Name: intracranial cannula implantation for serial locoregional chimeric antigen receptor (car) t cell infusions in mice
Uploaded: 2023-02-24T15:00:00
Duration: 5 min 22 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Intracranial Cannula Implantation for Serial Locoregional Chimeric Antigen Receptor CAR T Cell Infusions in Mice at JoVE.com

Finansiering för detta arbete tillhandahölls av Matthew Larson Foundation, Grayson Saves Foundation, Hyundai Hope on Wheels Young Investigator Award, Kortney Rose Foundation, National Institutes of Health NCI K12 CA076931-19 och 1K08CA263179-01 och försvarsdepartementet W81XWH-21-1-0221.

Alla protokollprocedurer godkändes av Institutional Animal Care and Use Committee of the Children's Hospital of Philadelphia (IAC 19-000907), som är ackrediterad av AAALAC. Denna studie använde 6-12 veckor gamla NOD scid gamma (NSG) möss med ortotopiska xenografttumörer; Protokollet kan dock användas på alla musstammar. NSG-möss hölls i sterila barriärförhållanden och kirurgi utfördes under sterila biosäkerhetsskåp. När mänskligt material som tumörceller eller T-celler används måste procedurer och hantering slutföras i ABSL-2 biosäkerhetsskåp.
1. Förbereda musen för operation
<ol><li>Bedöva musen i en induktionskammare med isofluran (2-4%) med en syreflödeshastighet på 1 l/min tills ett adekvat anestesiplan uppnås (ca 5 min).</li>
	<li>Väg musen med en våg med en noggrannhet av 0,1 g och administrera subkutan långsam frisättning (SR), buprenorfin (1 mg/kg) eller annat smärtstillande medel. OBS: SR buprenorfin ger smärtlindring i 72 timmar.</li>
	<li>Raka pälsen på toppen av musens huvud med elektriska klippare eller hårborttagningsmedel.</li>
	<li>Använd en spatel för att försiktigt öppna botten av den stereotaktiska armen och sätt in styrkanylen med pincett. Dra åt skruven på armen för att säkra kanylen så att ungefär 1/2 till 2/3 av kanylens vita plastdel sticker ut från öppningens botten, tillsammans med kanylens hela 5 mm metalllängd.</li>
	<li>Sätt i och säkra musens övre tänder i bitstången på den stereotaktiska apparaten. Dra noskonen framåt och dra åt den, se till att musen andas in isofluran.</li>
	<li>Montera musen på den uppvärmda stereotaxiska apparaten med öronmanschetter eller öronstänger, undvik alltför stort tryck. OBS: Uppvärmd bricka ska ha en rektal termometer isatt och värmebrickan ska justeras för att bibehålla en normal kroppstemperatur hos musen under proceduren.</li>
	<li>Applicera steril oftalmisk salva på båda ögonen med en bomullsspetsad applikator.</li>
	<li>Torka av operationsområdet med povidonjod på en kudde eller applikator, följt av en alkoholkudde. Utför detta steg tre gånger totalt.</li>
	<li>Innan proceduren påbörjas, utför en tåknäpa med pincett för att bedöma adekvat sedering.</li>
</ol>2. Kirurgiskt ingrepp
OBS: Alla aspekter av det kirurgiska ingreppet använder steriliserade instrument och aseptiska tekniker. Mössen fortsätter under narkos med isofluran (2-4%) under hela ingreppet, ca 10-20 min.
<ol><li>Ta försiktigt upp hårbotten mellan öronen med pincett. Använd steril sax, skär den lyftade hårbotten parallellt med skallen och ta bort en oval flik av huden (0,75-1 cm i längd) för att exponera skallen. OBS: Sax föredras framför en skalpell för att ge en ren, ovalformad öppning och för att förhindra onödig skada på omgivande hud och vävnad.</li>
	<li>Tryck bort fascia med hjälp av en skalpell eller bomullsspetsade swabs och en hemostatisk bomullspellet för att hjälpa till att bromsa överdriven blödning efter behov. OBS: Att använda träsidan av en steril bomullsspets kan också skjuta bort fascia och hjälpa till att undvika överdriven blödning.</li>
	<li>Identifiera landmärkena bregma och lambda, respektive främre och bakre märken på skallen där kranialplattorna möter13. OBS: Identifieringen kan förstärkas genom att torka av toppen av den exponerade skallen med väteperoxid.</li>
	<li>Gör försiktigt skallen med en skalpell för att skapa en yta för akrylen att fästa. Poängsättning bör innehålla flera linjära linjer som är ungefär 0,5-1 cm långa i 90° vinkel mot varandra.</li>
