Name: intracranial cannula implantation for serial locoregional chimeric antigen receptor (car) t cell infusions in mice
Uploaded: 2023-02-24T15:00:00
Duration: 5 min 22 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Intracranial Cannula Implantation for Serial Locoregional Chimeric Antigen Receptor CAR T Cell Infusions in Mice at JoVE.com

Finansiering for dette arbeidet ble gitt av Matthew Larson Foundation, Grayson Saves Foundation, Hyundai Hope on Wheels Young Investigator Award, Kortney Rose Foundation, National Institutes of Health NCI K12 CA076931-19 og 1K08CA263179-01, og Department of Defense W81XWH-21-1-0221.

Alle protokollprosedyrer ble godkjent av Institutional Animal Care and Use Committee ved Children's Hospital of Philadelphia (IAC 19-000907), som er akkreditert av AAALAC. Denne studien brukte 6-12 uker gamle NOD scid gamma (NSG) mus med ortotopiske xenografttumorer; Protokollen kan imidlertid brukes på hvilken som helst musestamme. NSG-mus ble plassert i sterile barriereforhold og kirurgi utført under sterile biosikkerhetsskap. Når humant materiale som tumorceller eller T-celler brukes, må prosedyrer og håndtering fullføres i ABSL-2 biosikkerhetsskap.
1. Klargjør musen for kirurgi
<ol><li>Bedøv musen i et induksjonskammer med isofluran (2-4 %) med en oksygenstrømningshastighet på 1 l/min inntil et adekvat anestesiplan er nådd (ca. 5 min).</li>
	<li>Vei musen med en vekt til nærmeste 0,1 g og administrer subkutan langtidsvirkende (SR), buprenorfin (1 mg/kg) eller andre smertestillende midler. MERK: SR buprenorfin gir analgesi i 72 timer.</li>
	<li>Barber pelsen på toppen av musens hode ved hjelp av elektriske klippere eller hårfjerningsmidler.</li>
	<li>Bruk en slikkepott til å forsiktig åpne bunnen av den stereotaktiske armen og sett inn guidekanylen ved hjelp av tang. Stram skruen på armen for å feste kanylen slik at omtrent 1/2 til 2/3 av den hvite plastdelen av kanylen stikker ut fra bunnen av åpningen, sammen med hele 5 mm metalllengden på kanylen.</li>
	<li>Sett inn og fest musens øverste tenner i bittstangen til det stereotaksiske apparatet. Trekk nesekjeglen fremover og stram den, slik at musen inhalerer isofluran.</li>
	<li>Monter musen på det oppvarmede stereotaksiske apparatet ved hjelp av øremansjetter eller ørestenger, og unngå for høyt trykk. MERK: Oppvarmet brett skal ha et rektalt termometer satt inn, og oppvarmingsbrettet skal justere for å opprettholde en normal kroppstemperatur på musen under prosedyren.</li>
	<li>Påfør steril oftalmisk salve på begge øynene ved hjelp av en bomullstippet applikator.</li>
	<li>Tørk operasjonsstedet med povidon-jod på en pute eller applikator, etterfulgt av en alkoholpute. Utfør dette trinnet totalt tre ganger.</li>
	<li>Før du begynner prosedyren, utfør en tåklemme med tang for å vurdere tilstrekkelig sedasjon.</li>
</ol>2. Kirurgisk prosedyre
MERK: Alle aspekter av den kirurgiske prosedyren benytter steriliserte instrumenter og aseptiske teknikker. Musene fortsetter under anestesi med isofluran (2-4%) gjennom hele prosedyrens varighet, ca. 10-20 min.
<ol><li>Ta forsiktig opp hodebunnen mellom ørene med tang. Bruk steril saks, klipp den løftede hodebunnen parallelt med skallen og fjern en oval hudklaff (0,75-1 cm i lengden) for å avsløre skallen. MERK: Saks foretrekkes fremfor en skalpell for å gi en ren, ovalformet åpning og for å forhindre unødvendig skade på omkringliggende hud og vev.</li>
	<li>Skyv bort fascia ved hjelp av en skalpell eller bomullspinner og en hemostatisk bomullspellet for å redusere overdreven blødning etter behov. MERK: Bruk av tresiden av en steril bomullsspiss kan også skyve bort fascia og bidra til å unngå overdreven blødning.</li>
	<li>Identifiser landemerkene bregma og lambda, de respektive fremre og bakre merkene på skallen der kranialplatene møtes13. MERK: Identifikasjon kan forsterkes ved å tørke toppen av den eksponerte skallen med hydrogenperoksid.</li>
	<li>Skår forsiktig skallen ved hjelp av en skalpell for å skape en overflate for akryl å feste. Poengberegningen bør omfatte flere lineære linjer som er ca. 0,5-1 cm lange, i 90° vinkler mot hverandre.</li>
