Name: intracranial cannula implantation for serial locoregional chimeric antigen receptor (car) t cell infusions in mice
Uploaded: 2023-02-24T15:00:00
Duration: 5 min 22 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Intracranial Cannula Implantation for Serial Locoregional Chimeric Antigen Receptor CAR T Cell Infusions in Mice at JoVE.com

Financiering voor dit werk werd verstrekt door de Matthew Larson Foundation, Grayson Saves Foundation, Hyundai Hope on Wheels Young Investigator Award, Kortney Rose Foundation, National Institutes of Health NCI K12 CA076931-19 en 1K08CA263179-01, en het Department of Defense W81XWH-21-1-0221.

Alle protocolprocedures zijn goedgekeurd door de Institutional Animal Care and Use Committee van het Children's Hospital of Philadelphia (IAC 19-000907), die is geaccrediteerd door de AAALAC. Deze studie gebruikte 6-12 weken oude NOD scid gamma (NSG) muizen met orthotopische xenograft tumoren; Het protocol kan echter op elke muisstam worden gebruikt. NSG-muizen werden gehuisvest in steriele barrièreomstandigheden en operaties uitgevoerd onder steriele bioveiligheidskasten. Wanneer menselijk materiaal zoals tumorcellen of T-cellen wordt gebruikt, moeten procedures en hantering worden voltooid in ABSL-2 bioveiligheidskasten.
1. De muis voorbereiden op een operatie
<ol><li>Verdoof de muis in een inductiekamer met isofluraan (2-4%) bij een zuurstofdebiet van 1 l/min totdat een adequaat anesthesievlak is bereikt (ongeveer 5 minuten).</li>
	<li>Weeg de muis met behulp van een weegschaal tot op 0,1 g nauwkeurig en dien subcutane slow-release (SR) buprenorfine (1 mg/kg) of een ander analgeticum toe. OPMERKING: SR buprenorfine biedt analgesie gedurende 72 uur.</li>
	<li>Scheer de vacht op de bovenkant van het hoofd van de muis met behulp van elektrische tondeuses of ontharingsmiddelen.</li>
	<li>Gebruik een spatel om de onderkant van de stereotactische arm voorzichtig te openen en plaats de geleidecanule met een tang. Draai de schroef op de arm vast om de canule vast te zetten, zodat ongeveer 1/2 tot 2/3 van het witte plastic deel van de canule uit de onderkant van de opening steekt, samen met de volledige 5 mm metalen lengte van de canule.</li>
	<li>Plaats en bevestig de bovenste tanden van de muis in de bijtbalk van het stereotaxische apparaat. Trek de neuskegel naar voren en draai deze vast, zodat de muis isofluraan inademt.</li>
	<li>Monteer de muis op het verwarmde stereotaxische apparaat met behulp van oormanchetten of oorbalken, om overmatige druk te voorkomen. OPMERKING: In de verwarmde lade moet een rectale thermometer zijn geplaatst en de warmhoudbak moet worden aangepast om tijdens de procedure een normale lichaamstemperatuur van de muis te behouden.</li>
	<li>Breng steriele oogheelkundige zalf aan op beide ogen met behulp van een applicator met katoenpunt.</li>
	<li>Veeg de chirurgische plaats af met povidon-jodium op een pad of applicator, gevolgd door een alcoholpad. Voer deze stap in totaal drie keer uit.</li>
	<li>Voordat u met de procedure begint, voert u een teenknijp uit met een tang om te beoordelen op adequate sedatie.</li>
</ol>2. Chirurgische ingreep
OPMERKING: Alle aspecten van de chirurgische procedure maken gebruik van gesteriliseerde instrumenten en aseptische technieken. De muizen gaan verder onder narcose met isofluraan (2-4%) gedurende de duur van de procedure, ongeveer 10-20 minuten.
<ol><li>Pak de hoofdhuid voorzichtig op tussen de oren met een tang. Knip met een steriele schaar de opgetilde hoofdhuid parallel aan de schedel en verwijder een ovale flap van de huid (0,75-1 cm lang) om de schedel bloot te leggen. OPMERKING: Een schaar heeft de voorkeur boven een scalpel om een schone, ovaalvormige opening te bieden en onnodige schade aan de omliggende huid en weefsel te voorkomen.</li>
	<li>Duw fascia weg met behulp van een scalpel of wattenstaafjes en een hemostatische katoenkorrel om overmatig bloeden te vertragen als dat nodig is. OPMERKING: Het gebruik van de houten kant van een steriele katoenen tip kan ook fascia wegduwen en overmatig bloeden helpen voorkomen.</li>
	<li>Identificeer de oriëntatiepunten bregma en lambda, de respectievelijke voorste en achterste markeringen op de schedel waar de schedelplaten13 ontmoeten. OPMERKING: Identificatie kan worden uitgebreid door de bovenkant van de blootgestelde schedel af te vegen met waterstofperoxide.</li>
	<li>Scoor de schedel voorzichtig met behulp van een scalpel om een oppervlak te creëren waar het acryl zich aan kan hechten. De score moet meerdere lineaire lijnen omvatten van ongeveer 0,5-1 cm lang onder een hoek van 90° ten opzichte van elkaar.</li>