	<li>Använd den stereotaxiska armen och lokalisera kanylen till landmärket av intresse (bregma eller lambda). När du är lokaliserad, höj kanylspetsen 1-2 mm ovanför skallytan och flytta till önskade koordinater. För intratumorala injektioner använder detta samma A / P- och M / L-koordinater som tumörplaceringen.</li>
	<li>På den exponerade skallen, bort från det område där kanylen kommer in, gör två skruvhål med en 18 G nål eller en kirurgisk borr. Se till att hålen är placerade så att det finns tillräckligt med utrymme för kanylen. Vrid genom skruvhålen med en borr tills de fastnar i skallen. Sätt i och fäst två skruvar i hålen med en skruvmejsel med platt spets. Dra sedan försiktigt upp skruvarna för att säkerställa att de är säkrade. OBS: Sätt inte i skruvarna förrän de är i jämnhöjd med skallen, annars kan de skada mushjärnan under. Lämna minst 1-2 mm mellanrum mellan skruven och skallen.</li>
	<li>Använd en 18 G nål eller kirurgisk borr genom skallen vid de identifierade koordinaterna för att skapa ett hål för kanylen som ska sättas in.</li>
	<li>Använd den stereotaktiska armen och sänk kanylen till önskad D/V-koordinat. OBS: D/V-koordinaten för kanylimplantation måste ta hänsyn till provdockans projektionslängd och behandlingskanyler och kan vara ytligare än den ortotopiska injektionen av tumörceller (figur 1).</li>
	<li>I en porslin 12-brunnsplatta fyller du en brunn med akrylhartspulver (ca 0,3 g) och 10-15 droppar (ca 0,5-0,75 ml) akrylhartsvätska. Detta ger ett visköst vitfärgat material. Dra upp blandningen i en 1 ml spruta och använd den för att belägga och täcka skallen, fyll i utrymmena runt kanylen och skruvarna. OBS: Det viskösa materialet härdar till cement över tiden, så detta steg bör slutföras omedelbart efter blandning.</li>
	<li>Medan cementet fortfarande är smidigt, lossa skruven på den stereotaktiska armen och använd en spatel i öppningen längst ner för att försiktigt släppa kanylen från hållaren och dra långsamt tillbaka den stereotaktiska armen uppåt från musen.</li>
	<li>När cementet är helt torrt, sätt in dockkanylen i styrkanylen och säkra den ordentligt genom att vrida medurs.</li>
	<li>När proceduren är klar, placera musen tillbaka i sin uppvärmda hembur för att noggrant övervaka, säkerställa adekvat återhämtning och registrera eventuella observationer efter proceduren, inklusive att musen har återfått medvetandet helt, innan den återvänder till kolonin. OBS: Det rekommenderas generellt att placera endast hälften av buren på en värmedyna så att djuret kan flytta till den svalare sidan för att undvika överhettning.</li>
	<li>Administrera ytterligare analgetika efter behov om mössen uppvisar beteenden som tyder på smärta postoperativt, såsom meloxikam 5 mg/kg subkutant levererat en gång dagligen i upp till 3 dagar.</li>
</ol>3. Förbereda CAR T-celler
<ol><li>Mät den förtransfekterade CAR T-cellkoncentrationen med hjälp av en cellräknare.</li>
	<li>Centrifugera förtransfekterade T-celler vid 200 x g i 5 minuter vid rumstemperatur (RT).</li>
	<li>Aspirera supernatanten med en steril Pasteur-pipett på ett vakuumaspirationssystem och suspendera pelleten i fosfatatbuffrad saltlösning (PBS) till önskad koncentration. Typiska leveransvolymer är 2-5 μL. Typiska celldoser är 0,5-5 x 106 celler.</li>
</ol>4. CAR T-cellinfusioner
<ol><li>Förbered behandlingskanylen genom att mata toppen genom en liten bit PKG-slang.</li>
	<li>Fyll behandlingssprutan med CAR T-cellsuspensionen och för in den genom den andra änden av PKG-slangen, tillräckligt för att täcka toppen av behandlingskanylen.</li>
	<li>Bedöva musen med isofluran (2-4%) med en syreflödeshastighet på 1 l/min.</li>
	<li>Stabilisera styrkanylen med pincett vid basen och skruva sedan försiktigt loss och ta bort dummykanylen, så att du kan komma åt styrkanylen. OBS: En stereotaxisk inställning är inte nödvändig, men kan användas för att stabilisera huvudet för behandling.</li>
	<li>Infusera CAR T-cellerna i 1 minut och håll behandlingskanylen på plats i ytterligare 1 minut efter avslutad infusion.</li>
	<li>Ta bort behandlingskanylen och skruva fast dockkanylen ordentligt igen.</li>
	<li>Administrera subkutan meloxikam (5 mg/kg) för valfri smärtkontroll.</li>
</ol>