	<li>Bruk den stereotaktiske armen til å lokalisere kanylen til landemerket av interesse (bregma eller lambda). Når den er lokalisert, løft kanylespissen 1-2 mm over skalleoverflaten og flytt til de ønskede koordinatene. For intratumorale injeksjoner bruker denne samme A / P og M / L koordinater som tumorplasseringen.</li>
	<li>På den eksponerte skallen, vekk fra området der kanylen kommer inn, lager du to skruehull med en 18 G nål eller en kirurgisk bor. Sørg for at hullene er fordelt for å få nok plass til kanylen. Bruk en borekrone, vri gjennom skruehullene til de fanger på skallen. Sett inn og fest to skruer i hullene ved hjelp av en skrutrekker med flat tipp. Trekk deretter skruene forsiktig opp for å sikre at de er sikret. MERK: Ikke sett inn skruene før de er i flukt med skallen, ellers kan de skade musehjernen under. La det være minst 1-2 mm mellomrom mellom skruen og skallen.</li>
	<li>Bruk en 18 G nål eller kirurgisk bor, bor gjennom skallen på de identifiserte koordinatene for å lage et hull for kanylen som skal settes inn.</li>
	<li>Bruk den stereotaktiske armen til å senke kanylen til ønsket D/V-koordinat. MERK: D/V-koordinaten for kanyleimplantasjon må ta hensyn til projeksjonslengden til dummyen og behandlingskanylene, og kan være mer overfladisk enn ortotopisk injeksjon av tumorceller (figur 1).</li>
	<li>I en porselen 12-brønnsplate fyller du en brønn med akrylharpikspulver (ca. 0,3 g) og 10-15 dråper (ca. 0,5-0,75 ml) akrylharpiksvæske. Dette gir et tyktflytende hvitfarget materiale. Trekk opp blandingen i en 1 ml sprøyte og bruk den til å belegge og dekke skallen, fyll ut mellomrommene rundt kanylen og skruene. MERK: Det viskøse materialet herdes til sement over tid, så dette trinnet bør fullføres umiddelbart etter blanding.</li>
	<li>Mens sementen fortsatt er bøyelig, løsner du skruen på den stereotaktiske armen og bruker en slikkepott i åpningen nederst for å forsiktig frigjøre kanylen fra holderen og sakte trekke den stereotaktiske armen oppover vekk fra musen.</li>
	<li>Når sementen er helt tørr, setter du dummykanylen inn i styrekanylen og fester den godt ved å vri med klokken.</li>
	<li>Når prosedyren er fullført, plasser musen tilbake i det oppvarmede hjemmeburet for å overvåke nøye, sikre tilstrekkelig gjenoppretting og registrere eventuelle observasjoner etter prosedyren, inkludert at musen har fullstendig gjenvunnet bevisstheten, før du returnerer til kolonien. NOTAT: Det anbefales generelt å plassere bare halvparten av buret på en varmepute for å tillate dyret å flytte til den kjøligere siden for å unngå overoppheting.</li>
	<li>Administrer ytterligere analgetika etter behov hvis musene viser smerteindikativ atferd postoperativt, slik som meloksikam 5 mg/kg subkutant levert én gang daglig i opptil 3 dager.</li>
</ol>3. Klargjøre CAR T-celler
<ol><li>Mål den pre-transfekterte CAR T-cellekonsentrasjonen ved hjelp av en celleteller.</li>
	<li>Sentrifuge pre-transfektede T-celler ved 200 x g i 5 minutter ved romtemperatur (RT).</li>
	<li>Aspirer supernatanten ved hjelp av en steril Pasteur-pipet på et vakuumaspirasjonssystem og resuspender pelleten i fosfatabufret saltvann (PBS) til ønsket konsentrasjon. Typiske leveringsvolumer er 2-5 μL. Typiske celledoser er 0,5-5 x 106 celler.</li>
</ol>4. CAR T-celleinfusjoner
<ol><li>Forbered behandlingskanylen ved å mate toppen gjennom et lite stykke PKG-slange.</li>
	<li>Fyll behandlingssprøyten med CAR T-cellesuspensjonen og stikk den inn gjennom den andre enden av PKG-slangen, nok til å dekke toppen av behandlingskanylen.</li>
	<li>Bedøv musen med isofluran (2-4 %) ved en oksygenstrømningshastighet på 1 l/min.</li>
	<li>Stabiliser styrekanylen ved hjelp av tang i bunnen, og skru deretter forsiktig av og fjern dummykanylen, slik at du får tilgang til føringskaylen. MERK: Et stereotaktisk oppsett er ikke nødvendig, men kan brukes til å stabilisere hodet for behandling.</li>
	<li>Infundere CAR T-cellene i 1 min og hold behandlingskanylen på plass i ytterligere 1 min etter avsluttet infusjon.</li>
	<li>Fjern behandlingskanylen og skru dummykanylen godt på plass igjen.</li>
	<li>Administrer subkutan meloksikam (5 mg/kg) for valgfri smertekontroll.</li>
</ol>