	<li>Gebruik de stereotaxische arm om de canule te lokaliseren naar het oriëntatiepunt van belang (bregma of lambda). Eenmaal gelokaliseerd, tilt u de canulepunt 1-2 mm boven het schedeloppervlak op en gaat u naar de gewenste coördinaten. Voor intratumorale injecties gebruikt dit dezelfde A / P- en M / L-coördinaten als de tumorplaatsing.</li>
	<li>Maak op de blootgestelde schedel, weg van het gebied waar de canule binnenkomt, twee schroefgaten met een naald van 18 G of een chirurgische boor. Zorg ervoor dat de gaten zo uit elkaar zijn geplaatst dat er voldoende ruimte is voor de canule. Draai met een boor door de schroefgaten totdat ze op de schedel terechtkomen. Steek en bevestig twee schroeven in de gaten met behulp van een platte schroevendraaier. Trek vervolgens voorzichtig de schroeven omhoog om ervoor te zorgen dat ze vastzitten. OPMERKING: Plaats de schroeven niet totdat ze gelijk zijn met de schedel, anders kunnen ze de hersenen van de muis eronder beschadigen. Laat ten minste een opening van 1-2 mm tussen de schroef en de schedel.</li>
	<li>Boor met behulp van een naald van 18 G of een chirurgische boor door de schedel op de geïdentificeerde coördinaten om een gat te maken voor de canule die moet worden ingebracht.</li>
	<li>Laat met behulp van de stereotactische arm de canule zakken tot de gewenste D/V-coördinaat. OPMERKING: De D/V-coördinaat van de implantatie van de canule moet rekening houden met de projectielengte van de dummy en de canules van de behandeling en kan oppervlakkiger zijn dan de orthotopische injectie van tumorcellen (figuur 1).</li>
	<li>Vul in een porseleinen plaat met 12 putten een put met acrylharspoeder (ongeveer 0,3 g) en 10-15 druppels (ongeveer 0,5-0,75 ml) acrylharsvloeistof. Hierdoor ontstaat een stroperig witgekleurd materiaal. Zuig het mengsel op in een spuit van 1 ml en gebruik het om de schedel te coaten en te bedekken, waarbij de ruimtes rond de canule en schroeven worden opgevuld. OPMERKING: Het viskeuze materiaal hardt na verloop van tijd uit tot cement, dus deze stap moet onmiddellijk na het mengen worden voltooid.</li>
	<li>Terwijl het cement nog buigzaam is, maakt u de schroef op de stereotactische arm los en gebruikt u een spatel in de opening aan de onderkant om de canule voorzichtig uit de houder los te maken en de stereotactische arm langzaam omhoog te trekken weg van de muis.</li>
	<li>Zodra het cement volledig droog is, steekt u de dummycanule in de geleidecanule en zet u deze stevig vast door met de klok mee te draaien.</li>
	<li>Zodra de procedure is voltooid, plaatst u de muis terug in zijn verwarmde thuiskooi om zorgvuldig te controleren, voldoende herstel te garanderen en eventuele observaties na de procedure vast te leggen, inclusief dat de muis volledig weer bij bewustzijn is gekomen, voordat u terugkeert naar de kolonie. OPMERKING: Het wordt over het algemeen aanbevolen om slechts de helft van de kooi op een verwarmingskussen te plaatsen om het dier naar de koelere kant te laten bewegen om oververhitting te voorkomen.</li>
	<li>Dien indien nodig extra pijnstillers toe als de muizen gedrag vertonen dat wijst op pijn postoperatief, zoals meloxicam 5 mg / kg subcutaan eenmaal daags toegediend gedurende maximaal 3 dagen.</li>
</ol>3. CAR T-cellen voorbereiden
<ol><li>Meet de voorgetransfecteerde CAR T-celconcentratie met behulp van een celteller.</li>
	<li>Centrifugeer voorgetransfecteerde T-cellen bij 200 x g gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur (RT).</li>
	<li>Zuig het supernatant op met behulp van een steriele Pasteur-pipet op een vacuümaspiratiesysteem en resuspensie de pellet in fosfatae gebufferde zoutoplossing (PBS) tot een gewenste concentratie. Typische leveringsvolumes zijn 2-5 μL. Typische celdoses zijn 0,5-5 x 106 cellen.</li>
</ol>4. CAR T-celinfusies
<ol><li>Bereid de behandelingscanule voor door de bovenkant door een klein stukje PKG-slang te voeren.</li>
	<li>Vul de behandelingsspuit met de CAR T-celsuspensie en steek deze door het andere uiteinde van de PKG-slang, voldoende om de bovenkant van de behandelingscanule te bedekken.</li>
	<li>Verdoof de muis met isofluraan (2-4%) bij een zuurstofdebiet van 1 l/min.</li>
	<li>Stabiliseer de geleidecanule met behulp van een tang aan de basis en schroef vervolgens voorzichtig de dummycanule los en verwijder deze, zodat u toegang krijgt tot de geleidecanule. OPMERKING: Een stereotaxische opstelling is niet nodig, maar kan worden gebruikt om het hoofd te stabiliseren voor behandeling.</li>
	<li>Infundeer de CAR T-cellen gedurende 1 minuut en houd de behandelingscanule nog eens 1 minuut op zijn plaats na het staken van de infusie.</li>
	<li>Verwijder de behandelingscanule en schroef de dummycanule weer stevig op zijn plaats.</li>
	<li>Dien subcutaan meloxicam (5 mg/kg) toe voor optionele pijnbestrijding.</li>
</ol>

