Name: isolation and transcriptome analysis of plant cell types
Uploaded: 2023-04-07T12:40:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Isolation and Transcriptome Analysis of Plant Cell Types at JoVE.com

أنشأنا هذا البروتوكول في منشأة متعددة الخلايا أحادية الخلية تابعة لكلية الزراعة والبيولوجيا ، جامعة شنغهاي جياو تونغ ، وتم دعمنا من قبل المؤسسة الوطنية للعلوم الطبيعية في الصين (المنحة رقم 32070608) ، وبرنامج شنغهاي بوجيانغ (المنحة رقم 20PJ1405800) ، وجامعة شنغهاي جياو تونغ (رقم المنحة Agri-X20200202 ، 2019TPB05).

تم تحسين البروتوكول التالي لبذور A. thaliana من النوع البري (WT) بدون خطوط مضان وعلامات فلورية لأنواع الخلايا الجذرية التالية: خلايا pericycle قطب نسيج الخشب (J0121) ، والخلايا الأولية للجذر الجانبي ، وخلايا غطاء الجذر الجانبي (J3411) ، وخلايا الأدمة الداخلية والقشرة (J0571) (الشكل 1A). تم ?...

<ol>
	<li>Zhang, T. -. Q., Chen, Y., Liu, Y., Lin, W. -. H., Wang, J. -. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-cell+transcriptome+atlas+and+chromatin+accessibility+landscape+reveal+differentiation+trajectories+in+the+rice+root.">Single-cell transcriptome atlas and chromatin accessibility landscape reveal differentiation trajectories in the rice root.</a> Nature Communications. 12 (1), 2053 (2021).</li><li>Denyer, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spatiotemporal+developmental+trajectories+in+the+Arabidopsis+root+revealed+using+high-throughput+single-cell+RNA+sequencing.">Spatiotemporal developmental trajectories in the Arabidopsis root revealed using high-throughput single-cell RNA sequencing.</a> Developmental Cell. 48 (6), 840-852 (2019).</li><li>Liu, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transcriptional+landscape+of+rice+roots+at+the+single-cell+resolution.">Transcriptional landscape of rice roots at the single-cell resolution.</a> Molecular Plant. 14 (3), 384-394 (2021).</li><li>Liu, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Global+dynamic+molecular+profiling+of+stomatal+lineage+cell+development+by+single-cell+RNA+sequencing.">Global dynamic molecular profiling of stomatal lineage cell development by single-cell RNA sequencing.</a> Molecular Plant. 13 (8), 1178-1193 (2020).</li><li>Shahan, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+single-cell+Arabidopsis+root+atlas+reveals+developmental+trajectories+in+wild-type+and+cell+identity+mutants.">A single-cell Arabidopsis root atlas reveals developmental trajectories in wild-type and cell identity mutants.</a> Developmental Cell. 57 (4), 543-560 (2022).</li><li>Wendrich, J. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Vascular+transcription+factors+guide+plant+epidermal+responses+to+limiting+phosphate+conditions.">Vascular transcription factors guide plant epidermal responses to limiting phosphate conditions.</a> Science. 370 (6518), (2020).</li><li>Carter, A. D., Bonyadi, R., Gifford, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+use+of+fluorescence-activated+cell+sorting+in+studying+plant+development+and+environmental+responses.">The use of fluorescence-activated cell sorting in studying plant development and environmental responses.</a> The International Journal of Developmental Biology. 57 (6-8), 545-552 (2013).</li><li>Picelli, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Full-length+RNA-seq+from+single+cells+using+Smart-seq2.">Full-length RNA-seq from single cells using Smart-seq2.</a> Nature Protocols. 9 (1), 171-181 (2014).</li><li>Wang, X., He, Y., Zhang, Q., Ren, X., Zhang, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Direct+comparative+analyses+of+10X+genomics+chromium+and+Smart-seq2.">Direct comparative analyses of 10X genomics chromium and Smart-seq2.</a> Genomics Proteomics Bioinformatics. 19 (2), 253-266 (2021).</li><li>Serrano-Ron, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reconstruction+of+lateral+root+formation+through+single-cell+RNAsequencing+reveals+order+of+tissue+initiation.">Reconstruction of lateral root formation through single-cell RNAsequencing reveals order of tissue initiation.</a> Molecular Plant. 14 (8), 1362-1378 (2021).</li><li>Hashimshony, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CEL-Seq2:+Sensitive+highly-multiplexed+single-cell+RNA-Seq.">CEL-Seq2: Sensitive highly-multiplexed single-cell RNA-Seq.</a> Genome Biology. 17, 77 (2016).</li><li>Macaulay, I. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=G&amp;T-seq:+Parallel+sequencing+of+single-cell+genomes+and+transcriptomes.">G&amp;T-seq: Parallel sequencing of single-cell genomes and transcriptomes.</a> Nature Methods. 12 (6), 519-522 (2015).