1.3K Views
•
10:08 min
•
June 16th, 2023
DOI :
June 16th, 2023
•0:05
Introduction
0:50
Light-Induced Dielectrophoresis (LiDEP) Chip Device Fabrication
3:05
Dielectrophoresis (DEP) Buffer Preparation
3:55
Cell Preparation
4:40
Light-Induced Dielectrophoresis (LiDEP) Characterization
7:41
Results: Dielectrophoresis Responses in hMSCs
9:28
Conclusion
Transcript
Denne lysinducerede dielektroforeseprotokol eller LiDEP giver en trinvis metode til karakterisering af humane mesenkymale stamceller. Denne metode kan hjælpe med at give svar om heterogeniteten af stamcelleprøver. Fordelen ved LiDEP er evnen til at foretage ændringer i realtid i den virtuelle elektrodekonfiguration som reaktion på stamcelleheterogenitet, hvilket ikke er muligt for traditionelle DEP-metoder.
En ny bruger af denne teknik kan kæmpe med at kondensere projektorens lys nok på den mikrofluidiske enhed til at fremstille den virtuelle elektrode. Vi vil råde til at omkonfigurere opsætningen, indtil den fungerer. Zuri Rashad, en kandidatstuderende fra mit laboratorium, hjælper med at demonstrere proceduren.
Til at begynde med skal du forberede mikrokanalen ved at stanse huller med en diameter på fire millimeter på et dobbeltsidet tape cirka fem til seks millimeter fra kanten af den kortere dimension og centreret mellem båndets længere sider. Brug en skalpel til at skære to lige linjer tre millimeter fra hinanden på tværs af hullerne, så beskyttelsespladerne på begge sider af båndet er på under hele mikrokanalskæringen. Marker hele stedet med en vaskbar markør, der sikrer, at de borede huller flugter med hullerne i den dobbeltklæbende tape.
Disse to huller vil blive brugt som indløbs- og udløbshuller i den mikrofluidiske enhed. Bor to huller med en diameter på tre millimeter i det øverste ITO-glasglas. Derefter placeres båndets lange kant på toppen af det borede ITO-belagte glas, der flugter med glassets lange kant.
Fjern den ene side af beskyttelsesfilmen på den dobbeltklæbende tape. Juster hullerne på båndet i det øverste ITO-glasglas, og tryk dem forsigtigt sammen og fjern luftlommer, især nær mikrokanalen. Fjern den anden beskyttelsesfilm fra den dobbeltklæbende tape.
Tryk på molybdæn og amorf siliciumbelagt ITO-glasglas, der matcher kanten af det fotoledende dias modsat den to millimeter frigangsside med kanten af det dobbeltsidede bånd mod midten af det øverste ITO-glasglas. På denne måde eksisterer der tømmermænd mellem ITO og det fotoledende ITO-dias. Tryk på en plan overflade for at sikre god vedhæftning og afskær overskydende tape på siderne.
For at forbinde funktionsgeneratoren skal du anvende kobbertape på kanterne af ITO-glaslaget og fotoledende belagt ITO-glaslag. Sæt tapen på siden af ITO eller fotoledende materiale fra kanten af den dobbeltsidede tape til cirka tre centimeter på den ubelagte side af glassubstratet. For at sikre en vellykket enhedsfremstilling skal du bruge en højdemåler til at teste modstandsaflæsningen mellem de belagte dias på begge glasunderlag og kobberbåndet, der var fastgjort til glasset.
Tilsæt 25 ml ultrarent vand til et 50 ml konisk rør indeholdende 4,25 gram saccharose og 0,15 gram glucose. Bland godt, indtil halvdelen af saccharose og glucose opløses og fyldes op med ultrarent vand op til 50 ml-mærket. Bland derefter kraftigt denne DEP-buffer, indtil den er helt opløst.
20 ml af den tilberedte saccharose- og glucoseopløsning anbringes i et 50 ml konisk rør. Tilsæt 0,1 gram bovin serumalbumin, BSA, i røret. Vortex godt, indtil al BSA opløses for at få en endelig koncentration på 0,5% BSA i DEP-bufferen.
Placer en gange 10 til de seks humane mesenkymale stamceller eller HMSC'er eller human embryonal nyre, HEK293 suspenderet i en milliliter vækstmedium i et 10 ml centrifugerør. Centrifuge, HEK293-cellerne ved 201 G i fem minutter og HMSC'erne ved 290 G i 10 minutter. Efter centrifugering aspireres supernatanten.
01 Og resuspender forsigtigt cellerne i en milliliter DEP-bufferopløsning med 0,5 % BSA. Gentag centrifugeringen to gange mere, og resuspender cellerne i DEP-bufferen med 0,5 % BSA. Forbered de eksperimentelle opsætningselementer såsom en bærbar computer, projektor, objektivlinse, digitalt mikroskop og en funktionsgenerator til kvantificering af de cellulære reaktioner på LiDEP.