<ol>
	<li>Curtin, S. C., Minino, A. M., Anderson, R. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Declines+in+cancer+death+rates+among+children+and+adolescents+in+the+United+States,+1999-2014.">Declines in cancer death rates among children and adolescents in the United States, 1999-2014.</a> NCHS Data Brief. 257, 1-8 (2016).</li><li>Rohaan, M. W., Wilgenhof, S., Haanen, J. B. A. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adoptive+cellular+therapies:+the+current+landscape.">Adoptive cellular therapies: the current landscape.</a> Virchows Archiv. 474 (4), 449-461 (2019).</li><li>Sadelain, M., Brentjens, R., Riviere, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+basic+principles+of+chimeric+antigen+receptor+design.">The basic principles of chimeric antigen receptor design.</a> Cancer Discovery. 3 (4), 388-398 (2013).</li><li>Maude, S. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tisagenlecleucel+in+children+and+young+adults+with+B-cell+lymphoblastic+leukemia.">Tisagenlecleucel in children and young adults with B-cell lymphoblastic leukemia.</a> The New England Journal of Medicine. 378 (5), 439-448 (2018).</li><li>Wagner, J., Wickman, E., DeRenzo, C., Gottschalk, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CAR+T+cell+therapy+for+solid+tumors:+Bright+future+or+dark+reality.">CAR T cell therapy for solid tumors: Bright future or dark reality.</a> Molecular Therapy. 28 (11), 2320-2339 (2020).</li><li>Vitanza, N. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Locoregional+infusion+of+HER2-specific+CAR+T+cells+in+children+and+young+adults+with+recurrent+or+refractory+CNS+tumors:+an+interim+analysis.">Locoregional infusion of HER2-specific CAR T cells in children and young adults with recurrent or refractory CNS tumors: an interim analysis.</a> Nature Medicine. 27 (9), 1544-1552 (2021).</li><li>Majzner, R. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=GD2-CAR+T+cell+therapy+for+H3K27M-mutated+diffuse+midline+gliomas.">GD2-CAR T cell therapy for H3K27M-mutated diffuse midline gliomas.</a> Nature. 603 (7903), 934-941 (2022).</li><li>Vitanza, N. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intraventricular+B7-H3+CAR+T+cells+for+diffuse+intrinsic+pontine+glioma:+preliminary+first-in-human+bioactivity+and+safety.">Intraventricular B7-H3 CAR T cells for diffuse intrinsic pontine glioma: preliminary first-in-human bioactivity and safety.</a> Cancer Discovery. 13 (1), 114-131 (2023).</li><li>Theruvath, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Locoregionally+administered+B7-H3-targeted+CAR+T+cells+for+treatment+of+atypical+teratoid/rhabdoid+tumors.">Locoregionally administered B7-H3-targeted CAR T cells for treatment of atypical teratoid/rhabdoid tumors.</a> Nature Medicine. 26 (5), 712-719 (2020).</li><li>Donovan, L. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Locoregional+delivery+of+CAR+T+cells+to+the+cerebrospinal+fluid+for+treatment+of+metastatic+medulloblastoma+and+ependymoma.">Locoregional delivery of CAR T cells to the cerebrospinal fluid for treatment of metastatic medulloblastoma and ependymoma.</a> Nature Medicine. 26 (5), 720-731 (2020).</li><li>Brown, C. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regression+of+glioblastoma+after+chimeric+antigen+receptor+T-Cell+therapy.">Regression of glioblastoma after chimeric antigen receptor T-Cell therapy.</a> The New England Journal of Medicine. 375 (26), 2561-2569 (2016).</li><li>Bourne, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intracerebral+microdialysis:+30+years+as+a+tool+for+the+neuroscientist.">Intracerebral microdialysis: 30 years as a tool for the neuroscientist.</a> Clinical and Experimental Pharmacology and Physiology. 30 (1-2), 16-24 (2003).</li><li>Zhou, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Automatically+detecting+bregma+and+lambda+points+in+rodent+skull+anatomy+images.">Automatically detecting bregma and lambda points in rodent skull anatomy images.</a> PLoS One. 15 (12), 0244378 (2020).</li><li>Foster, J. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+GPC2-directed+chimeric+antigen+receptors+using+mRNA+for+pediatric+brain+tumors.">Development of GPC2-directed chimeric antigen receptors using mRNA for pediatric brain tumors.</a> Journal for Immunotherapy of Cancer. 10 (9), 004450 (2022).</li><li>Akhavan, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=T+cells+for+brain+tumors:+Lessons+learned+and+road+ahead.">T cells for brain tumors: Lessons learned and road ahead.</a> Immunological Reviews. 290 (1), 60-84 (2019).</li></ol>

JBF heeft een patent met betrekking tot glypican 2 (GPC2)-gerichte immunotherapieën. Alle andere auteurs hebben niets te onthullen.

