Name: isolation and transcriptome analysis of plant cell types
Uploaded: 2023-04-07T12:40:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Isolation and Transcriptome Analysis of Plant Cell Types at JoVE.com

We hebben dit protocol opgezet in de eencellige multi-omics-faciliteit van de School of Agriculture and Biology, Shanghai Jiao Tong University, en werden ondersteund door de National Natural Science Foundation of China (Grant No. 32070608), het Shanghai Pujiang Program (Grant No. 20PJ1405800) en Shanghai Jiao Tong University (Grant Nos. Agri-X20200202, 2019TPB05).

Het volgende protocol is geoptimaliseerd voor A. thaliana wild-type (WT) zaden zonder fluorescentie en fluorescerende markerlijnen voor de volgende wortelceltypen: xyleempolige pericyclecellen (J0121), laterale wortelinitiële cellen, laterale wortelkapcellen (J3411), endodermis- en cortexcellen (J0571) (figuur 1A). Alle markerlijnen werden verkregen uit een commerciële bron (zie tabel met materialen), behalve de laterale wortelinitiatiecelmarkeringslijn, die werd ...

<ol>
	<li>Zhang, T. -. Q., Chen, Y., Liu, Y., Lin, W. -. H., Wang, J. -. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-cell+transcriptome+atlas+and+chromatin+accessibility+landscape+reveal+differentiation+trajectories+in+the+rice+root.">Single-cell transcriptome atlas and chromatin accessibility landscape reveal differentiation trajectories in the rice root.</a> Nature Communications. 12 (1), 2053 (2021).</li><li>Denyer, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spatiotemporal+developmental+trajectories+in+the+Arabidopsis+root+revealed+using+high-throughput+single-cell+RNA+sequencing.">Spatiotemporal developmental trajectories in the Arabidopsis root revealed using high-throughput single-cell RNA sequencing.</a> Developmental Cell. 48 (6), 840-852 (2019).</li><li>Liu, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transcriptional+landscape+of+rice+roots+at+the+single-cell+resolution.">Transcriptional landscape of rice roots at the single-cell resolution.</a> Molecular Plant. 14 (3), 384-394 (2021).</li><li>Liu, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Global+dynamic+molecular+profiling+of+stomatal+lineage+cell+development+by+single-cell+RNA+sequencing.">Global dynamic molecular profiling of stomatal lineage cell development by single-cell RNA sequencing.</a> Molecular Plant. 13 (8), 1178-1193 (2020).</li><li>Shahan, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+single-cell+Arabidopsis+root+atlas+reveals+developmental+trajectories+in+wild-type+and+cell+identity+mutants.">A single-cell Arabidopsis root atlas reveals developmental trajectories in wild-type and cell identity mutants.</a> Developmental Cell. 57 (4), 543-560 (2022).</li><li>Wendrich, J. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Vascular+transcription+factors+guide+plant+epidermal+responses+to+limiting+phosphate+conditions.">Vascular transcription factors guide plant epidermal responses to limiting phosphate conditions.</a> Science. 370 (6518), (2020).</li><li>Carter, A. D., Bonyadi, R., Gifford, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+use+of+fluorescence-activated+cell+sorting+in+studying+plant+development+and+environmental+responses.">The use of fluorescence-activated cell sorting in studying plant development and environmental responses.</a> The International Journal of Developmental Biology. 57 (6-8), 545-552 (2013).</li><li>Picelli, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Full-length+RNA-seq+from+single+cells+using+Smart-seq2.">Full-length RNA-seq from single cells using Smart-seq2.</a> Nature Protocols. 9 (1), 171-181 (2014).</li><li>Wang, X., He, Y., Zhang, Q., Ren, X., Zhang, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Direct+comparative+analyses+of+10X+genomics+chromium+and+Smart-seq2.">Direct comparative analyses of 10X genomics chromium and Smart-seq2.</a> Genomics Proteomics Bioinformatics. 19 (2), 253-266 (2021).</li><li>Serrano-Ron, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reconstruction+of+lateral+root+formation+through+single-cell+RNAsequencing+reveals+order+of+tissue+initiation.">Reconstruction of lateral root formation through single-cell RNAsequencing reveals order of tissue initiation.</a> Molecular Plant. 14 (8), 1362-1378 (2021).</li><li>Hashimshony, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CEL-Seq2:+Sensitive+highly-multiplexed+single-cell+RNA-Seq.">CEL-Seq2: Sensitive highly-multiplexed single-cell RNA-Seq.</a> Genome Biology. 17, 77 (2016).</li><li>Macaulay, I. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=G&amp;T-seq:+Parallel+sequencing+of+single-cell+genomes+and+transcriptomes.">G&amp;T-seq: Parallel sequencing of single-cell genomes and transcriptomes.