</li><li>Angermueller, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Parallel+single-cell+sequencing+links+transcriptional+and+epigenetic+heterogeneity.">Parallel single-cell sequencing links transcriptional and epigenetic heterogeneity.</a> Nature Methods. 13 (3), 229-232 (2016).</li><li>De Rybel, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+aux/IAA28+signaling+cascade+activates+GATA23-dependent+specification+of+lateral+root+founder+cell+identity.">A novel aux/IAA28 signaling cascade activates GATA23-dependent specification of lateral root founder cell identity.</a> Current Biology. 20 (19), 1697-1706 (2010).</li><li>Duncombe, S. G., Barnes, W. J., Anderson, C. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+the+delivery+and+behavior+of+cellulose+synthases+in+Arabidopsis+thaliana+using+confocal+microscopy.">Imaging the delivery and behavior of cellulose synthases in Arabidopsis thaliana using confocal microscopy.</a> Methods in Cell Biology. 160, 201-213 (2020).</li><li>Levy, S. E., Myers, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Advancements+in+next-generation+sequencing.">Advancements in next-generation sequencing.</a> Annual Review of Genomics and Human Genetics. 17 (1), 95-115 (2016).</li><li>Ooi, C. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-throughput+full-length+single-cell+mRNA-seq+of+rare+cells.">High-throughput full-length single-cell mRNA-seq of rare cells.</a> PLoS One. 12 (11), e0188510 (2017).</li><li>Pertea, M., Kim, D., Pertea, G. M., Leek, J. T., Salzberg, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transcript-level+expression+analysis+of+RNA-seq+experiments+with+HISAT,+StringTie+and+Ballgown.">Transcript-level expression analysis of RNA-seq experiments with HISAT, StringTie and Ballgown.</a> Nature Protocols. 11 (9), 1650-1667 (2016).</li><li>Tsyganov, K., Perry, A., Archer, S., Powell, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RNAsik:+A+Pipeline+for+complete+and+reproducible+RNA-seq+analysis+that+runs+anywhere+with+speed+and+ease.">RNAsik: A Pipeline for complete and reproducible RNA-seq analysis that runs anywhere with speed and ease.</a> Journal of Open Source Software. 3, 583 (2018).</li><li>Love, M. I., Huber, W., Anders, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Moderated+estimation+of+fold+change+and+dispersion+for+RNA-seq+data+with+DESeq2.">Moderated estimation of fold change and dispersion for RNA-seq data with DESeq2.</a> Genome Biology. 15 (12), 550 (2014).</li><li>Kamiya, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+MYB36+transcription+factor+orchestrates+Casparian+strip+formation.">The MYB36 transcription factor orchestrates Casparian strip formation.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 112 (33), 10533-10538 (2015).</li><li>Zhang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Two+types+of+bHLH+transcription+factor+determine+the+competence+of+the+pericycle+for+lateral+root+initiation.">Two types of bHLH transcription factor determine the competence of the pericycle for lateral root initiation.</a> Nature Plants. 7 (5), 633-643 (2021).</li><li>Haecker, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expression+dynamics+of+WOX+genes+mark+cell+fate+decisions+during+early+embryonic+patterning+in+Arabidopsis+thaliana.">Expression dynamics of WOX genes mark cell fate decisions during early embryonic patterning in Arabidopsis thaliana.</a> Development. 131 (3), 657-668 (2004).</li><li>Chen, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Auxin+overproduction+in+shoots+cannot+rescue+auxin+deficiencies+in+Arabidopsis+roots.">Auxin overproduction in shoots cannot rescue auxin deficiencies in Arabidopsis roots.</a> Plant Cell Physiol. 55 (6), 1072-1079 (2014).</li><li>Nichterwitz, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Laser+capture+microscopy+coupled+with+Smart-seq2+for+precise+spatial+transcriptomic+profiling.">Laser capture microscopy coupled with Smart-seq2 for precise spatial transcriptomic profiling.</a> Nature Communications. 7, 12139 (2016).</li><li>Long, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nurse+cell--derived+small+RNAs+define+paternal+epigenetic+inheritance+in+Arabidopsis.">Nurse cell--derived small RNAs define paternal epigenetic inheritance in Arabidopsis.</a> Science. 373 (6550), (2021).</li><li>Gutzat, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Arabidopsis+shoot+stem+cells+display+dynamic+transcription+and+DNA+methylation+patterns.">Arabidopsis shoot stem cells display dynamic transcription and DNA methylation patterns.</a> EMBO Journal. 39 (20), e103667 (2020).</li></ol>