CAR T-celtherapie heeft een revolutie teweeggebracht in de behandeling van hematologische kankers en toont veelbelovende waarde bij de behandeling van solide hersentumoren 6,7,8. Dit protocol is ontworpen om de preklinische evaluatie van locoregionale CAR T-celafgifte mogelijk te maken voor de behandeling van pediatrische CZS-tumoren. Het canulesysteem repliceert een Ommaya- of Rickham-reservoir, een intraventriculair kathetersysteem dat momenteel wordt gebruikt in lopende klinische onderzoeken naar CAR T-celtherapie in pediatrische CNS-tumoren 6,7,8, wat de relevantie en het translationele potentieel van deze methoden onderstreept. Dit systeem maakt de herhaalde levering van CAR T-cellen mogelijk die de bloed-hersenbarrière omzeilen, opnieuw vergelijkbaar met methoden die worden gebruikt in lopende klinische onderzoeken. Locoregionale toediening kan maximale werkzaamheid bieden in het CZS9 en kan ook het risico op systemische toxiciteiten geassocieerd met handel uit circulatie15 verminderen. Hoewel stereotactische toediening een enkele dosis in het CZS kan bieden, is het voordeel van dit systeem de mogelijkheid om meerdere herhaalde doses op een bepaalde locatie in het CZS te geven zonder dat er meerdere operaties nodig zijn. De beperkingen van deze procedure omvatten een vaste afleverlocatie zonder de mogelijkheid om van locatie te veranderen of aanpassingen aan te brengen zodra de canule op zijn plaats is, en de mogelijkheid van losraken van de canule.
Een cruciale stap in dit protocol is de implantatie van de vaste geleidingscanule op een D/V-coördinaat die rekening houdt met de projectie van de behandelingscanules. De behandelingscanule steekt uit buiten de punt van de geleidecanule en daarom moet ervoor worden gezorgd dat de plaatsing resulteert in de levering van CAR T-cellen aan het gebied van belang. Projectielengtes van de behandelingscanule kunnen worden aangepast en in de ervaring van de auteur is 0,5 mm een nuttige projectielengte. Deze lengte zorgt ervoor dat de therapeutica niet in de geleidecanule blijft bij het doseren, maar vereist ook geen significante aanpassing van de D / V-coördinaten voor de geleidecanule aan het gebied van belang. Een extra belangrijke stap in dit protocol is de tijd dat de behandelingscanule op zijn plaats blijft na CAR T-celinfusie. De behandelingscanule moet gedurende ten minste 1 minuut na het einde van de infusie op zijn plaats worden gehouden om lekken en het verlies van locoregionale toediening van CAR T-celtherapie te voorkomen.
Het oplossen van problemen met deze methode is eenvoudig, met de meeste complicaties die gepaard gaan met het verwijderen van de dummycanule of het inbrengen van de behandelingscanule in de vaste geleidecanule, waarschijnlijk als gevolg van gedroogd bloed aan de binnenkant van de geleidecanule. Dit kan eenvoudig worden opgelost door de dummycanule voorzichtig door de geleidecanule te laten gaan totdat er minder weerstand is en het puin is opgeruimd. De acrylhars kan af en toe loskomen van de schedel, wat resulteert in het verlies van het canulesysteem. Onze ervaring is dat dit over het algemeen beperkt is door het scoren van de schedel met een scalpel en het plaatsen van twee schroeven. Bovendien worden alle items uit de kooi verwijderd die per ongeluk kracht op de canule kunnen uitoefenen terwijl de muis beweegt, zoals bepaalde muisverrijkingshutten met kleine openingen.
Kortom, hier beschreven is een protocol voor het inbrengen van een canulesysteem in muizenmodellen van CZS-tumoren voor de herhaalde levering van CAR T-cellen. De plaatsing van canules kan worden aangepast aan meerdere locoregionale afleverlocaties, waardoor de effectiviteit van verschillende toedieningslocaties wordt getest. Bovendien kan dit systeem worden gebruikt voor aanvullende therapieën buiten CAR T-cellen om de werkzaamheid te evalueren bij het omzeilen van de bloed-hersenbarrière, en kan het ook nuttig zijn voor de evaluatie van therapeutica in muizenmodellen van niet-oncologische aandoeningen.