</a> Nature Methods. 12 (6), 519-522 (2015).</li><li>Angermueller, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Parallel+single-cell+sequencing+links+transcriptional+and+epigenetic+heterogeneity.">Parallel single-cell sequencing links transcriptional and epigenetic heterogeneity.</a> Nature Methods. 13 (3), 229-232 (2016).</li><li>De Rybel, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+aux/IAA28+signaling+cascade+activates+GATA23-dependent+specification+of+lateral+root+founder+cell+identity.">A novel aux/IAA28 signaling cascade activates GATA23-dependent specification of lateral root founder cell identity.</a> Current Biology. 20 (19), 1697-1706 (2010).</li><li>Duncombe, S. G., Barnes, W. J., Anderson, C. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+the+delivery+and+behavior+of+cellulose+synthases+in+Arabidopsis+thaliana+using+confocal+microscopy.">Imaging the delivery and behavior of cellulose synthases in Arabidopsis thaliana using confocal microscopy.</a> Methods in Cell Biology. 160, 201-213 (2020).</li><li>Levy, S. E., Myers, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Advancements+in+next-generation+sequencing.">Advancements in next-generation sequencing.</a> Annual Review of Genomics and Human Genetics. 17 (1), 95-115 (2016).</li><li>Ooi, C. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-throughput+full-length+single-cell+mRNA-seq+of+rare+cells.">High-throughput full-length single-cell mRNA-seq of rare cells.</a> PLoS One. 12 (11), e0188510 (2017).</li><li>Pertea, M., Kim, D., Pertea, G. M., Leek, J. T., Salzberg, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transcript-level+expression+analysis+of+RNA-seq+experiments+with+HISAT,+StringTie+and+Ballgown.">Transcript-level expression analysis of RNA-seq experiments with HISAT, StringTie and Ballgown.</a> Nature Protocols. 11 (9), 1650-1667 (2016).</li><li>Tsyganov, K., Perry, A., Archer, S., Powell, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RNAsik:+A+Pipeline+for+complete+and+reproducible+RNA-seq+analysis+that+runs+anywhere+with+speed+and+ease.">RNAsik: A Pipeline for complete and reproducible RNA-seq analysis that runs anywhere with speed and ease.</a> Journal of Open Source Software. 3, 583 (2018).</li><li>Love, M. I., Huber, W., Anders, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Moderated+estimation+of+fold+change+and+dispersion+for+RNA-seq+data+with+DESeq2.">Moderated estimation of fold change and dispersion for RNA-seq data with DESeq2.</a> Genome Biology. 15 (12), 550 (2014).</li><li>Kamiya, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+MYB36+transcription+factor+orchestrates+Casparian+strip+formation.">The MYB36 transcription factor orchestrates Casparian strip formation.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 112 (33), 10533-10538 (2015).</li><li>Zhang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Two+types+of+bHLH+transcription+factor+determine+the+competence+of+the+pericycle+for+lateral+root+initiation.">Two types of bHLH transcription factor determine the competence of the pericycle for lateral root initiation.</a> Nature Plants. 7 (5), 633-643 (2021).</li><li>Haecker, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expression+dynamics+of+WOX+genes+mark+cell+fate+decisions+during+early+embryonic+patterning+in+Arabidopsis+thaliana.">Expression dynamics of WOX genes mark cell fate decisions during early embryonic patterning in Arabidopsis thaliana.</a> Development. 131 (3), 657-668 (2004).</li><li>Chen, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Auxin+overproduction+in+shoots+cannot+rescue+auxin+deficiencies+in+Arabidopsis+roots.">Auxin overproduction in shoots cannot rescue auxin deficiencies in Arabidopsis roots.</a> Plant Cell Physiol. 55 (6), 1072-1079 (2014).</li><li>Nichterwitz, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Laser+capture+microscopy+coupled+with+Smart-seq2+for+precise+spatial+transcriptomic+profiling.">Laser capture microscopy coupled with Smart-seq2 for precise spatial transcriptomic profiling.</a> Nature Communications. 7, 12139 (2016).</li><li>Long, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nurse+cell--derived+small+RNAs+define+paternal+epigenetic+inheritance+in+Arabidopsis.">Nurse cell--derived small RNAs define paternal epigenetic inheritance in Arabidopsis.</a> Science. 373 (6550), (2021).</li><li>Gutzat, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Arabidopsis+shoot+stem+cells+display+dynamic+transcription+and+DNA+methylation+patterns.">Arabidopsis shoot stem cells display dynamic transcription and DNA methylation patterns.</a> EMBO Journal. 39 (20), e103667 (2020).</li></ol>