يمكن للبروتوكول المستند إلى Smart-seq2 إنشاء مكتبات تسلسل موثوقة من عدة مئات من الخلايا8. جودة المواد الأولية ضرورية لدقة تحليل النسخ. FACS هو أداة قوية لإعداد الخلايا ذات الأهمية ، ولكن يجب تحسين هذا الإجراء ، وخاصة خطوة protoplasting ، لتطبيقات النبات. يمكن أيضا استخدام التشريح المجهري ل...

الخلايا هي الوحدة الأساسية لجميع الكائنات الحية وتؤدي وظائف هيكلية وفسيولوجية. على الرغم من أن الخلايا في الكائنات متعددة الخلايا تظهر تزامنا واضحا ، إلا أن الخلايا من أنواع مختلفة وخلايا فردية تظهر اختلافات في نسخها أثناء التطور والاستجابات البيئية. يوفر تسلسل الحمض النووي الريبي أحادي الخلية عالي الإنتاجية (scRNA-seq) قوة غير مسبوقة لفهم عدم التجانس الخلوي. ساهم تطبيق scRNA-seq في علوم النبات في بناء أطلس الخلايا النباتية1 بنجاح ، وقد تم استخدامه لتحديد الأصناف الخلوية النادرة في الأنسجة النباتية2 ، وقدم نظرة ثاقبة لتكوين أنواع الخلايا في الأنسجة النباتية ، وتم استخدامه لتحديد الهوية الخلوية والوظائف المهمة المستخدمة أثناء تطوير النبات وتمايزه. بالإضافة إلى ذلك ، من الممكن استنتاج مسارات النمو الزماني المكاني في الأنسجة النباتية1،2،3 لاكتشاف جينات علامة جديدة4 ودراسة وظائف عوامل النسخ المهمة5 باستخدام scRNA-seq من أجل الكشف عن الحفظ التطوري لنفس نوع الخلية في النباتات المختلفة 3. تعد الضغوط اللاأحيائية من بين أهم التأثيرات البيئية على نمو النبات وتطوره. من خلال استكشاف التغييرات في تكوين أنواع الخلايا في الأنسجة النباتية في ظل ظروف معالجة مختلفة من خلال تسلسل النسخ أحادي الخلية ، يمكن للمرء أيضا حل آلية الاستجابة للإجهاد اللاأحيائي6.
تعتمد إمكانية حل عدم تجانس النسخ بين أنواع الخلايا باستخدام تسلسل scRNA على طريقة عزل الخلية ومنصة التسلسل. فرز الخلايا المنشط بالفلورة (FACS) هو تقنية مستخدمة على نطاق واسع لعزل مجموعة فرعية من الخلايا من أجل scRNA-seq بناء على تشتت الضوء وخصائص مضان الخلايا. وقد أدى تطوير خطوط علامات الفلورسنت بواسطة التكنولوجيا المحورة وراثيا إلى تحسن كبير في كفاءة عزل الخلايا بواسطة نظام مراقبة الأصولالميدانية 7. إن إجراء scRNA-seq باستخدام Smart-seq28 يعزز القدرة على تشريح عدم التجانس الخلوي. تتمتع طريقة Smart-seq2 بحساسية جيدة للكشف عن الجينات ويمكنها اكتشاف الجينات حتى مع إدخال نسخة منخفضة9. بالإضافة إلى جمع نوع الخلية السائبة ، توفر أجهزة فرز الخلايا الحديثة تنسيق فرز فهرس أحادي الخلية ، مما يسمح بتحليل النسخ بدقة خلية واحدة باستخدام Smart-seq210 أو طرق RNA-seq متعددة الإرسال الأخرى ، مثل CEL-seq211. يمكن استخدام الفرز أحادي الخلية أو نوع الخلية للعديد من التطبيقات النهائية الأخرى ، مثل الدراسات المتوازية متعددة الأوميكس12،13. يظهر هنا بروتوكول قوي ومتعدد الاستخدامات لعزل أنواع الخلايا النباتية، مثل خلايا البريسيكل ذات القطب الزاكيل، وخلايا غطاء الجذر الجانبي، والخلايا الأولية للجذر الجانبي، وخلايا القشرة، وخلايا الأديم الباطن من جذور خطوط خلايا علامة أرابيدوبسيس ثاليانا بواسطة FACS. يتضمن البروتوكول أيضا إنشاء مكتبة Smart-seq2 لتحليل النسخ النهائي.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>0.22 &#181;m strainer</td>
			<td>Sorfa&#160;</td>
			<td>622110</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agar</td>
			<td>Yeasen</td>
			<td>70101ES76</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agilent fragment analyzer</td>
			<td>Aglient</td>
			<td>Aglient 5200</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agilent high-sensitivity DNA kit</td>
			<td>Aglient</td>
			<td>DNF-474-0500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ampure XP beads</td>
			<td>BECKMAN</td>
			<td>A63881</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Betaine</td>
			<td>yuanye</td>
			<td>S18046-100g</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bleach</td>
			<td>Mr Muscle</td>
			<td>FnBn83BK</td>
			<td>20% (v/v) bleach</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BSA</td>
			<td>sigma</td>
			<td>9048-46-8</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CaCl2</td>
			<td>yuanye</td>
			<td>S24109-500g</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cellulase R10</td>
			<td>Yakult (Japan)</td>
			<td>9012-54-8</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cellulase RS</td>
			<td>Yakult (Japan)</td>
			<td>9012-54-8</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge tube (1.5 mL)</td>
			<td>Eppendolf</td>
			<td>30121589</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNase, RNase, DNA and RNA Away Surface Decontaminants</td>
			<td>Beyotime</td>
			<td>R0127</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>dNTPs (10 mM)</td>
			<td>NEB</td>
			<td>N0447S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DTT (0.1 M)</td>
			<td> 
			invitrogen</td>
			<td>18090050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol</td>
			<td>Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd</td>
			<td>100092680</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FACS</td>
			<td>BD FACS Melody</td>
			<td>BD-65745</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FACS</td>
			<td>Sony</td>