Ondanks verbeteringen in chemotherapie, radiotherapie en chirurgie, zijn tumoren van het centrale zenuwstelsel (CZS) de dodelijkste maligniteit in de kindergeneeskunde1, wat een belangrijke behoefte aan nieuwe benaderingen met meer succesvolle resultaten onderstreept. Met aanzienlijke vooruitgang op het gebied van immunotherapie, hebben adoptieve cellulaire therapie (ACT) benaderingen veelbelovende resultaten laten zien bij verschillende kankers, met name hematologische maligniteiten2. Chimere antigeenreceptor (CAR) T-celtherapie, een specifiek type ACT, maakt gebruik van het natuurlijke vermogen van het immuunsysteem om schadelijke cellen te herkennen en te doden door de specificiteit van T-cellen om te leiden om tumorgerichte T-cellen te genereren3. CAR T-celtherapie heeft aanzienlijk succes aangetoond bij de behandeling van leukemieën en lymfomen4, waardoor het een veelbelovende immunotherapeutische benadering is en het onderzoek naar solide tumoren wordt aangemoedigd. Tot nu toe heeft CAR T-celtherapie in solide tumoren echter weinig klinisch succes geboekt en wordt het geconfronteerd met vele uitdagingen, zoals inefficiënte tumorpenetratie, beperkte targetable antigenen en de onderdrukkende tumormicro-omgeving5.
Recente klinische onderzoeken zijn begonnen met het evalueren van CAR T-celtherapie voor pediatrische CNS-tumoren, met bewijs van concept en vroeg bewijs van T-celactiviteit in voorlopige rapporten 6,7,8. Hoewel de meeste initiële preklinische gegevens gericht waren op intraveneuze toediening van de CAR T-cellen, heeft recent preklinisch bewijs de superioriteit van locoregionale toediening in het CZS9,10 gesuggereerd, die ook met succes is gebruikt in verschillende klinische onderzoeken 6,7,8,11 . Preklinische studies tot nu toe die de locoregionale levering van CAR T-cellen in het CZS hebben opgenomen, hebben vertrouwd op een enkele intracraniale dosis CAR T-cellen diestereotactisch 9,10 worden afgeleverd. Klinische proeven bij mensen hebben echter herhaalde infusies van CAR T-cellen in het CZS 6,7,8,11 vereist, wat de noodzaak onderstreept om meerdere herhaalde infusies in preklinische ontwikkeling te evalueren. Het doel van deze procedure is om met succes seriële CAR T-celinfusies te testen met behulp van een katheter in orthotopische muizenmodellen van pediatrische hersentumoren. Het voordeel van deze techniek is het vermijden van meerdere chirurgische procedures om herhaalde intra-CZS-behandelingen te bieden. Canules zijn voornamelijk gebruikt voor microdialysebemonstering van neurotransmitters en de levering van neuroactieve stoffen in neurowetenschappen en gedragsonderzoek bij knaagdieren12, met beperkte rapporten over hun gebruik voor de levering van antikankertherapieën. Voortbouwend op de eerdere rapporten maakt dit protocol gebruik van een stereotactisch geplaatst inwonend canulesysteem om CAR T-cellen af te leveren in xenograft murine-modellen van CNS-tumoren. Het protocol kan worden gebruikt om aanvullende therapieën te testen in muizenmodellen van neurologische of neuro-oncologische aandoeningen, en kan nuttig zijn om nieuwe therapieën te testen waarbij het omzeilen van de bloed-hersenbarrière van cruciaal belang is voor de werkzaamheid.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>18 G needles</td>
			<td>BD</td>
			<td>511097</td>
			<td>1 1/2 inch metal hub</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acrylic resin liquid</td>
			<td>Lang Dental&#160;</td>
			<td>B1323&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acrylic resin powder</td>
			<td>Lang Dental&#160;</td>
			<td>B1323&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alcohol wipes</td>
			<td>BD</td>
			<td>326895</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge 5240</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>5420000040</td>
			<td>Centrifuge&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cotton tipped swabs</td>
			<td>Puritan</td>
			<td>826-WC</td>
			<td>Handle Width = 2.11 mm (0.083), Head Width = 1.27 mm (0.050), Handle Length = 147.62 mm (5.812), Overall Length = 152.4 mm (6), Head Length = 12.7 mm (0.500)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Drill bit holder&#160;</td>
			<td>P1 Technologies&#160;</td>
			<td>DH-1&#160;</td>
			<td>Drill bit holder for D56-D70&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Drill bit&#160;</td>
			<td>P1 Technologies&#160;</td>
			<td>D58&#160;</td>
			<td>1.07 mm&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dummy cannula&#160;</td>
			<td>P1 Technologies&#160;</td>
			<td>C315DCS-5/SPC&#160;</td>
			<td>Configuration: Small cap; &#160;Length: Cut 5.00 mm below pedestal; Projection: 0.50 mm&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Flat tip screwdriver&#160;</td>
			<td>P1 Technologies&#160;</td>
			<td>SD-80&#160;</td>
			<td>Screwdriver&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Graefe forceps</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>11051-10</td>
			<td>Forceps</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Guide cannula&#160;</td>
			<td>P1 Technologies&#160;</td>
			<td>C315GS-5/SPC&#160;</td>
			<td>Configuration: 5.00 mm pedestal height; Length: Cut 5.00 mm below pedestal&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hemostatic cotton pellets with racemic epinephrine&#160;</td>
			<td>Pascal&#160;</td>
			<td>1151602&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MOXI Z Mini automated cell counter Kit&#160;</td>
			<td>Moxi</td>
			<td>MXZ001</td>
			<td>Cell counter</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NOD&#160;scid&#160;gamma (NSG) mice</td>
			<td>Jackson Laboratory</td>
			<td>5557</td>
			<td>6 to 12-week-old males and females</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pasteur pipet</td>
			<td>VWR</td>
			<td>14673-043</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PKG tubing&#160;</td>
			<td>P1 Technologies&#160;</td>
			<td>C313CT&#160;</td>
			<td>Diameter: 0.58 mm x 1.27 mm&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Porcelain 12 well plate</td>
			<td>Flinn Scientific</td>
			<td>AP6064&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Povidone iodine</td>
			<td>Medline</td>
			<td>MDS093943</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scalpel</td>
			<td>World Precision Instrument</td>
			<td>50-822-457</td>
			<td>Disposable Scalpel, no.10, sterile, 10/box, Plastic Handle with 6&#34; Ruler</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Screws&#160;</td>
			<td>P1 Technologies&#160;</td>
			<td>0-80 X 3/32&#160;</td>
			<td>2.4 mm&#160;&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stereotaxic Frame&#160;</td>
			<td>David Kopf Instruments&#160;</td>
			<td>940&#160;</td>
			<td>Model 940 Small Animal Stereotaxic Instrument with Digital Display Console&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Student fine scissors</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>91460-12</td>
			<td>Scissors</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Treatment cannula&#160;</td>
			<td>P1 Technologies&#160;</td>
			<td>C315IS-5/SPC&#160;</td>
			<td>33GA;&#160;Configuration: Standard internal; Length: Cut 5.00 mm below pedestal; Projection: 0.50 mm&#160;&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Treatment syringes&#160;</td>
			<td>Hamilton</td>
			<td>87908</td>
			<td>5 &#181;L, Model 75 Cemented Needle Special (SN) Syringe, 75SN/22/0.5&#34;/PT3&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vactrap XL&#160;</td>
			<td>Foxx Life Sciences</td>
			<td>305-4401-FLS</td>
			<td>Vacuum System</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

intracranial cannula implantation for serial locoregional chimeric antigen receptor (car) t cell infusions in mice