<ol>
	<li>Curtin, S. C., Minino, A. M., Anderson, R. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Declines+in+cancer+death+rates+among+children+and+adolescents+in+the+United+States,+1999-2014.">Declines in cancer death rates among children and adolescents in the United States, 1999-2014.</a> NCHS Data Brief. 257, 1-8 (2016).</li><li>Rohaan, M. W., Wilgenhof, S., Haanen, J. B. A. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adoptive+cellular+therapies:+the+current+landscape.">Adoptive cellular therapies: the current landscape.</a> Virchows Archiv. 474 (4), 449-461 (2019).</li><li>Sadelain, M., Brentjens, R., Riviere, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+basic+principles+of+chimeric+antigen+receptor+design.">The basic principles of chimeric antigen receptor design.</a> Cancer Discovery. 3 (4), 388-398 (2013).</li><li>Maude, S. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tisagenlecleucel+in+children+and+young+adults+with+B-cell+lymphoblastic+leukemia.">Tisagenlecleucel in children and young adults with B-cell lymphoblastic leukemia.</a> The New England Journal of Medicine. 378 (5), 439-448 (2018).</li><li>Wagner, J., Wickman, E., DeRenzo, C., Gottschalk, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CAR+T+cell+therapy+for+solid+tumors:+Bright+future+or+dark+reality.">CAR T cell therapy for solid tumors: Bright future or dark reality.</a> Molecular Therapy. 28 (11), 2320-2339 (2020).</li><li>Vitanza, N. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Locoregional+infusion+of+HER2-specific+CAR+T+cells+in+children+and+young+adults+with+recurrent+or+refractory+CNS+tumors:+an+interim+analysis.">Locoregional infusion of HER2-specific CAR T cells in children and young adults with recurrent or refractory CNS tumors: an interim analysis.</a> Nature Medicine. 27 (9), 1544-1552 (2021).</li><li>Majzner, R. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=GD2-CAR+T+cell+therapy+for+H3K27M-mutated+diffuse+midline+gliomas.">GD2-CAR T cell therapy for H3K27M-mutated diffuse midline gliomas.</a> Nature. 603 (7903), 934-941 (2022).</li><li>Vitanza, N. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intraventricular+B7-H3+CAR+T+cells+for+diffuse+intrinsic+pontine+glioma:+preliminary+first-in-human+bioactivity+and+safety.">Intraventricular B7-H3 CAR T cells for diffuse intrinsic pontine glioma: preliminary first-in-human bioactivity and safety.</a> Cancer Discovery. 13 (1), 114-131 (2023).</li><li>Theruvath, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Locoregionally+administered+B7-H3-targeted+CAR+T+cells+for+treatment+of+atypical+teratoid/rhabdoid+tumors.">Locoregionally administered B7-H3-targeted CAR T cells for treatment of atypical teratoid/rhabdoid tumors.</a> Nature Medicine. 26 (5), 712-719 (2020).</li><li>Donovan, L. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Locoregional+delivery+of+CAR+T+cells+to+the+cerebrospinal+fluid+for+treatment+of+metastatic+medulloblastoma+and+ependymoma.">Locoregional delivery of CAR T cells to the cerebrospinal fluid for treatment of metastatic medulloblastoma and ependymoma.</a> Nature Medicine. 26 (5), 720-731 (2020).</li><li>Brown, C. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regression+of+glioblastoma+after+chimeric+antigen+receptor+T-Cell+therapy.">Regression of glioblastoma after chimeric antigen receptor T-Cell therapy.</a> The New England Journal of Medicine. 375 (26), 2561-2569 (2016).</li><li>Bourne, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intracerebral+microdialysis:+30+years+as+a+tool+for+the+neuroscientist.">Intracerebral microdialysis: 30 years as a tool for the neuroscientist.</a> Clinical and Experimental Pharmacology and Physiology. 30 (1-2), 16-24 (2003).</li><li>Zhou, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Automatically+detecting+bregma+and+lambda+points+in+rodent+skull+anatomy+images.">Automatically detecting bregma and lambda points in rodent skull anatomy images.</a> PLoS One. 15 (12), 0244378 (2020).</li><li>Foster, J. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+GPC2-directed+chimeric+antigen+receptors+using+mRNA+for+pediatric+brain+tumors.">Development of GPC2-directed chimeric antigen receptors using mRNA for pediatric brain tumors.</a> Journal for Immunotherapy of Cancer. 10 (9), 004450 (2022).</li><li>Akhavan, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=T+cells+for+brain+tumors:+Lessons+learned+and+road+ahead.">T cells for brain tumors: Lessons learned and road ahead.</a> Immunological Reviews. 290 (1), 60-84 (2019).</li></ol>

