на клетку, которая использует 53BP1 в качестве положительного регулятора14. Все эти белки, повреждающие ДНК, могут быть точно идентифицированы как очаги с помощью IF. В дополнение к окрашиванию белков, IF может быть использован для изучения защиты вилок и образования одноцепочечного разрыва ДНК. Способность иметь стабильные вилки коррелировала с ответом платины, и недавно анализы пробелов показали потенциал для прогнозирования ответа на ингибиторы PARP 6,15,16,17. Поэтому окрашивание на нуклеотидные аналоги после введения в геном является еще одним способом изучения ГДР.
На сегодняшний день оценка DDR при раке яичников была в значительной степени ограничена гомогенными 2D-клеточными линиями, которые не повторяют клональную гетерогенность, микроокружение или архитектуру опухолей in vivo 18,19. Недавние исследования показывают, что органоиды превосходят 2D-клеточные линии в изучении сложных биологических процессов, таких как механизмы DDR6. Настоящая методология оценивает RAD51, ɣ-H2AX, 53BP1, RPA и геминин в PDO. Эти методы оценивают интактный органоид и позволяют изучать механизмы DDR в условиях, более похожих на микроокружение опухоли in vivo. Вместе с конфокальной микроскопией и автоматическим подсчетом очагов эта методология может помочь в понимании пути DDR при раке яичников и персонализации планов лечения для пациентов.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>1x phosphate buffered saline with calcium and magnesium (PBS++)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>14-040-133</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1x phosphate buffered saline without calcium and magnesium (PBS)</td>
			<td>Fisher Scientific&#160;</td>
			<td>ICN1860454</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ant-53BP1 Antibody&#160;</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>612522</td>
			<td>diluted to 1:500 in staining buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ant-Geminin Antibody&#160;</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab104306</td>
			<td>diluted to 1:200 in staining buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Geminin Antibody&#160;</td>
			<td>ProteinTech</td>
			<td>10802-1-AP</td>
			<td>diluted to 1:400 in staining buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-RAD51 Antibody&#160;</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab133534</td>
			<td>diluted to 1:1000 in staining buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-yH2AX Antibody&#160;</td>
			<td>Millipore-Sigma</td>
			<td>05-636</td>
			<td>diluted to 1:500 in staining buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ant-phospho-RPA32 (S4/S8) Antibody</td>
			<td>Bethyl Laboratories&#160;</td>
			<td>A300-245A-M</td>
			<td>diluted to 1:200 in staining buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine Serum Albumin (BSA)</td>
			<td>Fisher Scientific&#160;</td>
			<td>BP1605 100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge; Sorvall St 16R Centrifuge</td>
			<td>Thermo Scientific&#160;</td>
			<td>75004240</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Confocal Microscope, Leica SP5 confocal system DMI4000</td>
			<td>Leica&#160;</td>
			<td>389584</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Conical Tubes, 15 mL</td>
			<td>Corning&#160;</td>
			<td>14-959-53A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Countess 3 FL Automated Cell Counter (Cell Counting Machine)&#160;</td>
			<td>Thermo Scientific&#160;</td>
			<td>AMQAF2000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Countess Cell Counting Chamber Slides</td>
			<td>Thermo Scientific&#160;</td>
			<td>C10228</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cover Slip</td>
			<td>LA Colors</td>
			<td></td>
			<td>Any clear nail polish will suffice</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cultrex&#160;RGF Basement Membrane Extract, Type 2</td>
			<td>&#160;R&#38;D Systems&#160;</td>
			<td>3533-010-02</td>
			<td>Could probably use Matrigel or other BME Matrix&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DAPI&#160;</td>
			<td>Thermo Scientific&#160;</td>
			<td>&#160;R37606</td>
			<td>NucBlue Fixed Cell ReadyProbes Reagent, Diluted in 1x PBS&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycine&#160;</td>
			<td>Fisher Scientific&#160;</td>
			<td>NC0756056</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>JCountPro</td>
			<td>JCountPro</td>
			<td></td>
			<td>For access to the software, Email: jcountpro@gmail.com&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microcentrifuge Tubes&#160;</td>
			<td>Fisher Scientific&#160;</td>
			<td>07-000-243</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nail Polish&#160;</td>
			<td>StatLab</td>
			<td>SL102450</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Parafomraldehyde (PFA), 2%&#160;</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences&#160;</td>
			<td>157-4</td>
			<td>Dilute to 4% PFA in PBS++ to obtain 2% PFA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Permeabilization Buffer</td>
			<td>Made in Lab</td>
			<td></td>
			<td>0.2% X-100 Triton in PBS++&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipette</td>
			<td>Rainin</td>
			<td>17014382</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipette Tips&#160;</td>
			<td>Rainin&#160;</td>
			<td>17014967</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ProLong Gold Antifade Mountant</td>
			<td>Thermo Scientific&#160;</td>
			<td>&#160;P36930</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Staining Buffer&#160;</td>
			<td>Made in Lab</td>
			<td></td>
			<td>0.5% BSA, 0.15% Glycine, 0.1% X-100 Triton in PBS++&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thermo Scientific Nunc Lab-Tek II Chamber Slide System&#160;</td>
			<td>Thermo Scientific&#160;</td>
			<td>12-565-8</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>Sigma-Alderich&#160;</td>
			<td>11332481001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypan Blue Solution, 0.4%</td>
			<td>Thermo Scientific&#160;</td>
			<td>15250061</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TrypLE Express</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>12604013</td>
			<td>animal origin-free, recombinant enzyme</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>X-RAD 320 Biological Irradiator&#160;</td>
			<td>Precision X-Ray Irradiation&#160;</td>
			<td>X-RAD320</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