Het op Smart-seq2 gebaseerde protocol kan betrouwbare sequencingbibliotheken genereren uit enkele honderden cellen8. De kwaliteit van het uitgangsmateriaal is essentieel voor de nauwkeurigheid van de transcriptoomanalyse. FACS is een krachtig hulpmiddel voor het voorbereiden van cellen van belang, maar deze procedure, met name de protoplastische stap, moet worden geoptimaliseerd voor plantaardige toepassingen. Laser capture microdissection (LCM) of handmatig ontleedde cellen kunnen ook worden gebr...

Cellen zijn de fundamentele eenheid van alle levende organismen en vervullen structurele en fysiologische functies. Hoewel de cellen in meercellige organismen schijnbare synchroniciteit vertonen, vertonen cellen van verschillende typen en individuele cellen verschillen in hun transcriptomen tijdens ontwikkeling en omgevingsreacties. High-throughput single-cell RNA sequencing (scRNA-seq) biedt ongekende kracht voor het begrijpen van cellulaire heterogeniteit. Het toepassen van scRNA-seq in de plantenwetenschappen heeft bijgedragen aan het succesvol construeren van een plantencelatlas1, is gebruikt om zeldzame cellulaire taxa in plantenweefsels2 te identificeren, heeft inzicht gegeven in de samenstelling van celtypen in plantenweefsels en is gebruikt om cellulaire identiteit en belangrijke functies te identificeren die worden gebruikt tijdens de ontwikkeling en differentiatie van planten. Daarnaast is het mogelijk om spatiotemporale ontwikkelingstrajecten in plantenweefsels 1,2,3 af te leiden om nieuwe markergenen 4 te ontdekken en de functies van belangrijke transcriptiefactoren5 te bestuderen met behulp van scRNA-seq om het evolutionaire behoud van hetzelfde celtype in verschillende planten te onthullen 3. Abiotische spanningen behoren tot de belangrijkste omgevingsinvloeden op de groei en ontwikkeling van planten. Door de veranderingen in de samenstelling van celtypen in plantenweefsels onder verschillende behandelingsomstandigheden te onderzoeken door middel van single-cell transcriptoomsequencing, kan men ook het abiotische stressresponsmechanismeoplossen 6.
Het potentieel voor het oplossen van transcriptionele heterogeniteit tussen celtypen met behulp van scRNA-sequencing hangt af van de celisolatiemethode en het sequencingplatform. Fluorescentie-geactiveerde celsortering (FACS) is een veelgebruikte techniek voor het isoleren van een subpopulatie van cellen voor scRNA-seq op basis van lichtverstrooiing en de fluorescentie-eigenschappen van de cellen. De ontwikkeling van fluorescerende markerlijnen door transgene technologie heeft de efficiëntie van celisolatie door FACS7 sterk verbeterd. Het uitvoeren van scRNA-seq met behulp van Smart-seq28 verbetert verder het vermogen om de cellulaire heterogeniteit te ontleden. De Smart-seq2-methode heeft een goede gevoeligheid voor gendetectie en kan genen detecteren, zelfs met een lage transcriptinvoer9. Naast het verzamelen van bulkcellen bieden moderne celsorteerders een sorteerformaat voor één celindex, waardoor transcriptoomanalyse met eencellige resolutie mogelijk is met behulp van Smart-seq210 of andere gemultiplexte RNA-seq-methoden, zoals CEL-seq211. Eencellige of celachtige sortering kan mogelijk worden gebruikt voor vele andere downstream-toepassingen, zoals parallelle multi-omics-studies12,13. Hier wordt een robuust en veelzijdig protocol gepresenteerd voor het isoleren van plantenceltypen, zoals xyleempolige pericyclecellen, laterale wortelkapcellen, laterale wortelinitiële cellen, cortexcellen en endodermale cellen uit de wortels van Arabidopsis thaliana markercellijnen door FACS. Het protocol omvat verder het bouwen van de Smart-seq2-bibliotheek voor downstream transcriptoomanalyse.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>0.22 &#181;m strainer</td>
			<td>Sorfa&#160;</td>
			<td>622110</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agar</td>
			<td>Yeasen</td>
			<td>70101ES76</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agilent fragment analyzer</td>
			<td>Aglient</td>
			<td>Aglient 5200</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agilent high-sensitivity DNA kit</td>
			<td>Aglient</td>
			<td>DNF-474-0500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ampure XP beads</td>
			<td>BECKMAN</td>
			<td>A63881</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Betaine</td>
			<td>yuanye</td>
			<td>S18046-100g</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bleach</td>
			<td>Mr Muscle</td>
			<td>FnBn83BK</td>
			<td>20% (v/v) bleach</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BSA</td>
			<td>sigma</td>
			<td>9048-46-8</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CaCl2</td>
			<td>yuanye</td>
			<td>S24109-500g</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cellulase R10</td>
			<td>Yakult (Japan)</td>
			<td>9012-54-8</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cellulase RS</td>
			<td>Yakult (Japan)</td>
			<td>9012-54-8</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge tube (1.5 mL)</td>
			<td>Eppendolf</td>
			<td>30121589</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNase, RNase, DNA and RNA Away Surface Decontaminants</td>
			<td>Beyotime</td>
			<td>R0127</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>dNTPs (10 mM)</td>
			<td>NEB</td>
			<td>N0447S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DTT (0.1 M)</td>
			<td> 
			invitrogen</td>
			<td>18090050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol</td>