<ol>
	<li>Curtin, S. C., Minino, A. M., Anderson, R. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Declines+in+cancer+death+rates+among+children+and+adolescents+in+the+United+States,+1999-2014.">Declines in cancer death rates among children and adolescents in the United States, 1999-2014.</a> NCHS Data Brief. 257, 1-8 (2016).</li><li>Rohaan, M. W., Wilgenhof, S., Haanen, J. B. A. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adoptive+cellular+therapies:+the+current+landscape.">Adoptive cellular therapies: the current landscape.</a> Virchows Archiv. 474 (4), 449-461 (2019).</li><li>Sadelain, M., Brentjens, R., Riviere, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+basic+principles+of+chimeric+antigen+receptor+design.">The basic principles of chimeric antigen receptor design.</a> Cancer Discovery. 3 (4), 388-398 (2013).</li><li>Maude, S. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tisagenlecleucel+in+children+and+young+adults+with+B-cell+lymphoblastic+leukemia.">Tisagenlecleucel in children and young adults with B-cell lymphoblastic leukemia.</a> The New England Journal of Medicine. 378 (5), 439-448 (2018).</li><li>Wagner, J., Wickman, E., DeRenzo, C., Gottschalk, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CAR+T+cell+therapy+for+solid+tumors:+Bright+future+or+dark+reality.">CAR T cell therapy for solid tumors: Bright future or dark reality.</a> Molecular Therapy. 28 (11), 2320-2339 (2020).</li><li>Vitanza, N. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Locoregional+infusion+of+HER2-specific+CAR+T+cells+in+children+and+young+adults+with+recurrent+or+refractory+CNS+tumors:+an+interim+analysis.">Locoregional infusion of HER2-specific CAR T cells in children and young adults with recurrent or refractory CNS tumors: an interim analysis.</a> Nature Medicine. 27 (9), 1544-1552 (2021).</li><li>Majzner, R. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=GD2-CAR+T+cell+therapy+for+H3K27M-mutated+diffuse+midline+gliomas.">GD2-CAR T cell therapy for H3K27M-mutated diffuse midline gliomas.</a> Nature. 603 (7903), 934-941 (2022).</li><li>Vitanza, N. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intraventricular+B7-H3+CAR+T+cells+for+diffuse+intrinsic+pontine+glioma:+preliminary+first-in-human+bioactivity+and+safety.">Intraventricular B7-H3 CAR T cells for diffuse intrinsic pontine glioma: preliminary first-in-human bioactivity and safety.</a> Cancer Discovery. 13 (1), 114-131 (2023).</li><li>Theruvath, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Locoregionally+administered+B7-H3-targeted+CAR+T+cells+for+treatment+of+atypical+teratoid/rhabdoid+tumors.">Locoregionally administered B7-H3-targeted CAR T cells for treatment of atypical teratoid/rhabdoid tumors.</a> Nature Medicine. 26 (5), 712-719 (2020).</li><li>Donovan, L. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Locoregional+delivery+of+CAR+T+cells+to+the+cerebrospinal+fluid+for+treatment+of+metastatic+medulloblastoma+and+ependymoma.">Locoregional delivery of CAR T cells to the cerebrospinal fluid for treatment of metastatic medulloblastoma and ependymoma.</a> Nature Medicine. 26 (5), 720-731 (2020).</li><li>Brown, C. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regression+of+glioblastoma+after+chimeric+antigen+receptor+T-Cell+therapy.">Regression of glioblastoma after chimeric antigen receptor T-Cell therapy.</a> The New England Journal of Medicine. 375 (26), 2561-2569 (2016).</li><li>Bourne, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intracerebral+microdialysis:+30+years+as+a+tool+for+the+neuroscientist.">Intracerebral microdialysis: 30 years as a tool for the neuroscientist.</a> Clinical and Experimental Pharmacology and Physiology. 30 (1-2), 16-24 (2003).</li><li>Zhou, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Automatically+detecting+bregma+and+lambda+points+in+rodent+skull+anatomy+images.">Automatically detecting bregma and lambda points in rodent skull anatomy images.</a> PLoS One. 15 (12), 0244378 (2020).</li><li>Foster, J. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+GPC2-directed+chimeric+antigen+receptors+using+mRNA+for+pediatric+brain+tumors.">Development of GPC2-directed chimeric antigen receptors using mRNA for pediatric brain tumors.</a> Journal for Immunotherapy of Cancer. 10 (9), 004450 (2022).</li><li>Akhavan, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=T+cells+for+brain+tumors:+Lessons+learned+and+road+ahead.">T cells for brain tumors: Lessons learned and road ahead.</a> Immunological Reviews. 290 (1), 60-84 (2019).</li></ol>

JBF har et patent relatert til glypican 2 (GPC2)-rettede immunterapier. Alle andre forfattere har ingenting å avsløre.