JBF har ett patent relaterat till glypikan 2 (GPC2)-riktade immunterapier. Alla andra författare har inget att avslöja.

CAR T-cellterapi har revolutionerat behandlingen av hematologiska cancerformer och visar lovande värde vid behandling av solida hjärntumörer 6,7,8. Detta protokoll utformades för att möjliggöra preklinisk utvärdering av lokoregional CAR T-cellleverans för behandling av CNS-tumörer hos barn. Kanylsystemet replikerar en Ommaya- eller Rickham-reservoar, ett intraventrikulärt katetersystem som för närvarande används i pågående kliniska prövningar av CAR T-cellterapi i pediatriska CNS-tumörer 6,7,8, vilket understryker relevansen och translationspotentialen hos dessa metoder. Detta system möjliggör upprepad leverans av CAR T-celler som kringgår blod-hjärnbarriären, återigen liknande metoder som används i pågående kliniska prövningar. Lokoregional leverans kan ge maximal effekt i CNS9 och kan också minska risken för systemisk toxicitet i samband med handel från cirkulation15. Medan stereotaktisk leverans kan ge en enda dos i CNS, är fördelen med detta system möjligheten att tillhandahålla flera upprepade doser till en viss plats i CNS utan behov av flera operationer. Begränsningarna i denna procedur inkluderar en fast leveransplats utan möjlighet att ändra plats eller göra justeringar när kanylen är på plats och risken för lossning av kanylen.
Ett kritiskt steg i detta protokoll är implantationen av den fasta styrkanylen vid en D/V-koordinat som tar hänsyn till projektionen av behandlingskanylerna. Behandlingskanylen kommer att skjuta ut utanför spetsen på styrkanylen, så försiktighet måste vidtas för att säkerställa att placeringen kommer att resultera i leverans av CAR T-celler till den intressanta regionen. Projektionslängder på behandlingskanylen kan anpassas, och enligt författarens erfarenhet är 0,5 mm en användbar projektionslängd. Denna längd säkerställer att terapin inte stannar kvar i guidekanylen vid dosering, men kräver inte heller någon betydande justering av D/V-koordinaterna för guidekanylen till det berörda området. Ett ytterligare viktigt steg i detta protokoll är den tid då behandlingskanylen lämnas på plats efter CAR T-cellsinfusion. Behandlingskanylen ska hållas på plats i minst 1 minut efter avslutad infusion för att förhindra läckage och förlust av lokoregional tillförsel av CAR T-cellterapi.
Felsökning av denna metod är enkel, med de flesta komplikationer som innebär svårigheter att ta bort dummykanylen eller sätta in behandlingskanylen i den fasta styrkanylen, troligen på grund av torkat blod på insidan av styrkanylen. Detta kan enkelt lösas genom att försiktigt föra dummykanylen genom styrkanylen tills det finns mindre motstånd och skräpet har rensats. Akrylhartset kan ibland lossna från skallen, vilket resulterar i förlust av kanylsystemet. Enligt vår erfarenhet begränsas detta i allmänhet genom att göra skallen med en skalpell och placeringen av två skruvar. Dessutom tas alla föremål från buren bort som av misstag kan applicera kraft på kanylen medan musen rör sig, till exempel särskilda musberikningshyddor med små öppningar.
Sammanfattningsvis beskrivs här ett protokoll för införande av ett kanylsystem i murina modeller av CNS-tumörer för upprepad leverans av CAR T-celler. Kanylplaceringen kan justeras till flera lokoregionala leveransplatser och testa effektiviteten hos olika leveransplatser. Dessutom kan detta system användas för ytterligare terapier utöver CAR T-celler för att utvärdera effekten när man kringgår blod-hjärnbarriären, och kan också vara användbart för utvärdering av terapier i murina modeller av icke-onkologiska störningar.