visualizing dna damage repair proteins in patient-derived ovarian cancer organoids via immunofluorescence assays

Иммунофлуоресценция является одним из наиболее широко используемых методов визуализации антигенов-мишеней с высокой чувствительностью и специфичностью, что позволяет точно идентифицировать и локализовать белки, гликаны и малые молекулы. Хотя этот метод хорошо зарекомендовал себя в двумерной (2D) культуре клеток, меньше известно о его использовании в трехмерных (3D) моделях клеток. Органоиды рака яичников представляют собой 3D-модели опухолей, которые повторяют клональную гетерогенность опухолевых клеток, микроокружение опухоли и взаимодействия между клетками и клеточным матриксом. Таким образом, они превосходят клеточные линии по оценке лекарственной чувствительности и функциональных биомаркеров. Таким образом, способность использовать иммунофлуоресценцию на органоидах первичного рака яичников чрезвычайно полезна для понимания биологии этого рака. В настоящем исследовании описывается метод иммунофлуоресценции для обнаружения белков репарации повреждений ДНК в высокодифференцированных серозных органоидах рака яичников (PDO). После воздействия ионизирующего излучения на ЗОП проводят иммунофлуоресценцию на интактных органоидах для оценки ядерных белков как очагов. Изображения собираются с помощью визуализации z-stack на конфокальной микроскопии и анализируются с помощью программного обеспечения для автоматического подсчета очагов. Описанные методы позволяют анализировать временную и специальную рекрутацию белков репарации повреждений ДНК и колокализацию этих белков с маркерами клеточного цикла.

Представленный протокол позволяет успешно окрашивать, визуализировать и количественно оценивать белки восстановления повреждений ядерной ДНК в органоидах. Этот метод использовался для окрашивания и оценки PDO как до, так и после облучения. PDO подвергались воздействию радиации 10 Гр и о?...