Placer 10x objektivet, LiDEP-chippen og holderen oven på projektorobjektivet. Brug den bærbare computer til at designe lysprojektioner som stjerne, diamant, tre linjer og oval, og tilslut den bærbare computer til projektoren. Tilslut LiDEP-chippen til funktionsgeneratoren for at anvende det elektriske vekselstrømsfelt.
For at observere cellerne, der oplever LiDEP-kraften, skal du bruge et digitalt mikroskop til billeddannelse af NVIDIA-optagelse. Efter afslutningen af opsætningen skylles mikrokanalen med 70% ethanol, og derefter skylles 0,5% BSA-opløsning for at fjerne ethanolen i tidligere celler. Gentag skylningen tre gange for at sikre fuldstændig vask, da tidligere eksponerede celler for DEP-feltet reagerer anderledes end friske celler og kan forstyrre dataindsamlingen.
Fjern 0,5 %BSA-opløsningen med en pipette. Indstil derefter funktionsgeneratoren til den ønskede spænding og frekvens. Tilsæt forsigtigt 70 mikroliter af den tilberedte cellesuspension i enhedens mikrokanal ved hjælp af en mindre pipettespids, vip den let i hullet mod mikrokanalen for at undgå spild på grund af mikrokanalens tyndhed.
Tør adgangsløsningen væk med engangspapirservietter, og kassér dem i biofarligt affald. Projicer derefter de ønskede virtuelle elektrogeometricirkler, diamanter, stjerner eller parallelle linjer på LiDEP-chippen. I den digitale mikroskopsoftware skal du indstille videolængden til tre minutter.
Indstil en laboratorietimer til to minutter og 30 sekunder. Når cellerne er stationære i LiDEP-chippens mikrokanal, skal du trykke på start i den digitale mikroskopsoftware for at starte videooptagelsesprocessen. Efter 10 sekunder skal du trykke på tænd-knappen på funktionsgeneratorkanaludgangen for at anvende det elektriske vekselstrømsfelt og trykke på start for timeren.
Overvåg cellens DEP-adfærd gennem det digitale mikroskop, og undgå rystelser eller bevægelse omkring opsætningen. Når timeren slukker, skal du trykke på tænd-knappen på funktionsgeneratorkanaludgangen, der slukker kanaludgangen, og det elektriske vekselstrømsfelt forsynes ikke længere gennem elektroderne. Stop videooptagelsen efter tre minutter, og gem den til fremtidig analyse.
Pipette cellerne ud af udløbsenden af LiDEP-chippen ved langsomt at skubbe 60 mikroliter DEP-buffer med 0,5% BSA ind i mikrokanalen og samtidig opsamle udløbet. Fortsæt, indtil der er få eller ingen celler i mikrokanalen, og gentag DEP med alle frekvenser som vist. DEP-svarene med hensyn til hastighed for HMSC'erne og deres levedygtighedsprocent blev bestemt.
Målingerne af de positive DEP-responser ved fem, 10, amd 20 spændingstop til top eller VPP viste, at cellerne bevægede sig med en gennemsnitlig hastighed på henholdsvis 0,025, 0,036 og 0,051 mikrometer pr. Sekund. HMSC'ernes levedygtighedsresultater efter at have oplevet DEP-kraften viste, at de højere spændinger generelt resulterede i lavere cellelevedygtighed med 57% af cellerne levedygtige ved 20 VPP. Hvide, gule, røde og blå farvede elektroder blev valgt til denne undersøgelse, men belysningen gennem LiDEP-dybdechippen blev påvirket af det fotoledende lag, som havde en rød orange farve.
Derfor syntes den projicerede hvide elektrode gul med et hvidt indre, den røde elektrode syntes orange med en rød kontur, og den blå elektrode syntes lysegrøn. Dette fænomen tyder på, at gul og hvid havde det stærkeste DEP-felt, mens blå og rød var svagere. DEP-responserne fra HMC'er blev målt med LiDEP i tre dybdeanalysatorer ved 10 VPP.
Med LiDEP var der et henfald i det positive DEP-respons fra 30 kilohertz til 20 megahertz. Fra de tre analysatorer steg cellerne i den positive DEP fra 37 til 255 kilohertz og faldt i positiv DEP fra 1.772 kilohertz til 20 megahertz. To vigtige komponenter i denne metode er en stærk lyskilde og en solid elektrisk forbindelse for at sikre produktionen af det elektriske felt og cellemanipulation.
Vi observerede cellespinding som reaktion på virtuelle elektroder. Således er elektrorotation en anden celleanalysemetode, der kan udføres. Elektrorotation ville give information om HMSCs heterogenitet og sjældne subpopulationer.
Her præsenterer vi lysinduceret dielektroforese som en etiketfri tilgang til karakterisering af heterogene cellelinjer, specifikt humane mesenkymale stamceller (hMSC'er). Dette papir beskriver en protokol til brug og optimering af en mikrofluidisk enhed med et fotoledende lag til at karakterisere hMSC'ers elektriske opførsel uden at ændre deres oprindelige tilstand.
ABOUT JoVE
Copyright © 2024 MyJoVE Corporation. All rights reserved