Trots förbättringar inom kemoterapi, strålbehandling och kirurgi är tumörer i centrala nervsystemet (CNS) den dödligaste maligniteten hos barn1, vilket understryker ett viktigt behov av nya tillvägagångssätt med mer framgångsrika resultat. Med betydande framsteg inom immunterapi har adoptiv cellterapi (ACT) -metoder visat lovande resultat i olika cancerformer, särskilt hematologiska maligniteter2. Chimär antigenreceptor (CAR) T-cellterapi, en specifik typ av ACT, utnyttjar immunsystemets naturliga förmåga att känna igen och döda skadliga celler genom att omdirigera T-cellernas specificitet för att generera tumörriktade T-celler3. CAR T-cellterapi har visat stor framgång vid behandling av leukemier och lymfom4, vilket gör det till ett lovande immunterapeutiskt tillvägagångssätt och uppmuntrar dess undersökning i solida tumörer. Men hittills har CAR T-cellterapi i solida tumörer uppnått liten klinisk framgång och står inför många utmaningar, såsom ineffektiv tumörpenetration, begränsade riktade antigener och den suppressiva tumörmikromiljön5.
Nya kliniska prövningar har börjat utvärdera CAR T-cellterapi för pediatriska CNS-tumörer, vilket ger bevis på koncept och tidiga bevis på T-cellaktivitet i preliminära rapporter 6,7,8. Medan de flesta initiala prekliniska data fokuserade på intravenös leverans av CAR T-cellerna, har de senaste prekliniska bevisen föreslagit överlägsenheten av lokoregional leverans i CNS 9,10, som också har använts framgångsrikt i flera kliniska prövningar6,7,8,11. Prekliniska studier hittills som har införlivat den lokoregionala leveransen av CAR T-celler i CNS har förlitat sig på en enda intrakraniell dos av CAR T-celler levererade stereotaktiskt 9,10. Kliniska prövningar på människa har dock krävt upprepade infusioner av CAR T-celler i CNS 6,7,8,11, vilket understryker behovet av att utvärdera flera upprepade infusioner i preklinisk utveckling. Målet med denna procedur är att framgångsrikt testa seriella CAR T-cellinfusioner med hjälp av en kateter i ortotopiska murina modeller av pediatriska hjärntumörer. Fördelen med denna teknik är att man undviker flera kirurgiska ingrepp för att ge upprepade intra-CNS-behandlingar. Kanyler har främst använts för mikrodialysprovtagning av neurotransmittorer och leverans av neuroaktiva substanser inom neurovetenskap och beteendeforskning på gnagare12, med begränsade rapporter om deras användning för leverans av läkemedel mot cancer. Baserat på tidigare rapporter använder detta protokoll ett stereotaktiskt placerat kvarliggande kanylsystem för att leverera CAR T-celler i xenograftmurina modeller av CNS-tumörer. Protokollet kan användas för att testa ytterligare terapier i murina modeller av neurologiska eller neuro-onkologiska störningar, och kan vara till hjälp för att testa nya terapier där förbikoppling av blod-hjärnbarriären är avgörande för effekten.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>18 G needles</td>
			<td>BD</td>
			<td>511097</td>
			<td>1 1/2 inch metal hub</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acrylic resin liquid</td>
			<td>Lang Dental&#160;</td>
			<td>B1323&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acrylic resin powder</td>
			<td>Lang Dental&#160;</td>
			<td>B1323&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alcohol wipes</td>
			<td>BD</td>
			<td>326895</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge 5240</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>5420000040</td>
			<td>Centrifuge&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cotton tipped swabs</td>
			<td>Puritan</td>
			<td>826-WC</td>
			<td>Handle Width = 2.11 mm (0.083), Head Width = 1.27 mm (0.050), Handle Length = 147.62 mm (5.812), Overall Length = 152.4 mm (6), Head Length = 12.7 mm (0.500)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Drill bit holder&#160;</td>
			<td>P1 Technologies&#160;</td>
			<td>DH-1&#160;</td>
			<td>Drill bit holder for D56-D70&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Drill bit&#160;</td>
			<td>P1 Technologies&#160;</td>
			<td>D58&#160;</td>
			<td>1.07 mm&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dummy cannula&#160;</td>
			<td>P1 Technologies&#160;</td>
			<td>C315DCS-5/SPC&#160;</td>
			<td>Configuration: Small cap; &#160;Length: Cut 5.00 mm below pedestal; Projection: 0.50 mm&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Flat tip screwdriver&#160;</td>
			<td>P1 Technologies&#160;</td>
			<td>SD-80&#160;</td>
			<td>Screwdriver&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Graefe forceps</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>11051-10</td>
			<td>Forceps</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Guide cannula&#160;</td>
			<td>P1 Technologies&#160;</td>
			<td>C315GS-5/SPC&#160;</td>
			<td>Configuration: 5.00 mm pedestal height; Length: Cut 5.00 mm below pedestal&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hemostatic cotton pellets with racemic epinephrine&#160;</td>
			<td>Pascal&#160;</td>
			<td>1151602&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MOXI Z Mini automated cell counter Kit&#160;</td>
			<td>Moxi</td>
			<td>MXZ001</td>
			<td>Cell counter</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NOD&#160;scid&#160;gamma (NSG) mice</td>
			<td>Jackson Laboratory</td>
			<td>5557</td>
			<td>6 to 12-week-old males and females</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pasteur pipet</td>
			<td>VWR</td>
			<td>14673-043</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PKG tubing&#160;</td>
			<td>P1 Technologies&#160;</td>
			<td>C313CT&#160;</td>
			<td>Diameter: 0.58 mm x 1.27 mm&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Porcelain 12 well plate</td>
			<td>Flinn Scientific</td>
			<td>AP6064&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Povidone iodine</td>
			<td>Medline</td>
			<td>MDS093943</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scalpel</td>
			<td>World Precision Instrument</td>
			<td>50-822-457</td>
			<td>Disposable Scalpel, no.10, sterile, 10/box, Plastic Handle with 6&#34; Ruler</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Screws&#160;</td>
			<td>P1 Technologies&#160;</td>
			<td>0-80 X 3/32&#160;</td>
			<td>2.4 mm&#160;&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stereotaxic Frame&#160;</td>
			<td>David Kopf Instruments&#160;</td>
			<td>940&#160;</td>
			<td>Model 940 Small Animal Stereotaxic Instrument with Digital Display Console&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Student fine scissors</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>91460-12</td>
			<td>Scissors</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Treatment cannula&#160;</td>
			<td>P1 Technologies&#160;</td>
			<td>C315IS-5/SPC&#160;</td>
			<td>33GA;&#160;Configuration: Standard internal; Length: Cut 5.00 mm below pedestal; Projection: 0.50 mm&#160;&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Treatment syringes&#160;</td>
			<td>Hamilton</td>
			<td>87908</td>
			<td>5 &#181;L, Model 75 Cemented Needle Special (SN) Syringe, 75SN/22/0.5&#34;/PT3&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vactrap XL&#160;</td>
			<td>Foxx Life Sciences</td>
			<td>305-4401-FLS</td>
			<td>Vacuum System</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

intracranial cannula implantation for serial locoregional chimeric antigen receptor (car) t cell infusions in mice