			<td>Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd</td>
			<td>100092680</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FACS</td>
			<td>BD FACS Melody</td>
			<td>BD-65745</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FACS</td>
			<td>Sony</td>
			<td>SH800S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Filter tip&#160; (1000 &#181;L)</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>TF112-1000-Q</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Filter tip&#160; (200 &#181;L)</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>TF140-200-Q</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Filter tip (10 &#181;L)</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>TF104-10-Q</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Filter tip (100 &#181;L)</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>TF113-100-Q</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluorescent microscope</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>Eclipse Ni-E</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Four-Dimensional Rotating Mixer</td>
			<td>Kylin -Bell</td>
			<td>BE-1100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hemicellulase</td>
			<td>sigma</td>
			<td>9025-56-3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IS PCR primer</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>5&#39;-AAGCAGTGGTATCAACGCAGAG 
			T-3&#39;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KAPA HiFi HotStart ReadyMix(2X)</td>
			<td>Roche&#160;</td>
			<td>7958935001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KCl</td>
			<td>Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd</td>
			<td>7447-40-7</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Macerozyme R10</td>
			<td>Yakult (Japan)</td>
			<td>9032-75-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnetic separation stand</td>
			<td>invitrogen</td>
			<td>12321D</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mannitol</td>
			<td>aladdin</td>
			<td>69-65-8</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MES</td>
			<td>aladdin</td>
			<td>145224948</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MgCl2&#160;</td>
			<td>yuanye</td>
			<td>R21455-500ml</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microcentrifuges</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>Centrifuge 5425</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micro-mini-centrifuge</td>
			<td>Titan</td>
			<td>Timi-10k</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MS</td>
			<td>Phytotech</td>
			<td>M519</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nextera XT DNA Library Preparation Kit</td>
			<td>illumina</td>
			<td>FC-131-1024</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>oligo-dT30VN primer</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>5&#39;-AAGCAGTGGTATCAACGCAGAG 
			TACTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTT 
			TTTTTTTTTTVN-3&#39;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PCR instrument</td>
			<td>Thermal cycler</td>
			<td>A24811</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pectolyase</td>
			<td>Yakult (Japan)</td>
			<td>9033-35-6</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plant marker lines</td>
			<td>Nottingham Arabidopsis Stock Centre (NASC)</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Qubit 1x dsDNA HS Assay Kit</td>
			<td>invitrogen</td>
			<td>Q33231</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Qubit 2.0 fluorometer</td>
			<td>invitrogen</td>
			<td>Q32866</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNase inhibitor&#160;</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>EO0382</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNase-free water</td>
			<td>invitrogen</td>
			<td>10977023</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Solution A</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>400 mM mannitol, 0.05 % BSA , 20 mM MES (pH5.7), 10 mM CaCl2, 20 mM KCl</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Solution B</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>1 % (w/v)cellulase R10, 1 % (w/v) cellulase RS, 1 %&#160; (w/v)hemicellulase, 0.5 %&#160; (w/v)pectolyase and 1 %&#160; (w/v) Macerozyme R10 of in a fresh aliquot of solution A</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile pestle</td>
			<td>BIOTREAT</td>
			<td>453463</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Strainer (40 &#181;m )</td>
			<td>Sorfa&#160;</td>
			<td>251100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Superscript enzyme (200 U/&#181;L)</td>
			<td>invitrogen</td>
			<td>18090050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SuperScript VI buffer (5x)</td>
			<td>invitrogen</td>
			<td>18090050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T0est tube (5 mL)</td>
			<td>BD Falcon</td>
			<td>352052</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thin-walled PCR tubes with caps (0.5 mL)</td>
			<td>AXYGEN</td>
			<td>PCR-05-C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>Sangon Biotech</td>
			<td>A600198-0500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TSO primer</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>5&#39;-AAGCAGTGGTATCAACGCAGAG 
			TACATrGrG+G-3&#39;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vortex</td>
			<td>Titan</td>
			<td>VM-T2</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