			<td>SH800S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Filter tip&#160; (1000 &#181;L)</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>TF112-1000-Q</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Filter tip&#160; (200 &#181;L)</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>TF140-200-Q</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Filter tip (10 &#181;L)</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>TF104-10-Q</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Filter tip (100 &#181;L)</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>TF113-100-Q</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluorescent microscope</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>Eclipse Ni-E</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Four-Dimensional Rotating Mixer</td>
			<td>Kylin -Bell</td>
			<td>BE-1100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hemicellulase</td>
			<td>sigma</td>
			<td>9025-56-3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IS PCR primer</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>5&#39;-AAGCAGTGGTATCAACGCAGAG 
			T-3&#39;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KAPA HiFi HotStart ReadyMix(2X)</td>
			<td>Roche&#160;</td>
			<td>7958935001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KCl</td>
			<td>Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd</td>
			<td>7447-40-7</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Macerozyme R10</td>
			<td>Yakult (Japan)</td>
			<td>9032-75-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnetic separation stand</td>
			<td>invitrogen</td>
			<td>12321D</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mannitol</td>
			<td>aladdin</td>
			<td>69-65-8</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MES</td>
			<td>aladdin</td>
			<td>145224948</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MgCl2&#160;</td>
			<td>yuanye</td>
			<td>R21455-500ml</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microcentrifuges</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>Centrifuge 5425</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micro-mini-centrifuge</td>
			<td>Titan</td>
			<td>Timi-10k</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MS</td>
			<td>Phytotech</td>
			<td>M519</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nextera XT DNA Library Preparation Kit</td>
			<td>illumina</td>
			<td>FC-131-1024</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>oligo-dT30VN primer</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>5&#39;-AAGCAGTGGTATCAACGCAGAG 
			TACTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTT 
			TTTTTTTTTTVN-3&#39;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PCR instrument</td>
			<td>Thermal cycler</td>
			<td>A24811</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pectolyase</td>
			<td>Yakult (Japan)</td>
			<td>9033-35-6</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plant marker lines</td>
			<td>Nottingham Arabidopsis Stock Centre (NASC)</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Qubit 1x dsDNA HS Assay Kit</td>
			<td>invitrogen</td>
			<td>Q33231</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Qubit 2.0 fluorometer</td>
			<td>invitrogen</td>
			<td>Q32866</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNase inhibitor&#160;</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>EO0382</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNase-free water</td>
			<td>invitrogen</td>
			<td>10977023</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Solution A</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>400 mM mannitol, 0.05 % BSA , 20 mM MES (pH5.7), 10 mM CaCl2, 20 mM KCl</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Solution B</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>1 % (w/v)cellulase R10, 1 % (w/v) cellulase RS, 1 %&#160; (w/v)hemicellulase, 0.5 %&#160; (w/v)pectolyase and 1 %&#160; (w/v) Macerozyme R10 of in a fresh aliquot of solution A</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile pestle</td>
			<td>BIOTREAT</td>
			<td>453463</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Strainer (40 &#181;m )</td>
			<td>Sorfa&#160;</td>
			<td>251100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Superscript enzyme (200 U/&#181;L)</td>
			<td>invitrogen</td>
			<td>18090050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SuperScript VI buffer (5x)</td>
			<td>invitrogen</td>
			<td>18090050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T0est tube (5 mL)</td>
			<td>BD Falcon</td>
			<td>352052</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thin-walled PCR tubes with caps (0.5 mL)</td>
			<td>AXYGEN</td>
			<td>PCR-05-C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>Sangon Biotech</td>
			<td>A600198-0500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TSO primer</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>5&#39;-AAGCAGTGGTATCAACGCAGAG 
			TACATrGrG+G-3&#39;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vortex</td>
			<td>Titan</td>
			<td>VM-T2</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