Watch this Scientific Journal Video about Visualizing DNA Damage Repair Proteins in Patient-Derived Ovarian Cancer Organoids via Immunofluorescence Assays at JoVE.com

Visualizing DNA Damage Repair Proteins in Patient-Derived Ovarian Cancer Organoids via Immunofluorescence Assays

Настоящий протокол описывает методы оценки белков репарации повреждений ДНК в органоидах рака яичников пациента. Сюда включены комплексные методы нанесения покрытия и окрашивания, а также подробные и объективные процедуры количественной оценки.

Визуализация белков репарации повреждений ДНК в органоидах рака яичников пациента с помощью иммунофлюоресцентных анализов

Immunofluorescence is one of the most widely used techniques to visualize target antigens with high sensitivity and specificity, allowing for the accurate ...

Изучение реакции на повреждение ДНК необходимо для понимания патофизиологии потенциальных биомаркеров рака яичников в новой таргетной терапии. Этот метод позволяет образцу оставаться неповрежденным и позволяет исследовать антигены в месте их действия. Этот протокол является быстрым и может быть адаптирован к любому антигену, поддающемуся иммунофлюоресценции.Этот метод дает представление о раке яичников и процессах восстановления повреждений ДНК, связанных с химиотерапевтической резистентностью и устойчивостью к ингибиторам PARP. Эти методы могут быть применены к другим областям исследований, связанным с использованием 3D-культур и органоидов. Для начала аспирируйте среду из облученных и инкубированных органоидов, не нарушая 3D-матрицу.Затем смойте 300 микролитрами PBS. Зафиксируйте органоиды в 300 микролитрах 2%-ного параформальдегида в течение 10 минут. После фиксации промойте органоиды 300 микролитрами окрашивающего буфера и поместите их на шейкер на пять минут.Затем проникните органоид, аккуратно добавив 300 микролитров буфера пермеабилизации. После 20 минут инкубации снимите буфер и промойте 300 микролитрами окрашивающего буфера. Поместите органоиды в шейкер на пять минут.Затем добавьте 300 микролитров буфера для окрашивания, чтобы заблокировать этап пермеабилизации. Поместите на шейкер на 30 минут и аспирируйте окрашивающий буфер с помощью пипетки. Затем добавьте 300 микролитров первичных антител, разведенных в окрашивающем буфере.Инкубировать при четырех градусах Цельсия в течение 16 часов. После инкубации удаляют раствор первичных антител. Выполните три стирки с 300 микролитрами буфера для окрашивания в течение пяти минут каждая на шейкере.Добавьте 300 микролитров раствора вторичных антител, разведенного в окрашивающем буфере, и выдерживайте в течение часа в темноте. Через час аспирируйте раствор вторичных антител и добавьте 300 микролитров разбавленного DAPI. Поставьте на шейкер на пять минут.Выполните три стирки с 300 микролитрами буфера для окрашивания в течение пяти минут каждая на шейкере. Снимите буфер окрашивания и отсоедините камеры с помощью комплекта для удаления, входящего в комплект направляющих камеры. Отрежьте наконечник наконечника пипетки P200 и используйте его, чтобы добавить монтажную среду, чтобы покрыть каждую лунку, содержащую органоидный язычок.Наденьте покров на образец, избегая пузырьков. Возьмите прозрачный лак для ногтей и нанесите его на боковые стороны покровного стекла, чтобы запечатать предметное стекло. Дайте ему затвердеть в течение часа, а затем поместите его при температуре 20 градусов по Цельсию.Получение изображений с помощью конфокального микроскопа с использованием 63-кратного объектива с иммерсионным маслом. Используя этот протокол, органоиды рака яичников, полученные от пациентов, были окрашены на белки репарации повреждений ДНК до и после облучения и оценены на наличие биомаркеров, таких как гамма H2AX, маркер повреждения ДНК, и RAD51, маркер гомологичной рекомбинационной репарации. RPA, маркер репликационного стресса, 53BP1, маркер негомологичного предписания, и Geminin, маркер фазового клеточного цикла GS2, также оценивались с использованием этого метода.Вкладки BME имеют тенденцию к деполимеризации, поэтому очень важно уделять пристальное внимание после фиксации и аспирации. Анализ антигенов для определения повреждения органоидов и способности генерировать реакцию на повреждение ДНК может помочь в оценке химиотерапевтической резистентности.