Pediatrische CZS-tumoren zijn verantwoordelijk voor de meerderheid van de kankergerelateerde sterfgevallen bij kinderen en hebben slechte prognoses, ondanks vooruitgang in chemotherapie en radiotherapie. Omdat veel tumoren geen effectieve behandelingen hebben, is er een cruciale behoefte om meer veelbelovende therapeutische opties te ontwikkelen, zoals immunotherapieën; het gebruik van chimere antigeenreceptor (CAR) T-celtherapie gericht tegen CZS-tumoren is van bijzonder belang. Celoppervlakdoelen zoals B7-H3, IL13RA2 en de disialoganglioside GD2 komen sterk tot expressie op het oppervlak van verschillende pediatrische en volwassen CZS-tumoren, waardoor de mogelijkheid om CAR T-celtherapie te gebruiken tegen deze en andere oppervlaktedoelen toeneemt. Om de herhaalde locoregionale afgifte van CAR T-cellen in preklinische muizenmodellen te evalueren, werd een verblijfskathetersysteem opgezet dat verblijfskatheters samenvat die momenteel worden gebruikt in klinische proeven bij mensen. In tegenstelling tot stereotactische toediening, maakt het verblijfskathetersysteem herhaalde dosering mogelijk zonder het gebruik van meerdere operaties. Dit protocol beschrijft de intratumorale plaatsing van een vaste geleidecanule die is gebruikt om seriële CAR T-celinfusies met succes te testen in orthotopische muizenmodellen van pediatrische hersentumoren. Na orthotopische injectie en engraftment van de tumorcellen bij muizen, wordt intratumorale plaatsing van een vaste geleidecanule voltooid op een stereotactisch apparaat en vastgezet met schroeven en acrylhars. Behandelingscanules worden vervolgens ingebracht via de vaste geleidecanule voor herhaalde CAR T-celafgifte. Stereotactische plaatsing van de geleidecanule kan worden aangepast om CAR T-cellen rechtstreeks in de laterale ventrikel of andere locaties in de hersenen af te leveren. Dit platform biedt een betrouwbaar mechanisme voor het preklinisch testen van herhaalde intracraniale infusies van CAR T-cellen en andere nieuwe therapieën voor deze verwoestende pediatrische tumoren.

Succesvolle canule-implantatie in het CZS van de muis Muizen met een succesvolle cannulatie hebben een veilige geleidecanule, die de activiteiten van het dagelijks leven niet verstoort (figuur 2A) en die gemakkelijk een behandelingscanule kan passeren en vloeistof kan afgeven zonder weerstand (figuur 2B). In onze ervaring blijven de meeste canules langer dan 4 weken op hun plaats, hoewel 0-25% na verloop van tijd kan worden losgemaakt. Verificatie van de juiste plaatsing kan worden bevestigd met Evans blauwe kleurstof geïnjecteerd in de canule. Een canule die in de laterale ventrikel is ingebracht, toont bijvoorbeeld Evans blauwe kleurstof door het ventriculaire systeem terwijl deze door het hersenvocht reist, wat de juiste plaatsing bevestigt (figuur 2C). Canules die in de tumor zijn ingebracht, tonen Evans blauwe kleurstof op de plaats van tumorimplantatie.
Effectieve afgifte van CAR T-cellen in het CZS voor de behandeling van xenografttumoren. De werkzaamheid van het intracraniale canulesysteem en de therapeutische werkzaamheid van CAR T-cellen in muizenmodellen kunnen worden gemeten via verschillende mechanismen, waaronder bioluminescente beeldvorming en algehele overleving. GPC2-gerichte CAR T-cellen werden getest tegen murine medulloblastoom en diffuse midline glioommodellen, respectievelijk 7316-4509 en 7316-3058, met behulp van herhaalde CAR T-celdosering via het vermelde intracraniële canulesysteem14. Orthotopische tumorplaatsing en engraftment werden bevestigd door bioluminescente beeldvorming en canules werden in het tumorbed geplaatst met dezelfde coördinaten als de orthotopische tumorplaatsing. De behandelingen bestonden uit GPC2 CAR T-celinfusies één tot twee keer per week gedurende 2-4 weken, in totaal vier tot zes doses. Na behandeling veroorzaakte GPC2-gerichte CAR T-celtherapie significante tumorregressie in het medulloblastoom model 7316-4509 (p < 0,01) (figuur 3A) en significant verlengde overleving in thalamisch diffuus middenlijnglioom 7316-3058 (p < 0,05) (figuur 3B)14.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64886/64886fig01.jpg"> Figuur 1: Geleidecanule met projectiepop en behandelingscanules. (A) Geleidecanule met 0,5 mm projectie en 2 mm projectiedummycanules op hun plaats. B) Geleidende canules met 0,5 mm projectie en 2 mm projectiebehandeling canules op hun plaats. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64886/64886fig01large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64886/64886fig02.jpg"> Figuur 2: Behandelingscanuletoedieningssysteem voor herhaalde doses CAR T-cellen . (A) Canule geïmplanteerd in een muizenschedel met een dop op zijn plaats wanneer deze niet in gebruik is. (B) Infusie van CAR T-cellen in een pontinetumor via de behandelingscanule terwijl de muis onder narcose is. (C) Verificatie van de plaatsing van de canule in de laterale ventrikel met behulp van Evans blauwe kleurstof. Kleurstof werd ingebracht via de canule, gevolgd door euthanasie en hersenexcisie, waarbij kleurstof aanwezig was in de ventrikels. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64886/64886fig02large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64886/64886fig03.jpg"> Figuur 3: GPC2-gerichte CAR T-cellen bemiddelen antitumorresponsen en verlengen de overleving in pediatrische hersentumoren in vivo. (A) Kwantificering van bioluminescentie van de orthotopische groep 4 medulloblastoom xenograft 7316-4509 behandeld met GPC2- of CD19-gerichte mRNA CAR T-cellen. Doses worden aangegeven met pijlen op de grafiek. Gegevens weergegeven als gemiddeld met SD, n = 9-11 muizen per arm. (B) Totale overleving van muizen geïmplanteerd met thalamische DMG xenograft 7316-3058 behandeld met zes herhaalde doses van 2 x 106 CAR T-cellen. Doses worden aangegeven met pijlen op de grafiek. n = 7 muizen per arm. **p < 0,01; *p < 0,05; ns = niet significant. Deze figuur is gereproduceerd met toestemming van Foster et al.14. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64886/64886fig03large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Intracranial Cannula Implantation for Serial Locoregional Chimeric Antigen Receptor CAR T Cell Infusions in Mice at JoVE.com