isolation and transcriptome analysis of plant cell types

In meercellige organismen kunnen ontwikkelingsprogrammering en omgevingsreacties zeer uiteenlopend zijn in verschillende celtypen of zelfs binnen cellen, wat bekend staat als cellulaire heterogeniteit. In de afgelopen jaren zijn single-cell en cell-type isolatie in combinatie met next-generation sequencing (NGS) technieken belangrijke hulpmiddelen geworden voor het bestuderen van biologische processen bij single-cell resolutie. Het isoleren van plantencellen is echter relatief moeilijker vanwege de aanwezigheid van plantencelwanden, wat de toepassing van eencellige benaderingen in planten beperkt. Dit protocol beschrijft een robuuste procedure voor fluorescentie-geactiveerde celsortering (FACS)-gebaseerde eencellige en celtype-isolatie met plantencellen, die geschikt is voor downstream multi-omics-analyse en andere studies. Met behulp van Arabidopsis wortel fluorescerende markerlijnen, laten we zien hoe bepaalde celtypen, zoals xyleem-pool pericycle cellen, laterale wortel initiële cellen, laterale wortel cap cellen, cortexcellen en endodermale cellen, worden geïsoleerd. Bovendien is er ook een effectieve downstream transcriptoomanalysemethode met behulp van Smart-seq2 beschikbaar. De celisolatiemethode en transcriptoomanalysetechnieken kunnen worden aangepast aan andere celtypen en plantensoorten en hebben een breed toepassingspotentieel in de plantenwetenschap.