CAR T-celleterapi har revolusjonert behandlingen av hematologiske kreftformer og viser lovende verdi ved behandling av solide hjernesvulster 6,7,8. Denne protokollen ble utformet for å muliggjøre preklinisk evaluering av lokoregional CAR T-cellelevering for behandling av pediatriske CNS-svulster. Kanylesystemet replikerer et Ommaya- eller Rickham-reservoar, et intraventrikulært katetersystem som for tiden brukes i pågående kliniske studier av CAR T-celleterapi i pediatriske CNS-svulster 6,7,8, og understreker relevansen og translasjonspotensialet til disse metodene. Dette systemet tillater gjentatt levering av CAR T-celler som omgår blod-hjernebarrieren, igjen lik metoder som brukes i pågående kliniske studier. Lokoregional levering kan gi maksimal effekt i CNS9 og kan også redusere risikoen for systemisk toksisitet forbundet med handel fra sirkulasjon15. Mens stereotaktisk levering kan gi en enkelt dose til CNS, er fordelen med dette systemet muligheten til å gi flere gjentatte doser til et spesifisert sted i CNS uten behov for flere operasjoner. Begrensningene i denne prosedyren inkluderer et fast leveringssted uten mulighet til å endre plassering eller foreta justeringer når kanylen er på plass, og potensialet for løsing av kanylen.
Et kritisk trinn i denne protokollen er implantasjonen av den faste føringskanylen ved en D/V-koordinat som tar hensyn til projeksjonen av behandlingskanylene. Behandlingskanylen vil stikke utover spissen av styrekanylen, og det må derfor utvises forsiktighet for å sikre at plasseringen vil resultere i levering av CAR T-celler til området av interesse. Projeksjonslengder av behandlingskanylen kan tilpasses, og i forfatterens erfaring er 0,5 mm en nyttig projeksjonslengde. Denne lengden sikrer at terapeuten ikke forblir i guidekanylen ved utlevering, men krever heller ikke vesentlig justering av D/V-koordinatene for guidekanylen til interesseområdet. Et annet viktig skritt i denne protokollen er tiden behandlingskanylen er igjen på plass etter CAR T-celleinfusjon. Behandlingskanylen bør holdes på plass i minst 1 min etter avsluttet infusjon for å forhindre lekkasjer og tap av lokoregional levering av CAR T-celleterapi.
Feilsøking av denne metoden er enkel, med de fleste komplikasjoner som involverer vanskeligheter med å fjerne dummykanylen eller sette inn behandlingskanylen i den faste føringskanylen, sannsynligvis på grunn av tørket blod på innsiden av guidekanylen. Dette kan enkelt løses ved å forsiktig føre dummykanylen gjennom styrekanylen til det er mindre motstand og ruskene er ryddet. Akrylharpiksen kan av og til løsne fra skallen, noe som resulterer i tap av kanylesystemet. Vår erfaring er at dette generelt begrenses ved å skåre skallen med en skalpell og plassering av to skruer. I tillegg fjernes gjenstander fra buret som ved et uhell kan bruke kraft på kanylen mens musen beveger seg rundt, for eksempel spesielle museberikelseshytter med små åpninger.
Avslutningsvis er beskrevet her en protokoll for innsetting av et kanylesystem i murine modeller av CNS-svulster for gjentatt levering av CAR T-celler. Kanyleplassering kan justeres til flere lokoregionale leveringssteder, og teste effektiviteten til forskjellige leveringssteder. I tillegg kan dette systemet brukes til ytterligere terapeutiske midler utover CAR T-celler for å evaluere effekten ved omgåelse av blod-hjernebarrieren, og kan også være nyttig for evaluering av terapeutiske midler i murine modeller av ikke-onkologiske lidelser.

