この光誘起誘電泳動プロトコルまたはLiDEPは、ヒト間葉系幹細胞の特性評価のための段階的な方法を提供します。この方法は、幹細胞サンプルの不均一性に関する答えを提供するのに役立ちます。LiDEPの利点は、従来のDEP法では不可能な幹細胞の不均一性に応じて、仮想電極構成をリアルタイムで変更できることです。
この技術の新しいユーザーは、仮想電極を作成するのに十分なほどマイクロ流体デバイスにプロジェクターの光を集光するのに苦労するかもしれません。それが機能するまでセットアップを再構成することをお勧めします。手順のデモンストレーションを手伝うのは、私の研究室の大学院生であるズリ・ラシャドです。
まず、短辺の端から約5〜6ミリメートル、テープの長辺の間を中心とする両面テープに直径4ミリメートルの穴を開けて、マイクロチャネルを準備します。メスを使用して、穴を横切って3ミリメートル離れた2本の直線を切り取り、マイクロチャネル切断全体でテープの両面の保護シートがオンになるようにします。洗えるマーカーで場所全体をマークし、ドリルで開けられた穴が両面テープに打ち込まれた穴と揃うようにします。
これらの2つの穴は、マイクロ流体デバイスの入口および出口の穴として使用されます。上部のITOスライドガラスに直径3ミリメートルの穴を2つ開けます。次に、ドリルで開けたITOコーティングされたガラスの上部に、テープの長辺をガラスの長辺に揃えて配置します。
両面テープの保護フィルムの片面をはがします。上部のITOスライドのテープの穴を合わせ、それらをそっと押し合わせて、特にマイクロチャネル近くのエアポケットを取り除きます。もう一方の保護フィルムを両面テープからはがします。
モリブデンとアモルファスシリコンでコーティングされたITOガラススライドを、2ミリメートルのクリアランス側の反対側の光伝導スライドの端と、両面テープの端を上部のITOスライドの中央に向けて押します。このように、ITOと光伝導性ITOスライドの間に二日酔いが存在します。平らな面を押して接着性を確保し、側面の余分なテープを切り取ります。
ファンクションジェネレータを接続するには、ITOガラス層と光伝導コートITOガラス層の端に銅テープを貼ります。ITOまたは光導電材料の側面のテープを両面テープの端からガラス基板のコーティングされていない側に約3センチメートル巻きます。デバイスの製造を成功させるには、高度計を使用して、両方のガラス基板のコーティングされたスライドとガラスに取り付けられた銅テープの間の抵抗の読み取り値をテストします。
4.25グラムのスクロースと0.15グラムのグルコースを含む50ミリリットルの円錐管に25ミリリットルの超純水を加えます。ショ糖とブドウ糖の半分が溶けるまでよく混ぜ、50ミリリットルマークまでの超純水で補います。次に、このDEPバッファーを完全に溶解するまで激しく混合します。
調製したスクロースおよびグルコース溶液20ミリリットルを50ミリリットルの円錐管に入れる。0.1グラムのウシ血清アルブミンBSAをチューブに加えます。すべてのBSAが溶解するまでよくボルテックスし、DEPバッファーに0.5%BSAの最終濃度を取得します。
6個のヒト間葉系幹細胞またはHMSCsまたはヒト胚性腎臓に10回置き、HEK293を1ミリリットルの増殖培地に懸濁して10ミリリットルの遠沈管に入れる。遠心分離機、HEK293細胞を201Gで5分間、HMSCを290Gで10分間。遠心分離後、上清を吸引する。
01 細胞を0.5%BSAを含む1ミリリットルのDEP緩衝液に静かに再懸濁した。遠心分離をさらに2回繰り返し、細胞を0.5%BSAのDEPバッファーに再懸濁します。ラップトップ、プロジェクター、対物レンズ、デジタル顕微鏡、LiDEPに対する細胞応答を定量化するための関数発生器などの実験セットアップアイテムを準備します。