isolation and transcriptome analysis of plant cell types

في الكائنات الحية متعددة الخلايا، يمكن أن تكون البرمجة التنموية والاستجابات البيئية متباينة للغاية في أنواع الخلايا المختلفة أو حتى داخل الخلايا، وهو ما يعرف بعدم التجانس الخلوي. في السنوات الأخيرة ، أصبح عزل الخلية الواحدة ونوع الخلية جنبا إلى جنب مع تقنيات تسلسل الجيل التالي (NGS) أدوات مهمة لدراسة العمليات البيولوجية بدقة خلية واحدة. ومع ذلك، فإن عزل الخلايا النباتية أكثر صعوبة نسبيا بسبب وجود جدران الخلايا النباتية، وهو ما يحد من تطبيق نهج الخلية الواحدة في النباتات. يصف هذا البروتوكول إجراء قويا لفرز الخلايا المنشطة بالفلورة (FACS) القائم على عزل الخلية الواحدة ونوع الخلية مع الخلايا النباتية ، وهو مناسب للتحليل متعدد الأوميكس المصب والدراسات الأخرى. باستخدام خطوط علامات الفلورسنت الجذرية Arabidopsis ، نوضح كيف يتم عزل أنواع معينة من الخلايا ، مثل خلايا pericycle ذات قطب الخشب ، والخلايا الأولية للجذر الجانبي ، وخلايا غطاء الجذر الجانبي ، وخلايا القشرة ، وخلايا الأديم الباطن. علاوة على ذلك ، يتم أيضا توفير طريقة فعالة لتحليل النسخ النهائي باستخدام Smart-seq2. يمكن تكييف طريقة عزل الخلايا وتقنيات تحليل النسخ مع أنواع الخلايا والأنواع النباتية الأخرى ولها إمكانات تطبيق واسعة في علوم النبات.

عزل البروتوبلاست هذا البروتوكول فعال لفرز البروتوبلاست لخطوط علامة الجذر الفلورية A. thaliana. تم تطوير خطوط العلامات هذه عن طريق اندماج البروتينات الفلورية مع الجينات المعبر عنها على وجه التحديد في أنواع الخلايا المستهدفة ، أو باستخدام خطوط مصيدة المحسن (الشكل 1</st...

Watch this Scientific Journal Video about Isolation and Transcriptome Analysis of Plant Cell Types at JoVE.com

Isolation and Transcriptome Analysis of Plant Cell Types

تبشر جدوى وفعالية طرق scRNA-seq عالية الإنتاجية بعصر الخلية الواحدة في أبحاث النبات. يظهر هنا إجراء قوي وكامل لعزل أنواع معينة من خلايا جذر Arabidopsis thaliana وبناء مكتبة النسخ اللاحقة وتحليلها.

عزل وتحليل النسخ لأنواع الخلايا النباتية

In multicellular organisms, developmental programming and environmental responses can be highly divergent in different cell types or even within cells, ...