Til tross for forbedringer i kjemoterapi, strålebehandling og kirurgi, er svulster i sentralnervesystemet (CNS) den dødeligste maligniteten i pediatri1, og understreker et viktig behov for nye tilnærminger med mer vellykkede resultater. Med betydelige fremskritt innen immunterapi har adoptiv cellulær terapi (ACT) tilnærminger vist lovende resultater i ulike kreftformer, spesielt hematologiske maligniteter2. Kimær antigenreseptor (CAR) T-celleterapi, en spesifikk type ACT, utnytter immunsystemets naturlige evne til å gjenkjenne og drepe skadelige celler ved å omdirigere spesifisiteten til T-celler for å generere tumormålrettede T-celler3. CAR T-celleterapi har vist betydelig suksess i behandlingen av leukemi og lymfomer4, noe som gjør den til en lovende immunoterapeutisk tilnærming og oppmuntrer til undersøkelse i solide svulster. Imidlertid har CAR T-celleterapi i solide svulster hittil oppnådd liten klinisk suksess og står overfor mange utfordringer, for eksempel ineffektiv tumorpenetrasjon, begrensede målrettede antigener og det undertrykkende tumormikromiljøet5.
Nylige kliniske studier har begynt å evaluere CAR T-celleterapi for pediatriske CNS-svulster, og gir bevis på konsept og tidlig bevis på T-celleaktivitet i foreløpige rapporter 6,7,8. Mens de fleste innledende prekliniske data fokuserte på intravenøs levering av CAR T-cellene, har nyere prekliniske bevis antydet overlegenhet av lokoregional levering i CNS 9,10, som også har blitt brukt med hell i flere kliniske studier6,7,8,11. Prekliniske studier hittil som har innlemmet den lokoregionale leveransen av CAR T-celler i CNS, har basert seg på en enkelt intrakraniell dose CAR T-celler levert stereotaktisk 9,10. Imidlertid har kliniske studier på mennesker krevd gjentatte infusjoner av CAR T-celler i CNS 6,7,8,11, noe som understreker behovet for å evaluere flere gjentatte infusjoner i preklinisk utvikling. Målet med denne prosedyren er å kunne teste serielle CAR T-celleinfusjoner ved hjelp av et kateter i ortotopiske murine modeller av pediatriske hjernesvulster. Fordelen med denne teknikken er å unngå flere kirurgiske prosedyrer for å gi gjentatte intra-CNS-behandlinger. Kanyler har primært blitt brukt til mikrodialyseprøvetaking av nevrotransmittere og levering av nevroaktive stoffer i nevrovitenskap og atferdsforskning hos gnagere12, med begrensede rapporter om deres bruk for levering av kreftbehandling. Basert på de tidligere rapportene bruker denne protokollen et stereotaktisk plassert inneliggende kanylesystem for å levere CAR T-celler i xenograft murine modeller av CNS-svulster. Protokollen kan brukes til å teste ytterligere terapeutiske midler i murine modeller av nevrologiske eller nevro-onkologiske lidelser, og kan være nyttig for å teste nye terapier der omgåelse av blod-hjernebarrieren er kritisk for effekt.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>18 G needles</td>
			<td>BD</td>
			<td>511097</td>
			<td>1 1/2 inch metal hub</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acrylic resin liquid</td>
			<td>Lang Dental&#160;</td>
			<td>B1323&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acrylic resin powder</td>
			<td>Lang Dental&#160;</td>
			<td>B1323&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alcohol wipes</td>
			<td>BD</td>
			<td>326895</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge 5240</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>5420000040</td>
			<td>Centrifuge&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cotton tipped swabs</td>
			<td>Puritan</td>
			<td>826-WC</td>
			<td>Handle Width = 2.11 mm (0.083), Head Width = 1.27 mm (0.050), Handle Length = 147.62 mm (5.812), Overall Length = 152.4 mm (6), Head Length = 12.7 mm (0.500)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Drill bit holder&#160;</td>
			<td>P1 Technologies&#160;</td>
			<td>DH-1&#160;</td>
			<td>Drill bit holder for D56-D70&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Drill bit&#160;</td>
			<td>P1 Technologies&#160;</td>
			<td>D58&#160;</td>
			<td>1.07 mm&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dummy cannula&#160;</td>
			<td>P1 Technologies&#160;</td>
			<td>C315DCS-5/SPC&#160;</td>
			<td>Configuration: Small cap; &#160;Length: Cut 5.00 mm below pedestal; Projection: 0.50 mm&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Flat tip screwdriver&#160;</td>
			<td>P1 Technologies&#160;</td>
			<td>SD-80&#160;</td>
			<td>Screwdriver&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Graefe forceps</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>11051-10</td>
			<td>Forceps</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Guide cannula&#160;</td>
			<td>P1 Technologies&#160;</td>
			<td>C315GS-5/SPC&#160;</td>
			<td>Configuration: 5.00 mm pedestal height; Length: Cut 5.00 mm below pedestal&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hemostatic cotton pellets with racemic epinephrine&#160;</td>
			<td>Pascal&#160;</td>
			<td>1151602&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MOXI Z Mini automated cell counter Kit&#160;</td>
			<td>Moxi</td>
			<td>MXZ001</td>
			<td>Cell counter</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NOD&#160;scid&#160;gamma (NSG) mice</td>
			<td>Jackson Laboratory</td>
			<td>5557</td>
			<td>6 to 12-week-old males and females</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pasteur pipet</td>
			<td>VWR</td>
			<td>14673-043</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PKG tubing&#160;</td>
			<td>P1 Technologies&#160;</td>
			<td>C313CT&#160;</td>
			<td>Diameter: 0.58 mm x 1.27 mm&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Porcelain 12 well plate</td>
			<td>Flinn Scientific</td>
			<td>AP6064&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Povidone iodine</td>
			<td>Medline</td>
			<td>MDS093943</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scalpel</td>
			<td>World Precision Instrument</td>
			<td>50-822-457</td>
			<td>Disposable Scalpel, no.10, sterile, 10/box, Plastic Handle with 6&#34; Ruler</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Screws&#160;</td>
			<td>P1 Technologies&#160;</td>
			<td>0-80 X 3/32&#160;</td>
			<td>2.4 mm&#160;&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stereotaxic Frame&#160;</td>
			<td>David Kopf Instruments&#160;</td>
			<td>940&#160;</td>
			<td>Model 940 Small Animal Stereotaxic Instrument with Digital Display Console&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Student fine scissors</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>91460-12</td>
			<td>Scissors</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Treatment cannula&#160;</td>
			<td>P1 Technologies&#160;</td>
			<td>C315IS-5/SPC&#160;</td>
			<td>33GA;&#160;Configuration: Standard internal; Length: Cut 5.00 mm below pedestal; Projection: 0.50 mm&#160;&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Treatment syringes&#160;</td>
			<td>Hamilton</td>
			<td>87908</td>
			<td>5 &#181;L, Model 75 Cemented Needle Special (SN) Syringe, 75SN/22/0.5&#34;/PT3&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vactrap XL&#160;</td>
			<td>Foxx Life Sciences</td>
			<td>305-4401-FLS</td>
			<td>Vacuum System</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

intracranial cannula implantation for serial locoregional chimeric antigen receptor (car) t cell infusions in mice