10倍対物レンズ、LiDEPチップ、ホルダーをプロジェクターレンズの上に配置します。ラップトップを使用して、星、ダイヤモンド、3本の線、楕円形などの光の投影を設計し、ラップトップをプロジェクターに接続します。LiDEPチップを関数発生器に接続して交流電界を印加します。
LiDEPの力を受けている細胞を観察するには、デジタル顕微鏡を使用してNVIDIA記録をイメージングします。セットアップが完了したら、マイクロチャネルを70%エタノールでフラッシュし、次にフラッシュした0.5%BSA溶液をフラッシュして、前の細胞のエタノールを除去します。以前にDEPフィールドに曝露された細胞は新しい細胞とは異なる反応を示し、データ収集を中断する可能性があるため、フラッシュを3回繰り返して完全に洗い流します。
ピペットで0.5%BSA溶液を取り除きます。次に、関数発生器を目的の電圧と周波数に設定します。より小さなピペットチップを使用して、調製した細胞懸濁液70マイクロリットルをデバイスのマイクロチャネルに注意深く追加し、マイクロチャネルの薄さによるこぼれを避けるために、穴内でマイクロチャネルに向かってわずかに傾けます。
使い捨ての紙拭きでアクセスソリューションを拭き取り、バイオハザード廃棄物に捨てます。次に、目的の仮想電気ジオメトリの円、ダイヤモンド、星、または平行線をLiDEPチップに投影します。デジタル顕微鏡ソフトウェアで、ビデオの長さを3分に設定します。
ラボ タイマーを 2 分 30 秒に設定します。セルがLiDEPチップのマイクロチャネルに静止したら、デジタル顕微鏡ソフトウェアでstartを押して、ビデオ録画プロセスを開始します。10秒後、ファンクションジェネレータチャンネル出力のOnボタンを押して交流電界を印加し、タイマーのスタートを押します。
デジタル顕微鏡でセルのDEP動作を監視し、セットアップ周辺の揺れや動きを防ぎます。タイマーが鳴ったら、ファンクションジェネレータのチャンネル出力のOnボタンを押すと、チャンネル出力がオフになり、電極から交流電界が供給されなくなります。3分後にビデオ録画を停止し、将来の分析のために保存します。
0.5%BSAを含む60マイクロリットルのDEPバッファーをマイクロチャネルにゆっくりと押し込み、同時に出口を回収することにより、LiDEPチップの出口端から細胞をピペットで取り出します。マイクロチャネルにセルがほとんどまたはまったくなくなるまで続け、示されているようにすべての周波数でDEPを繰り返します。HMSCの速度とその生存率に関するDEP応答が決定されました。
5、10、amd 20の電圧ピークtoピークまたはVPPでの正のDEP応答の測定は、細胞がそれぞれ毎秒0.025、0.036、および0.051マイクロメートルの平均速度で移動したことを示しました。DEP力を経験した後のHMSCの生存率の所見は、より高い電圧が一般的に細胞生存率の低下をもたらし、細胞の57%が20VPPで生存可能であることを示しました。この研究では、白、黄、赤、青の色の電極が選択されましたが、LiDEP深度チップを介した照明は、赤オレンジ色の光導電層の影響を受けました。
したがって、投影された白い電極は黄色と白い内部、赤い電極は赤い輪郭を持つオレンジ色に見え、青い電極は薄緑色に見えました。この現象は、黄色と白が最も強いDEPフィールドを持ち、青と赤が弱いことを示唆しています。HMCのDEP応答は、10VPPで3つの深度アナライザーでLiDEPで測定されました。
LiDEPでは、正のDEP応答が30キロヘルツから20メガヘルツに減衰しました。3つの分析装置から、細胞は陽性DEPで37キロヘルツから255キロヘルツに増加し、陽性DEPで1,772キロヘルツから20メガヘルツに減少した。この方法の2つの重要な要素は、強力な光源と、電界の生成とセル操作を確実にするための固体電気接続です。
仮想電極に応答してセルが回転するのを観察しました。このように、エレクトロローテーションは、行うことができる別のセル解析方法である。エレクトロローテーションは、HMSCの不均一性とまれな亜集団に関する情報を提供します。