Intracranial Cannula Implantation for Serial Locoregional Chimeric Antigen Receptor CAR T Cell Infusions in Mice

Tumoren van het centrale zenuwstelsel (CZS) zijn de belangrijkste oorzaak van kankergerelateerde sterfte bij kinderen, en locoregionale immuungebaseerde therapieën worden steeds vaker getest voor patiënten in klinische onderzoeken. Dit protocol beschrijft methoden voor locoregionale canule-implantatie bij muizen voor de preklinische evaluatie van immunotherapeutische infusies gericht op CZS-tumoren.

Intracraniële canule-implantatie voor seriële locoregionale chimere antigeenreceptor (CAR) T-celinfusies bij muizen

Pediatric CNS tumors are responsible for the majority of cancer-related deaths in children and have poor prognoses, despite advancements in chemotherapy ...

Dit protocol repliceert een intraventrikelkathetersysteem dat wordt gebruikt in lopende klinische onderzoeken om lokale regionale toediening van CAR T-celtherapie gericht tegen tumoren van het centrale zenuwstelsel te testen. Het belangrijkste voordeel van deze techniek is de mogelijkheid om meerdere herhaalde doses van lokale regionale CAR T-celtherapie te bieden zonder meerdere invasieve chirurgische procedures uit te voeren. Dit systeem kan worden gebruikt om verschillende therapieën op verschillende toedieningslocaties te onderzoeken en kan zo inzicht geven in een groot aantal onderzoeksgebieden in de neurowetenschappen.Plaats om te beginnen de verdoofde muis met geschoren hoofd op de operatietafel en open voorzichtig de onderkant van de stereotactische arm met behulp van een spatel. Plaats de canule met een tang en zet deze vast door de schroef op de arm aan te draaien totdat de helft tot tweederde van het witte plastic gedeelte en vijf millimeter van de canule uit de onderkant van de opening steken. Plaats en bevestig de bovenste tanden van de muis in de bijtbalk van het stereotaxische apparaat.Trek de neuskegel naar voren en draai deze vast, zodat de muis isofluraan inademt. Monteer vervolgens de muis op het verwarmde stereotaxische apparaat met behulp van oormanchetten of oorbalken, om overmatige druk te voorkomen. Desinfecteer de operatieplaats en maak een snede parallel aan de schedel zoals beschreven in het manuscript.Gebruik wattenstaafjes om de fascia weg te duwen. Identificeer de oriëntatiepunten, bregma en lambda op de schedel die overeenkomen met voorste en achterste markeringen waar de schedelplaten samenkomen. Om een oppervlak te creëren voor het bevestigen van het acrylaat, maakt u voorzichtig verschillende spleten over de schedel met behulp van een scalpel.Gebruik de stereotaxische arm om de canule te lokaliseren naar het oriëntatiepunt van belang. Til de punt van de canule één tot twee millimeter boven het schedeloppervlak op en ga naar de gewenste coördinaten. Maak met behulp van een naald van 18 gauge of een chirurgische boor twee schroefgaten op de blootgestelde schedel weg van waar de canule binnenkomt, zodat er voldoende ruimte is voor de canule.Draai de boor door het schroefgat totdat deze zich aan de schedel hecht. Met een platte schroevendraaier steek en bevestig je twee schroeven in de gaten. Trek vervolgens voorzichtig de schroef omhoog om ervoor te zorgen dat deze is vastgezet.Voor het inbrengen van een canule, maak een gat in de schedel op de geïdentificeerde coördinaten met behulp van een 18 gauge naald of chirurgische boor. Laat met behulp van de stereotactische arm de canule zakken tot de gewenste DV-coördinaat. Bij ongeveer 0,3 gram acrylharspoeder en 10 tot 15 druppels vloeistof in een porseleinen 12-putplaat, laadt u het bereide viskeuze witgekleurde materiaal in een spuit van één milliliter.Bekleed de schedel en vul de ruimtes rond de canule en schroef. Draai de schroef op de stereotactische arm los terwijl het cement flexibel is. Gebruik voorzichtig een spatel om de canule los te maken van de houder bij de onderste opening en trek de stereotactische arm weg van de muis.Zodra het cement is gedroogd, steekt u de dummycanule in de geleidecanule en draait u met de klok mee om deze stevig vast te zetten. Zodra de procedure is voltooid, brengt u de muis terug naar zijn verwarmde thuiskooi voor herstel. Om de behandelingscanule voor te bereiden, steekt u de bovenkant in de PKG-slang.Vul vervolgens de behandelingsspuit met CAR T-cell suspensie en steek deze door het andere uiteinde van de PKG-buis, die de bovenkant van de behandelingscanule bedekt. Nadat u de muis hebt verdoofd, bevestigt u de geleidecanule aan de basis met een tang. Schroef de dummycanule los en verwijder deze, zodat u toegang krijgt tot de geleidecanule.Infundeer de CAR T-cellen gedurende één minuut en houd de behandelingscanule nog een minuut op zijn plaats. Na het verwijderen van de behandelingscanule, schroeft u een dummy-canule stevig terug. Dien vervolgens meloxicam subcutaan toe voor pijnbestrijding.De GPC2-gerichte CAR T-celtherapie induceerde significante tumorregressie in het medulloblastoom en significant verlengde overleving in het thalamische diffuse midline glioommodel. Bij het inbrengen van de geleidecanule op een intratumorale locatie, is het belangrijk om te begrijpen dat de dorsale-ventrale coördinaten oppervlakkiger kunnen zijn dan tumorinjectie om rekening te houden met de projectielengtes van de dummy en de behandelingscanule.