Pediatriske CNS-svulster er ansvarlige for flertallet av kreftrelaterte dødsfall hos barn og har dårlige prognoser, til tross for fremskritt innen kjemoterapi og strålebehandling. Siden mange svulster mangler effektive behandlinger, er det et avgjørende behov for å utvikle mer lovende terapeutiske alternativer, for eksempel immunterapier; bruk av kimær antigenreseptor (CAR) T-celleterapi rettet mot CNS-svulster er av spesiell interesse. Celleoverflatemål som B7-H3, IL13RA2 og disialogangliosid GD2 uttrykkes sterkt på overflaten av flere pediatriske og voksne CNS-svulster, noe som øker muligheten til å bruke CAR T-celleterapi mot disse og andre overflatemål. For å evaluere gjentatt lokoregional levering av CAR T-celler i prekliniske murinmodeller, ble det etablert et inneliggende katetersystem som rekapitulerer inneliggende katetre som for tiden brukes i kliniske studier på mennesker. I motsetning til stereotaktisk levering, tillater det inneliggende katetersystemet gjentatt dosering uten bruk av flere operasjoner. Denne protokollen beskriver den intratumorale plasseringen av en fast guidekanyle som har blitt brukt til å teste serielle CAR T-celleinfusjoner i ortotopiske murinmodeller av hjernesvulster hos barn. Etter ortotopisk injeksjon og transplantasjon av tumorcellene hos mus, fullføres intratumoral plassering av en fast føringskanyle på et stereotaktisk apparat og sikres med skruer og akrylharpiks. Behandlingskanyler settes deretter inn gjennom den faste føringskanylen for gjentatt CAR T-cellelevering. Stereotaktisk plassering av guidekanylen kan justeres for å levere CAR T-celler direkte inn i lateral ventrikkel eller andre steder i hjernen. Denne plattformen tilbyr en pålitelig mekanisme for preklinisk testing av gjentatte intrakranielle infusjoner av CAR T-celler og andre nye terapier for disse ødeleggende pediatriske svulstene.

Vellykket kanyleimplantasjon i musens CNS Mus med vellykket kanylering har en sikker ledekanyle på plass, som ikke forstyrrer dagliglivets aktiviteter (figur 2A) og som lett kan passere en behandlingskanyle og levere væske uten motstand (figur 2B). Vår erfaring er at de fleste kanyler forblir på plass i over 4 uker, selv om 0-25% kan løsnes over tid. Verifisering av korrekt plassering kan bekreftes med Evans blått fargestoff injisert i kanylen. For eksempel viser en kanyle satt inn i lateral ventrikkel Evans blått fargestoff gjennom ventrikkelsystemet når det beveger seg gjennom hjernespinalvæsken, og bekrefter riktig plassering (figur 2C). Kanyler satt inn i svulsten viser Evans blått fargestoff på stedet for tumorimplantasjon.
Effektiv levering av CAR T-celler inn i CNS for behandling av xenografttumorer. Effekten av det intrakraniale kanylesystemet og den terapeutiske effekten av CAR T-celler i murine modeller kan måles gjennom en rekke mekanismer, inkludert bioluminescerende avbildning og total overlevelse. GPC2-rettede CAR T-celler ble testet mot murine medulloblastom og diffuse midline glioma-modeller, henholdsvis 7316-4509 og 7316-3058, ved bruk av gjentatt CAR T-celledosering via angitt intrakranialt kanylesystem14. Ortotopisk tumorplassering og engraftment ble bekreftet ved bioluminescerende avbildning, og kanyler ble lagt i tumorsengen med samme koordinater som ortotopisk tumorplassering. Behandlingene besto av GPC2 CAR T-celleinfusjoner en til to ganger i uken i 2-4 uker, totalt fire til seks doser. Etter behandling induserte GPC2-rettet CAR T-celleterapi signifikant tumorregresjon i medulloblastommodellen 7316-4509 (p < 0,01) (figur 3A) og signifikant forlenget overlevelse ved talamisk diffus midtlinjegliom 7316-3058 (p < 0,05) (figur 3B)14.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64886/64886fig01.jpg"> Figur 1: Guidekanyle med projeksjonsdukke og behandlingskanyler. (A) Føringskanyle med 0,5 mm projeksjon og 2 mm projeksjonsdukkekanyler på plass. (B) Føringskanyle med 0,5 mm projeksjon og 2 mm projeksjonsbehandlingskanyler på plass. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64886/64886fig01large.jpg" target="_blank">Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64886/64886fig02.jpg"> Figur 2: Behandlingskanyleleveringssystem for gjentatte doser av CAR T-celler . (A) Kanyle implantert i en museskalle med en hette på plass når den ikke er i bruk. (B) Infusjon av CAR T-celler i en pontintumor via behandlingskanylen mens musen er under anestesi. (C) Verifisering av kanyleplassering i lateral ventrikkel ved bruk av Evans blått fargestoff. Fargestoff ble satt inn gjennom kanylen, etterfulgt av eutanasi og hjerneeksisjon, med fargestoff tilstede gjennom ventriklene. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64886/64886fig02large.jpg" target="_blank">Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64886/64886fig03.jpg"> Figur 3: GPC2-rettede CAR T-celler medierer antitumorresponser og forlenger overlevelsen ved pediatriske hjernesvulster in vivo. (A) Kvantifisering av bioluminescens av ortotopisk gruppe 4 medulloblastom xenograft 7316-4509 behandlet med enten GPC2- eller CD19-rettede mRNA CAR T-celler. Doser er indikert med piler på grafen. Data vises som gjennomsnitt med SD, n = 9-11 mus per arm. (B) Total overlevelse hos mus implantert med talamisk DMG xenograft 7316-3058 behandlet med seks gjentatte doser på 2 x 106 CAR T-celler. Doser er indikert med piler på grafen. n = 7 mus per arm. **p < 0,01; *p < 0,05; NS = ikke signifikant. Denne figuren er gjengitt med tillatelse fra Foster et al.14. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64886/64886fig03large.jpg" target="_blank">Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Intracranial Cannula Implantation for Serial Locoregional Chimeric Antigen Receptor CAR T Cell Infusions in Mice at JoVE.com