يمكن لتحليل Transcriptome على خلية واحدة أو أنواع الخلايا الكشف عن الاختلاف الدقيق في التعبير الجيني الذي يتم حجبه من خلال عدم التجانس ، وهو أداة قوية للكشف عن الآليات التنظيمية المعقدة داخل الخلايا. يمكن إجراء فرز الخلايا المنشط بالفلورة متبوعا بتحليل RN-seq إما في وضع نوع الخلية المفردة أو السائبة مع حساسية عالية للكشف عن النسخ والتوافق مع الأساليب المتعددة الأوميك الأخرى. يحتاج مستخدمو هذا البروتوكول لأول مرة إلى الانتباه إلى بعض الخطوات في فرز البروتوبلاست وإعداد مكتبة RNA-seq.جنبا إلى جنب مع جون تشانغ ، سيساعد الدكتور رونغرونغ شيه ، وهو باحث ما بعد الدكتوراه في مختبرنا ، في توضيح الإجراء. للبدء ، ضع نوع Arabidopsis thaliana البري وبذور خط علامة الفلورسنت في 20٪ مبيض واحتضانها باستخدام حاضنة دوارة في درجة حرارة الغرفة لمدة 15 دقيقة لتعقيم البذور. أثناء العمل على مقعد معقم ، اشطف البذور ثلاث إلى خمس مرات في ماء مقطر مزدوج.طبق النوع البري وبذور خط المراسل على وسط MS نصف القوة بوزن 0.8٪ لكل حجم أجار. طبقي النباتات لمدة يومين عند أربع درجات مئوية. ثم قم بزراعتها عموديا لمدة خمسة أيام عند 23 درجة مئوية تحت ضوء 16 ساعة ودورات مظلمة لمدة 18 ساعة.قم بإذابة محاليل البروتوبلاستيد المشار إليها باسم المحلول (أ) والمحلول (ب) برفق على الجليد قبل التجربة. اقطع الجذور من النباتات باستخدام شفرة أو مقص نظيف واقطع الجذور إلى قطع 0.5 سم تقريبا. اغمر الجذور المفرومة في 1.5 ملليلتر من المحلول B متبوعا بدوران لطيف في درجة حرارة الغرفة لمدة 1.5 إلى 2 ساعة.قم بتصفية البروتوبلاستيدات الجذرية الناتجة من خلال شبكة مصفاة 40 ميكرون وشطف الشبكة بواحد إلى ملليلتر من المحلول A.Centrifuge الترشيحات المدمجة عند 300 جم لمدة خمس دقائق عند أربع درجات مئوية. تخلص من المادة الطافية باستخدام ماصة ، وأعد تعليق حبيبات الخلية في 500 إلى 600 ميكرولتر من المحلول أ ، وضعها على الثلج على الفور. لفرز الخلايا ، انقل محلول الخلية المعاد تعليقه إلى أنبوب اختبار جديد سعة خمسة ملليلترات.املأ خزان سائل الغمد وافحص خزان النفايات. ثم قم بتشغيل فرز الخلايا المنشط بالفلورة أو جهاز FACS. نفذ خطوات إعداد الجهاز والمعايرة التلقائية على جهاز الفرز.حدد قنوات التألق واستخدم نباتا من النوع البري بدون مضان كعنصر تحكم أساسي. اضبط بوابة الفرز بناء على شدة التألق ومفردات التشتت الأمامية والتشتت الجانبي. بعد إضافة 500 ميكرولتر من المحلول A في أنبوب تجميع سعة 1.5 ملليلتر ، ابدأ في الفرز وجمع 2،000 إلى 3،000 خلية لكل أنبوب.بعد الفرز ، ضع العينات على الجليد على الفور. جهاز الطرد المركزي أنبوب التجميع الذي يحتوي على الخلايا عند 300 جم وأربع درجات مئوية لمدة خمس دقائق وإزالة المادة الطافية باستخدام ماصة. خذ ميكرولتر من الخلايا المصنفة وتحقق من التألق باستخدام مجهر مضان.قم بتخزين الخلايا التي تم فرزها عند درجة حرارة 80 درجة مئوية تحت الصفر إذا لم يتم استخدامها على الفور. لفرز مؤشر الخلية الواحدة ، ضع لوحة 96 بئرا مع غشاء في المحول. قم بمعايرة موضع اللوحة بحيث تسقط القطرة في الفتحة المركزية للوحة.قم بإزالة الغشاء من لوحة 96 بئرا وضع لوحة 96 بئرا في المحول. حدد وضع فرز خلية واحدة عند الفرز. أدخل العدد المستهدف للخلايا التي تم فرزها كخلية واحدة وابدأ الفرز.قبل البدء في التجربة ، قم بتنظيف المقعد باستخدام مطهر سطحي و 75٪ إيثانول. استخدم جميع المعدات فقط لإعداد تسلسل المكتبة. بعد إضافة ميكرولتر واحد من الخليط الطازج A إلى العينة التي تم فرزها ، قم بطحنها بمدقة معقمة.