Research

JoVE Journal

Cancer Research

Visualizing DNA Damage Repair Proteins in Patient-Derived Ovarian Cancer Organoids via Immunofluorescence Assays

Evaluating In Vitro DNA Damage Using Comet Assay

Evaluating In Vitro DNA Damage Using Comet Assay

Оценки в Vitro повреждения ДНК, используя Assay комета

DNA damage is a common phenomenon for each cell during its lifespan, and is defined as an alteration of the chemical structure of genomic DNA. Cancer ...

Characterizing DNA Repair Processes at Transient and Long-lasting Double-strand DNA Breaks by Immunofluorescence Microscopy

Характеризуя процессов репарации ДНК в переходных и Long-lasting двухнитевые разрывы ДНК по микроскопии иммунофлуоресценции

The repair of double-stranded breaks (DSBs) in DNA is a highly coordinated process, necessitating the formation and resolution of multi-protein repair ...

Establishment of Gastric Cancer Patient-derived Xenograft Models and Primary Cell Lines

Создание желудка рака пациента полученных Ксенотрансплантат Модели и первичные линии клеток

The use of preclinical models to advance our understanding of tumor biology and investigate the efficacy of therapeutic agents is key to cancer research. ...

Testing Targeted Therapies in Cancer using Structural DNA Alteration Analysis and Patient-Derived Xenografts

Тестирование целевых методов лечения рака с использованием структурных анализа изменения ДНК и пациентов, полученных Xenografts

We present here an integrative approach for testing efficacy of targeted therapies that combines the next generation sequencing technolo-gies, therapeutic ...

Immunofluorescence Imaging of DNA Damage and Repair Foci in Human Colon Cancer Cells

Иммунофлуоресценция Визуализация повреждения ДНК и ремонт Фочи в раковых клетках толстой кишки человека

The purpose of the manuscript is to provide a step-by-step protocol for performing immunofluorescence microscopy to study the radiation-induced DNA damage ...

High-Throughput In Vitro Assay using Patient-Derived Tumor Organoids

High-Throughput In Vitro Assay using Patient-Derived Tumor Organoids

Высокопроизводительный анализ in vitro с использованием органоидов опухолей, полученных от пациента

Patient-derived tumor organoids (PDOs) are expected to be a preclinical cancer model with better reproducibility of disease than traditional cell culture ...

Profiling Sensitivity to Targeted Therapies in EGFR-Mutant NSCLC Patient-Derived Organoids

Профилирование чувствительности к таргетной терапии в органоидах EGFR-мутантного НМРЛ, полученных из пациента

Novel 3D cancer organoid cultures derived from clinical patient specimens represent an important model system to evaluate intratumor heterogeneity and ...

Generation and Culturing of High-Grade Serous Ovarian Cancer Patient-Derived Organoids

Генерация и культивирование высокодифференцированных серозных органоидов, полученных от пациентов с раком яичников

Organoids are 3D dynamic tumor models that can be grown successfully from patient-derived ovarian tumor tissue, ascites, or pleural fluid and aid in the ...

Quantifying Replication Stress in Ovarian Cancer Cells Using Single-Stranded DNA Immunofluorescence

Количественная оценка репликационного стресса в клетках рака яичников с использованием одноцепочечной иммунофлуоресценции ДНК

Replication stress is a hallmark of several ovarian cancers. Replication stress can emerge from multiple sources, including double-strand breaks, ...

Establishment and Culture of Patient-Derived Breast Organoids

Создание и культивирование органоидов молочной железы пациента

Breast cancer is a complex disease that has been classified into several different histological and molecular subtypes. Patient-derived breast tumor ...