Intracranial Cannula Implantation for Serial Locoregional Chimeric Antigen Receptor CAR T Cell Infusions in Mice

Svulster i sentralnervesystemet (CNS) er den ledende årsaken til kreftrelatert død hos barn, og lokoregionale immunbaserte terapier blir i økende grad testet for pasienter i kliniske studier. Denne protokollen beskriver metoder for lokoregional kanyleimplantasjon hos mus for preklinisk evaluering av immunterapeutiske infusjoner rettet mot CNS-svulster.

Intrakranial kanyleimplantasjon for serielle lokoregionale kimære antigenreseptor (CAR) T-celleinfusjoner hos mus

Pediatric CNS tumors are responsible for the majority of cancer-related deaths in children and have poor prognoses, despite advancements in chemotherapy ...

Denne protokollen replikerer et intraventrikulært katetersystem som brukes i pågående kliniske studier for å teste lokal regional levering av CAR T-celleterapi rettet mot svulster i sentralnervesystemet. Den største fordelen med denne teknikken er evnen til å gi flere gjentatte doser av lokal regional CAR T-celleterapi uten å utføre flere invasive kirurgiske prosedyrer. Dette systemet kan brukes til å undersøke ulike terapier på forskjellige leveringssteder, og kan dermed gi innsikt i et mylder av forskningsområder innen nevrovitenskap.For å begynne, plasser den bedøvede musen med barbert hode på operasjonsbordet og åpne bunnen av den stereotaktiske armen forsiktig med en slikkepott. Sett kanylen inn med tang og fest den ved å stramme skruen på armen til en halv til to tredjedeler av den hvite plastdelen og fem millimeter av kanylen stikker ut fra bunnen av åpningen. Sett inn og fest musens øverste tenner i bittstangen til det stereotaksiske apparatet.Trekk nesekjeglen fremover og stram den, slik at musen inhalerer isofluran. Monter deretter musen på det oppvarmede stereotaksiske apparatet ved hjelp av øremansjetter eller ørestenger, og unngå for høyt trykk. Desinfiser operasjonsstedet og lag et kutt parallelt med hodeskallen som beskrevet i manuskriptet.Bruk bomullspinner for å skyve fasciaen bort. Identifiser landemerkene, bregma og lambda på skallen som tilsvarer fremre og bakre merker der kranialplatene møtes. For å lage en overflate for å feste akryl, gjør du forsiktig flere spalter over skallen ved hjelp av en skalpell.Bruk den stereotaktiske armen til å lokalisere kanylen til landemerket av interesse. Løft kanylespissen en til to millimeter over skalleoverflaten og flytt til de ønskede koordinatene. Bruk en 18 gauge nål eller kirurgisk bor, lage to skruehull på den eksponerte skallen vekk fra der kanylen kommer inn, og sørg for nok plass til kanylen.Vri boret gjennom skruehullet til det festes til skallen. Med en skrutrekker med flat spiss, sett inn og fest to skruer i hullene. Deretter trekker du skruen forsiktig opp for å sikre at den er festet.For å sette inn en kanyle, lag et hull i skallen ved de identifiserte koordinatene ved hjelp av en 18 gauge nål eller kirurgisk bor. Bruk den stereotaktiske armen til å senke kanylen til ønsket DV-koordinat. Ved ca. 0,3 gram akrylharpikspulver og 10 til 15 dråper væske i en porselen 12-brønnsplate, legg det tilberedte viskøse hvitfargede materialet i en milliliter sprøyte.Belegg skallen og fyll mellomrommene rundt kanylen og skruen. Løsne skruen på den stereotaktiske armen mens sementen er fleksibel. Bruk forsiktig en slikkepott for å løsne kanylen fra holderen i bunnåpningen og trekk den stereotaktiske armen bort fra musen.Når sementen er tørket, sett dummykanylen inn i styrekanylen og roter med klokken for å feste den tett. Når prosedyren er fullført, returner musen til det oppvarmede hjemmeburet for gjenoppretting. For å forberede behandlingskanylen, sett toppen inn i PKG-slangen.Fyll deretter behandlingssprøyten med CAR T-cellesuspensjon og sett den inn gjennom den andre enden av PKG-slangen, som dekker toppen av behandlingskanylen. Etter å ha bedøvet musen, fest føringskanylen på basen ved hjelp av tang. Skru av og fjern dummykanylen, slik at du får tilgang til føringskanylen.Tilsett CAR T-cellene i ett minutt og hold behandlingskanylen på plass i ytterligere ett minutt. Etter å ha fjernet behandlingskanylen, skru en dummykanyle godt tilbake. Deretter administreres meloksikam subkutant for smertekontroll.GPC2-rettet CAR T-celleterapi induserte signifikant tumorregresjon i medulloblastom og signifikant forlenget overlevelse i talamisk diffus midtlinjegliommodell. Når du setter inn guidekanylen på et intratumoralt sted, er det viktig å forstå at de dorsal-ventrale koordinatene kan være mer overfladiske enn tumorinjeksjon for å ta hensyn til dummy- og behandlingskanylens projeksjonslengder.