Pediatriska CNS-tumörer är ansvariga för majoriteten av cancerrelaterade dödsfall hos barn och har dåliga prognoser, trots framsteg inom kemoterapi och strålbehandling. Eftersom många tumörer saknar effektiva behandlingar finns det ett avgörande behov av att utveckla mer lovande terapeutiska alternativ, såsom immunterapier; användningen av chimär antigenreceptor (CAR) T-cellterapi riktad mot CNS-tumörer är av särskilt intresse. Cellytemål som B7-H3, IL13RA2 och disialoganglosid GD2 uttrycks starkt på ytan av flera pediatriska och vuxna CNS-tumörer, vilket ökar möjligheten att använda CAR T-cellterapi mot dessa och andra ytmål. För att utvärdera upprepad lokoregional leverans av CAR T-celler i prekliniska murina modeller etablerades ett kvarliggande katetersystem som rekapitulerar kvarliggande katetrar som för närvarande används i kliniska prövningar på människa. Till skillnad från stereotaktisk tillförsel möjliggör kvarliggande katetersystem upprepad dosering utan användning av flera operationer. Detta protokoll beskriver den intratumorala placeringen av en fast styrkanyl som har använts för att framgångsrikt testa seriella CAR T-cellinfusioner i ortotopiska murina modeller av pediatriska hjärntumörer. Efter ortotopisk injektion och engraftment av tumörcellerna i möss slutförs intratumoral placering av en fast styrkanyl på en stereotaktisk apparat och säkras med skruvar och akrylharts. Behandlingskanyler förs sedan in genom den fasta styrkanylen för upprepad CAR T-cellleverans. Stereotaktisk placering av styrkanylen kan justeras för att leverera CAR T-celler direkt in i sidoventrikeln eller andra platser i hjärnan. Denna plattform erbjuder en tillförlitlig mekanism för preklinisk testning av upprepade intrakraniella infusioner av CAR T-celler och andra nya terapier för dessa förödande pediatriska tumörer.

Framgångsrik kanylimplantation i musens CNS Möss med lyckad kanylering har en säker styrkanyl på plats, som inte stör dagliga aktiviteter (Figur 2A) och som lätt kan passera en behandlingskanyl och leverera vätska utan motstånd (Figur 2B). Enligt vår erfarenhet ligger majoriteten av kanylerna kvar i över 4 veckor, även om 0-25% kan lossna över tid. Verifiering av korrekt placering kan bekräftas med Evans blått färgämne injicerat i kanylen. Till exempel visar en kanyl införd i laterala ventrikeln Evans blått färgämne genom hela ventrikelsystemet när det färdas genom cerebral spinalvätska, vilket bekräftar korrekt placering (figur 2C). Kanyler införda i tumören visar Evans blått färgämne på platsen för tumörimplantation.
Effektiv leverans av CAR T-celler till CNS för behandling av xenografttumörer. Effekten av det intrakraniella kanylsystemet och den terapeutiska effekten av CAR T-celler i murina modeller kan mätas genom en mängd olika mekanismer, inklusive bioluminescerande avbildning och total överlevnad. GPC2-riktade CAR T-celler testades mot murint medulloblastom och diffust mittlinjegliommodeller, 7316-4509 respektive 7316-3058, med upprepad CAR T-celldosering via det angivna intrakraniella kanylsystemet14. Ortotopisk tumörplacering och gravering bekräftades genom bioluminescerande avbildning och kanyler placerades i tumörbädden med samma koordinater som den ortotopiska tumörplaceringen. Behandlingarna bestod av GPC2 CAR T-cellinfusioner en till två gånger i veckan i 2-4 veckor, totalt fyra till sex doser. Efter behandling inducerade GPC2-riktad CAR T-cellterapi signifikant tumörregression i medulloblastommodell 7316-4509 (p < 0,01) (figur 3A) och signifikant förlängd överlevnad i talamiskt diffust mittlinjegliom 7316-3058 (p < 0,05) (figur 3B)14.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64886/64886fig01.jpg"> Figur 1: Styrkanyl med projektionsdocka och behandlingskanyler. (A) Styrkanyl med 0,5 mm projektion och 2 mm projektionsdockkanyler på plats. (B) Styrkanyl med 0,5 mm projektion och 2 mm projektionsbehandlingskanyler på plats. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64886/64886fig01large.jpg" target="_blank">Klicka här för att se en större version av denna figur.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64886/64886fig02.jpg"> Figur 2: System för tillförsel av behandlingskanyl för upprepade doser av CAR T-celler . (A) Kanyl implanterad i en musskalle med ett lock på plats när den inte används. (B) Infusion av CAR T-celler i en pontintumör via behandlingskanylen medan musen är anestesi. (C) Verifiering av kanylens placering i sidoventrikeln med Evans blått färgämne. Färgämne infördes genom kanylen, följt av eutanasi och hjärnexcision, med färgämne närvarande i hela ventriklerna. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64886/64886fig02large.jpg" target="_blank">Klicka här för att se en större version av denna figur.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64886/64886fig03.jpg"> Figur 3: GPC2-riktade CAR T-celler förmedlar antitumörsvar och förlänger överlevnaden i pediatriska hjärntumörer in vivo. (A) Kvantifiering av bioluminiscens av ortotopisk grupp 4 medulloblastom xenograft 7316-4509 behandlad med antingen GPC2- eller CD19-riktade mRNA CAR T-celler. Doserna indikeras med pilar i diagrammet. Data visas som medelvärde med SD, n = 9-11 möss per arm. (B) Total överlevnad för möss implanterade med talamus DMG xenograft 7316-3058 behandlade med sex upprepade doser av 2 x 106 CAR T-celler. Doserna indikeras med pilar i diagrammet. n = 7 möss per arm. **p < 0,01; *p < 0,05; ns = inte signifikant. Denna siffra har reproducerats med tillstånd från Foster et al.14. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64886/64886fig03large.jpg" target="_blank">Klicka här för att se en större version av denna figur.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Intracranial Cannula Implantation for Serial Locoregional Chimeric Antigen Receptor CAR T Cell Infusions in Mice at JoVE.com