باستخدام الماء الخالي من الحمض النووي الريبي ، اجعل الحجم 14 ميكرولتر. ثم انقل كل عينة إلى أنبوب PCR رقيق الجدران سعة 0.2 ملليلتر. ثم تحضير الخليط B.أضف 4.4 ميكرولتر في الخليط B إلى كل أنبوب PCR يحتوي على عينات واخلطها عن طريق سحب لطيف.احتضان العينات عند 72 درجة مئوية لمدة ثلاث دقائق. بعد الحضانة ، ضع العينات على الفور على الجليد لتهجين oligo dT إلى ذيل poly-A. تحضير خليط تفاعل النسخ العكسي أو الخليط C في 21.6 ميكرولتر منه لكل أنبوب يحتوي على العينات.إخضاع العينات لتفاعل النسخ العكسي في أداة تفاعل البوليميراز المتسلسل الشائعة وفقا لبرنامج النسخ العكسي. أضف 40.8 ميكرولترا من خليط تفاعل التضخيم المسبق المحضر حديثا أو الخليط D إلى منتج تفاعل النسخ العكسي وقم بتشغيل برنامج التضخيم المسبق. يمكن تحديد دورة التضخيم بواسطة تفاعل البوليميراز المتسلسل الكمي عندما يدخل التفاعل المرحلة الأسية.لتنقية منتجات تفاعل التضخيم المسبق ، انقل المنتجات المضخمة مسبقا من أنبوب PCR إلى أنبوب 1.5 ملليلتر. أضف 48 ميكرولترا من حبات AMPure XP إلى كل عينة واخلطها برفق عن طريق السحب قبل الحضانة. ضع الأنابيب سعة 1.5 ملليلتر التي تحتوي على العينات والخرز على حامل فصل مغناطيسي لمدة خمس دقائق.تخلص بعناية من المادة الطافية من العينات دون إزعاج الخرز. بعد تعليقها في 200 ميكرولتر من الإيثانول بنسبة 80٪ ، ضعها على حامل الفصل المغناطيسي لمدة ثلاث دقائق أخرى. بعد التخلص من الإيثانول الذي يحتوي على مادة طاف ، جفف العينات في الهواء في أنبوب لمدة 10 دقائق.أعد تعليق الخرزات في 20 ميكرولترا من الماء الخالي من النيوكلياز واحتضانها في درجة حرارة الغرفة لمدة خمس دقائق. ثم ضعها على حامل الفصل المغناطيسي لمدة خمس دقائق. باستخدام ماصة ، انقل 18 ميكرولترا من المادة الطافية من كل أنبوب إلى أنبوب طرد مركزي جديد سعة 1.5 ملليلتر.أخيرا ، اتبع الخطوات الموضحة في النص لتوصيف ما قبل المكتبة ، متبوعا ببناء المكتبة وتنقيتها وقياسها. تم تطوير خطوط علامات Arabidopsis thaliana الفلورية عن طريق دمج البروتينات الفلورية مع الجينات المعبر عنها على وجه التحديد في أنواع الخلايا المستهدفة أو باستخدام خطوط مصيدة التحسين. تم فرز البروتوبلاستيدات الملحوظة الخاصة بالفلورة بنجاح بناء على شدة التألق ومفردات التشتت الأمامية والتشتت الجانبي.تم تصور الخلايا التي تم فرزها باستخدام التصوير الساطع والتصوير الفلوري. النتائج التمثيلية لمكتبة تسلسل الحمض النووي الريبوزي (RNA) لحوالي 2000 خلية محيطية من نسيج الخشب، وخلايا الجذر البدائي الجانبي، وخلايا الجلد الباطن أو القشرة، وخلايا غطاء الجذر الجانبي. لا يزال من الممكن تسلسل مكتبة صغيرة الحجم مع قمم dimer التمهيدي أو المحول بعد تحديد الحجم.أشارت المكتبة ذات التوزيع غير الطبيعي للحجم إلى عدم نجاح إعداد المكتبة. تم تحليل أنماط التعبير الجيني. تم تجميع الجينات المخصبة في أي من أنواع الخلايا الجذرية الأربعة وتصويرها في خريطة حرارية توضح خصوصية التعبيرات الجينية بين أنواع الخلايا المختلفة.تعد الجودة العالية والنقاء للخلايا المستهدفة من خلال البوابات والفرز الصحيحين ومنع تدهور الحمض النووي الريبي مفتاحا لنجاح بناء المكتبة. بالنسبة ل RNA-seq في وضع الخلية الواحدة ، تم الإبلاغ مؤخرا عن عدة طرق متكاملة مع المعرف الجزيئي الفريد مما أدى إلى تحسين الأداء بشكل كبير.