Research

JoVE Journal

Cancer Research

Intracranial Cannula Implantation for Serial Locoregional Chimeric Antigen Receptor (CAR) T Cell Infusions in Mice

A Syngeneic Mouse B-Cell Lymphoma Model for Pre-Clinical Evaluation of CD19 CAR T Cells

En Syngeneic mus B-celle lymfom modell for pre-klinisk evaluering av CD19 bil T-celler

The astonishing clinical success of CD19 chimeric antigen receptor (CAR) T-cell therapy has led to the approval of two second generation chimeric antigen ...

A Spheroid Killing Assay by CAR T Cells

En Spheroid drapet analysen av bilen T celler

Immunotherapy has become a field of growing interest in the fight against cancer otherwise untreatable. Among all immunotherapeutic methods, chimeric ...

In Vitro Tumor Cell Rechallenge For Predictive Evaluation of Chimeric Antigen Receptor T Cell Antitumor Function

I Vitro svulst celle Rechallenge For prediktiv evaluering av Chimeric Antigen reseptor T celle Antitumor funksjon

The field of chimeric antigen receptor (CAR) T cell therapy is rapidly advancing with improvements in CAR design, gene-engineering approaches and ...

Using CRISPR/Cas9 to Knock Out GM-CSF in CAR-T Cells

Bruke CRISPR/Cas9 å Knock Out GM-CSF i CAR-T celler

Chimeric antigen receptor T (CAR-T) cell therapy is a cutting edge and potentially revolutionary new treatment option for cancer. However, there are ...

Manufacturing Chimeric Antigen Receptor (CAR) T Cells for Adoptive Immunotherapy

Manufacturing Chimeric Antigen Receptor CAR T Cells for Adoptive Immunotherapy

Fremstilling chimeric antigen reseptor (CAR) T celler for adoptiv immunterapi

Adoptive immunotherapy holds promise for the treatment of cancer and infectious disease. We describe a simple approach to transduce primary human T cells ...

Using Human Induced Pluripotent Stem Cells for the Generation of Tumor Antigen-specific T Cells

Bruke Human indusert Pluripotent stamceller for generering av tumor antigen-spesifikke T celler

The generation and expansion of functional T cells in vitro can lead to a broad range of clinical applications. One such use is for the treatment of ...

Ultrasound-Guided Orthotopic Implantation of Murine Pancreatic Ductal Adenocarcinoma

Ultralyd-guidet Orthotopic implantation av murine bukspyttkjertelen ductal Adenokarsinom

The recent success of immune checkpoint blockade in melanoma and lung adenocarcinoma has galvanized the field of immuno-oncology as well as revealed the ...

Robot Assisted Distal Pancreatectomy with Celiac Axis Resection (DP-CAR) for Pancreatic Cancer: Surgical Planning and Technique

Robot Assisted Distal Pancreatectomy with Celiac Axis Resection DP-CAR for Pancreatic Cancer: Surgical Planning and Technique

Robotassistert distal pankreatektomi med celiac akse reseksjon (DP-CAR) for bukspyttkjertelkreft: Kirurgisk planlegging og teknikk

Malignant pancreatic tumors involving the celiac artery can be resected with a distal pancreatectomy, splenectomy and celiac axis resection (DP-CAR), ...

Dynamic Imaging of Chimeric Antigen Receptor T Cells with [18F]Tetrafluoroborate Positron Emission Tomography/Computed Tomography

Dynamic Imaging of Chimeric Antigen Receptor T Cells with [18F]Tetrafluoroborate Positron Emission Tomography/Computed Tomography

Dynamisk avbildning av chimeriske antigenreseptor T-celler med [18F]Tetrafluoroborate Positron Emission Tomography/Computed Tomography

T cells genetically engineered to express chimeric antigen receptors (CAR) have shown unprecedented results in pivotal clinical trials for patients with B ...

Natural Killer (NK) and CAR-NK Cell Expansion Method using Membrane Bound-IL-21-Modified B Cell Line

Natural Killer NK and CAR-NK Cell Expansion Method using Membrane Bound-IL-21-Modified B Cell Line

Natural Killer (NK) og CAR-NK Cell Expansion Method ved bruk av Membran Bound-IL-21-Modified B Cell Line

Chimeric antigen receptor (CAR)-modified immune cell therapy has become an emerging treatment for cancers and infectious diseases. NK-based immunotherapy, ...