Intracranial Cannula Implantation for Serial Locoregional Chimeric Antigen Receptor CAR T Cell Infusions in Mice

Tumörer i centrala nervsystemet (CNS) är den främsta orsaken till cancerrelaterad död hos barn, och lokoregionala immunbaserade terapier testas alltmer för patienter i kliniska prövningar. Detta protokoll beskriver metoder för lokoregional kanylimplantation hos möss för preklinisk utvärdering av immunterapeutiska infusioner riktade mot CNS-tumörer.

Intrakraniell kanylimplantation för seriella lokoregionala chimära antigenreceptor (CAR) T-cellinfusioner hos möss

Pediatric CNS tumors are responsible for the majority of cancer-related deaths in children and have poor prognoses, despite advancements in chemotherapy ...

Detta protokoll replikerar ett intraventrikulärt katetersystem som används i pågående kliniska prövningar för att testa lokal regional leverans av CAR T-cellterapi riktad mot tumörer i centrala nervsystemet. Den största fördelen med denna teknik är förmågan att tillhandahålla flera upprepade doser av lokal regional CAR T-cellterapi utan att utföra flera invasiva kirurgiska ingrepp. Detta system kan användas för att undersöka olika terapier på olika leveransställen och kan därmed ge insikt i en myriad av forskningsområden inom neurovetenskap.För att börja, placera den bedövade musen med rakat huvud på operationsbordet och öppna försiktigt botten av den stereotaktiska armen med en spatel. Sätt i kanylen med pincett och säkra den genom att dra åt skruven på armen tills hälften till två tredjedelar av den vita plastdelen och fem millimeter av kanylen sticker ut från öppningens botten. Sätt i och säkra musens övre tänder i bitstången på den stereotaktiska apparaten.Dra noskonen framåt och dra åt den, se till att musen andas in isofluran. Montera sedan musen på den uppvärmda stereotaxiska apparaten med öronmanschetter eller öronstänger och undvik alltför stort tryck. Desinficera operationsområdet och gör ett snitt parallellt med skallen enligt beskrivningen i manuskriptet.Använd bomullspinnar för att skjuta bort fascian. Identifiera landmärken, bregma och lambda på skallen som motsvarar främre och bakre märken där kranialplattorna möts. För att skapa en yta för att fästa akryl, gör försiktigt flera slitsar över skallen med en skalpell.Använd den stereotaxiska armen och lokalisera kanylen till landmärket av intresse. Lyft kanylspetsen en till två millimeter ovanför skallytan och flytta till önskade koordinater. Använd en 18 gauge nål eller kirurgisk borr, gör två skruvhål på den exponerade skallen bort från där kanylen kommer in, vilket säkerställer tillräckligt med utrymme för kanylen.Vrid borren genom skruvhålet tills den fäster vid skallen. Sätt in och fäst två skruvar i hålen med en platt skruvmejsel. Dra sedan försiktigt upp skruven för att säkerställa att den är säkrad.För att sätta in en kanyl, skapa ett hål i skallen vid de identifierade koordinaterna med hjälp av en 18 gauge nål eller kirurgisk borr. Använd den stereotaktiska armen och sänk kanylen till önskad DV-koordinat. Vid cirka 0,3 gram akrylhartspulver och 10 till 15 droppar vätska i en porslin 12-brunnsplatta, ladda det beredda viskösa vitfärgade materialet i en en milliliter spruta.Belägg skallen och fyll utrymmena runt kanylen och skruven. Lossa skruven på den stereotaktiska armen medan cementet är flexibelt. Använd försiktigt en spatel för att frigöra kanylen från hållaren i den nedre öppningen och dra tillbaka den stereotaktiska armen från musen.När cementet har torkat, sätt in dockkanylen i styrkanylen och vrid medurs för att säkra den ordentligt. När proceduren är klar, sätt tillbaka musen till sin uppvärmda hembur för återhämtning. För att förbereda behandlingskanylen, sätt in toppen i PKG-slangen.Fyll sedan behandlingssprutan med CAR T-cellssuspension och för in den genom den andra änden av PKG-röret, som täcker toppen av behandlingskanylen. Efter bedövning av musen, fixa styrkanylen vid basen med pincett. Skruva loss och ta bort dockkanylen, så att du kommer åt styrkanylen.Infusera CAR T-cellerna i en minut och håll behandlingskanylen på plats i ytterligare en minut. Efter avlägsnande av behandlingskanylen, skruva tillbaka en dummykanyl ordentligt. Administrera sedan meloxikam subkutant för smärtkontroll.Den GPC2-riktade CAR T-cellterapin inducerade signifikant tumörregression i medulloblastom och signifikant förlängd överlevnad i den talamiska diffusa mittlinjegliommodellen. När du sätter in styrkanylen på en intratumoral plats är det viktigt att förstå att dorsal-ventrala koordinater kan vara mer ytliga än tumörinjektion för att ta hänsyn till dummy- och behandlingskanylprojektionslängderna.