Research

JoVE Journal

Biology

Mating and Tetrad Separation of Chlamydomonas reinhardtii for Genetic Analysis

Mating and Tetrad Separation of Chlamydomonas reinhardtii for Genetic Analysis

وفصل التزاوج من الرباعيات المتلحفة reinhardtii عن التحليل الوراثي

The unicellular green alga Chlamydomonas reinhardtii (Chlamydomonas) has become a popular organism for research in diverse areas of cell biology and ...

Fluorescence Activated Cell Sorting of Plant Protoplasts

مضان الفرز الخلية النباتية المنشط من Protoplasts

High-resolution, cell type-specific analysis of gene expression greatly enhances understanding of developmental regulation and responses to environmental ...

Comprehensive Compositional Analysis of Plant Cell Walls (Lignocellulosic biomass) Part I: Lignin

Comprehensive Compositional Analysis of Plant Cell Walls Lignocellulosic biomass Part I: Lignin

تحليل شامل للالتركيبية جدران الخلايا النباتية (الكتلة الحيوية Lignocellulosic) الجزء الأول : اللجنين

The need for renewable, carbon neutral, and sustainable raw materials for industry and society has become one of the most pressing issues for the 21st ...

Comprehensive Compositional Analysis of Plant Cell Walls (Lignocellulosic biomass) Part II: Carbohydrates

Comprehensive Compositional Analysis of Plant Cell Walls Lignocellulosic biomass Part II: Carbohydrates

التركيبية تحليل شامل لجدران الخلايا النباتية (الكتلة الحيوية Lignocellulosic) الجزء الثاني : الكربوهيدرات

A Novel Bayesian Change-point Algorithm for Genome-wide Analysis of Diverse ChIPseq Data Types

رواية النظرية الافتراضية تغيير نقطة حسابي لتحليل الجينوم-اسعة من أنواع البيانات المتنوعة ChIPseq

ChIPseq is a widely used technique for investigating protein-DNA interactions. Read density profiles are generated by using next-sequencing of ...

Efficient and Rapid Isolation of Early-stage Embryos from Arabidopsis thaliana Seeds

Efficient and Rapid Isolation of Early-stage Embryos from Arabidopsis thaliana Seeds

العزلة الفعالة والسريعة من الأجنة المبكرة مرحلة من<em&gt; thaliana نبات الأرابيدوبسيس</em&gt; بذور

In flowering plants, the embryo develops within a nourishing tissue - the endosperm - surrounded by the maternal seed integuments (or seed coat). As a ...

Metabolic Labeling and Membrane Fractionation for Comparative Proteomic Analysis of Arabidopsis thaliana Suspension Cell Cultures

Metabolic Labeling and Membrane Fractionation for Comparative Proteomic Analysis of Arabidopsis thaliana Suspension Cell Cultures

الأيضية وصفها وغشاء التقطير للالمقارن تحليل البروتين من<em&gt; نبات الأرابيدوبسيس thaliana</em&gt; الثقافات تعليق خلية

Plasma membrane microdomains are features based on the physical properties of the lipid and sterol environment and have particular roles in signaling ...

Isolation and Physiological Analysis of Mouse Cardiomyocytes

العزلة والفسيولوجية تحليل ماوس العضلية

Cardiomyocytes, the workhorse cell of the heart, contain exquisitely organized cytoskeletal and contractile elements that generate the contractile force ...

An Efficient Method for Quantitative, Single-cell Analysis of Chromatin Modification and Nuclear Architecture in Whole-mount Ovules in Arabidopsis

An Efficient Method for Quantitative, Single-cell Analysis of Chromatin Modification and Nuclear Architecture in Whole-mount Ovules in Arabidopsis

وسيلة فعالة للالكمي، التحليل خلية واحدة من لونين تعديل والعمارة النووية في جبل لالجامع بويضات في<em&gt; نبات الأرابيدوبسيس</em

In flowering plants, the somatic-to-reproductive cell fate transition is marked by the specification of spore mother cells (SMCs) in floral organs of the ...

Isolation and Compositional Analysis of Plant Cuticle Lipid Polyester Monomers

العزلة والتركيبية تحليل النبات البشرة الدهن البوليستر مونمرات

Terrestrial plants produce extracellular aliphatic biopolyesters that modify cell walls of specific tissues. Epidermal cells synthesize cutin, a polyester ...