Research

JoVE Journal

Cancer Research

Intracranial Cannula Implantation for Serial Locoregional Chimeric Antigen Receptor (CAR) T Cell Infusions in Mice

A Syngeneic Mouse B-Cell Lymphoma Model for Pre-Clinical Evaluation of CD19 CAR T Cells

Een Syngeneic B-cel lymfoom muismodel voor pre-klinische evaluatie van CD19 auto T cellen

The astonishing clinical success of CD19 chimeric antigen receptor (CAR) T-cell therapy has led to the approval of two second generation chimeric antigen ...

A Spheroid Killing Assay by CAR T Cells

Een sferoïde doden Assay door auto T cellen

Immunotherapy has become a field of growing interest in the fight against cancer otherwise untreatable. Among all immunotherapeutic methods, chimeric ...

In Vitro Tumor Cell Rechallenge For Predictive Evaluation of Chimeric Antigen Receptor T Cell Antitumor Function

In Vitro Tumor cel Rechallenge voor voorspellende evaluatie van chimeer antigeen Receptor T cel antitumorale functie

The field of chimeric antigen receptor (CAR) T cell therapy is rapidly advancing with improvements in CAR design, gene-engineering approaches and ...

Using CRISPR/Cas9 to Knock Out GM-CSF in CAR-T Cells

CRISPR/Cas9 gebruiken om GM-CSF uit te nemen in CAR-T-cellen

Chimeric antigen receptor T (CAR-T) cell therapy is a cutting edge and potentially revolutionary new treatment option for cancer. However, there are ...

Manufacturing Chimeric Antigen Receptor (CAR) T Cells for Adoptive Immunotherapy

Manufacturing Chimeric Antigen Receptor CAR T Cells for Adoptive Immunotherapy

Productie van Chimerische antigeen receptor (auto) T cellen voor adoptie immunotherapie

Adoptive immunotherapy holds promise for the treatment of cancer and infectious disease. We describe a simple approach to transduce primary human T cells ...

Using Human Induced Pluripotent Stem Cells for the Generation of Tumor Antigen-specific T Cells

Met behulp van menselijke geïnduceerde pluripotente stamcellen voor het genereren van tumor-antigeen-specifieke T-cellen

The generation and expansion of functional T cells in vitro can lead to a broad range of clinical applications. One such use is for the treatment of ...

Ultrasound-Guided Orthotopic Implantation of Murine Pancreatic Ductal Adenocarcinoma

Echografie-geleide Orthotopic implantatie van Murine pancreatic Ductal adenocarcinoom

The recent success of immune checkpoint blockade in melanoma and lung adenocarcinoma has galvanized the field of immuno-oncology as well as revealed the ...

Robot Assisted Distal Pancreatectomy with Celiac Axis Resection (DP-CAR) for Pancreatic Cancer: Surgical Planning and Technique

Robot Assisted Distal Pancreatectomy with Celiac Axis Resection DP-CAR for Pancreatic Cancer: Surgical Planning and Technique

Robot Assisted Distal Pancreatectomy with Coeliakie Axis Resection (DP-CAR) voor alvleesklierkanker: Chirurgische planning en techniek

Malignant pancreatic tumors involving the celiac artery can be resected with a distal pancreatectomy, splenectomy and celiac axis resection (DP-CAR), ...

Dynamic Imaging of Chimeric Antigen Receptor T Cells with [18F]Tetrafluoroborate Positron Emission Tomography/Computed Tomography

Dynamic Imaging of Chimeric Antigen Receptor T Cells with [18F]Tetrafluoroborate Positron Emission Tomography/Computed Tomography

Dynamische beeldvorming van chimere antigeenreceptor T-cellen met [18F]Tetrafluoroboraat positronemissietomografie/computertomografie

T cells genetically engineered to express chimeric antigen receptors (CAR) have shown unprecedented results in pivotal clinical trials for patients with B ...

Natural Killer (NK) and CAR-NK Cell Expansion Method using Membrane Bound-IL-21-Modified B Cell Line

Natural Killer NK and CAR-NK Cell Expansion Method using Membrane Bound-IL-21-Modified B Cell Line

Natural Killer (NK) en CAR-NK-celuitbreidingsmethode met behulp van membraangebonden-IL-21-gemodificeerde B-cellijn

Chimeric antigen receptor (CAR)-modified immune cell therapy has become an emerging treatment for cancers and infectious diseases. NK-based immunotherapy, ...