Research

JoVE Journal

Cancer Research

Intracranial Cannula Implantation for Serial Locoregional Chimeric Antigen Receptor (CAR) T Cell Infusions in Mice

A Syngeneic Mouse B-Cell Lymphoma Model for Pre-Clinical Evaluation of CD19 CAR T Cells

Syngena mus B-cells lymfom modell för preklinisk utvärdering av CD19 CAR T-celler

The astonishing clinical success of CD19 chimeric antigen receptor (CAR) T-cell therapy has led to the approval of two second generation chimeric antigen ...

A Spheroid Killing Assay by CAR T Cells

En sfäroid dödande analys av CAR T-celler

Immunotherapy has become a field of growing interest in the fight against cancer otherwise untreatable. Among all immunotherapeutic methods, chimeric ...

In Vitro Tumor Cell Rechallenge For Predictive Evaluation of Chimeric Antigen Receptor T Cell Antitumor Function

I Vitro tumör Cell återinsättning för förutsägande utvärdering av chimära Antigen receptorn T Cell antitumöreffekt funktion

The field of chimeric antigen receptor (CAR) T cell therapy is rapidly advancing with improvements in CAR design, gene-engineering approaches and ...

Using CRISPR/Cas9 to Knock Out GM-CSF in CAR-T Cells

Använda CRISPR/Cas9 för att slå ut GM-CSF i CAR-T-celler

Chimeric antigen receptor T (CAR-T) cell therapy is a cutting edge and potentially revolutionary new treatment option for cancer. However, there are ...

Manufacturing Chimeric Antigen Receptor (CAR) T Cells for Adoptive Immunotherapy

Manufacturing Chimeric Antigen Receptor CAR T Cells for Adoptive Immunotherapy

Tillverkning chimeric antigen receptor (bil) T celler för adoptiv immunterapi

Adoptive immunotherapy holds promise for the treatment of cancer and infectious disease. We describe a simple approach to transduce primary human T cells ...

Using Human Induced Pluripotent Stem Cells for the Generation of Tumor Antigen-specific T Cells

Använda humana inducerade pluripotenta stamceller för generering av tumör antigen-specifika T-celler

The generation and expansion of functional T cells in vitro can lead to a broad range of clinical applications. One such use is for the treatment of ...

Ultrasound-Guided Orthotopic Implantation of Murine Pancreatic Ductal Adenocarcinoma

Ultraljud-guidad ortotopisk implantation av murin Pancreatic ductal adenocarcinom

The recent success of immune checkpoint blockade in melanoma and lung adenocarcinoma has galvanized the field of immuno-oncology as well as revealed the ...

Robot Assisted Distal Pancreatectomy with Celiac Axis Resection (DP-CAR) for Pancreatic Cancer: Surgical Planning and Technique

Robot Assisted Distal Pancreatectomy with Celiac Axis Resection DP-CAR for Pancreatic Cancer: Surgical Planning and Technique

Robot assisterad distal bukspottkörtelektomi med celiac axel samband (DP-CAR) för bukspottskörtelcancer: Kirurgisk planering och teknik

Malignant pancreatic tumors involving the celiac artery can be resected with a distal pancreatectomy, splenectomy and celiac axis resection (DP-CAR), ...

Dynamic Imaging of Chimeric Antigen Receptor T Cells with [18F]Tetrafluoroborate Positron Emission Tomography/Computed Tomography

Dynamic Imaging of Chimeric Antigen Receptor T Cells with [18F]Tetrafluoroborate Positron Emission Tomography/Computed Tomography

Dynamisk avbildning av chimeriska antigenreceptor T-celler med [18F]Tetrafluorborate Positron Emission Tomography/Computed Tomography

T cells genetically engineered to express chimeric antigen receptors (CAR) have shown unprecedented results in pivotal clinical trials for patients with B ...

Natural Killer (NK) and CAR-NK Cell Expansion Method using Membrane Bound-IL-21-Modified B Cell Line

Natural Killer NK and CAR-NK Cell Expansion Method using Membrane Bound-IL-21-Modified B Cell Line

Natural Killer (NK) och CAR-NK cellexpansionsmetod med membranbunden IL-21-modifierad B-cellinje

Chimeric antigen receptor (CAR)-modified immune cell therapy has become an emerging treatment for cancers and infectious diseases. NK-based immunotherapy, ...