Protoplast isolatie Dit protocol is effectief voor de protoplastsortering van fluorescerende A. thaliana wortelmarkeringslijnen. Deze markerlijnen zijn ontwikkeld door de fusie van fluorescerende eiwitten met genen die specifiek tot expressie komen in doelceltypen, of met behulp van enhancer trap-lijnen (figuur 1). Talrijke weefsels en organen zijn ontleed in celtypen die specifieke fluorescerende markers in modelplanten en gewassen tot expressie brengen.
<p ...

Watch this Scientific Journal Video about Isolation and Transcriptome Analysis of Plant Cell Types at JoVE.com

Isolation and Transcriptome Analysis of Plant Cell Types

De haalbaarheid en effectiviteit van high-throughput scRNA-seq-methoden luiden een eencellig tijdperk in plantenonderzoek in. Hier wordt een robuuste en complete procedure gepresenteerd voor het isoleren van specifieke Arabidopsis thaliana wortelceltypen en de daaropvolgende transcriptoombibliotheekconstructie en -analyse.

Isolatie en transcriptoomanalyse van plantenceltypen

In multicellular organisms, developmental programming and environmental responses can be highly divergent in different cell types or even within cells, ...

Transcriptoomanalyse op enkele cel- of celtypen kan het subtiele verschil van genexpressie detecteren dat wordt gemaskeerd door heterogeniteit, wat een krachtig hulpmiddel is om de uitgebreide intracellulaire regulerende mechanismen bloot te leggen. Fluorescentie geactiveerde celsortering gevolgd door RN-seq-analyse kan worden uitgevoerd op zowel eencellige als bulkceltypemodus met een hoge transcriptdetectiegevoeligheid en compatibiliteit met andere multi-omische benaderingen. Nieuwe gebruikers van dit protocol moeten aandacht besteden aan enkele stappen in de protoplastsortering en RNA-seq-bibliotheekvoorbereiding.Samen met Jun Zhang zal Dr.Rongrong Xie, een postdoc in ons laboratorium, helpen bij het demonstreren van de procedure. Om te beginnen, doe de Arabidopsis thaliana wild type en fluorescerende marker lijn zaden in 20% bleekmiddel en incuberen met behulp van een roterende incubator bij kamertemperatuur gedurende 15 minuten om de zaden te steriliseren. Spoel tijdens het werken op een steriele bank de zaden drie tot vijf keer af in dubbel gedestilleerd water.Plak de wild type en reporter line zaden op halfsterkte MS medium met 0,8% gewicht per volume agar. Stratificeer de planten gedurende twee dagen op vier graden Celsius. Laat ze vervolgens vijf dagen verticaal groeien bij 23 graden Celsius onder 16-uurs licht en 18-uurs donkere cycli.Ontdooi de protoplastische oplossingen die oplossing A en oplossing B worden genoemd voorzichtig op ijs voorafgaand aan het experiment. Knip de wortels van de planten af met een schoon mes of schaar en hak de wortels in stukjes van ongeveer 0,5 centimeter. Dompel de gehakte wortels onder in 1,5 milliliter oplossing B, gevolgd door een zachte rotatie bij kamertemperatuur gedurende 1,5 tot 2 uur.Filtreer de resulterende wortelprotoplasten door een zeefgaas van 40 micron en spoel het gaas af met één tot twee milliliter oplossing A.Centrifugeer de gecombineerde filtraten bij 300 G gedurende vijf minuten bij vier graden Celsius. Gooi het supernatant weg met behulp van een pipet, resuspensie van de celkorrel in 500 tot 600 microliter oplossing A en plaats deze onmiddellijk op ijs. Breng voor het sorteren van cellen de geresuspendeerde celoplossing over in een nieuwe reageerbuis van vijf milliliter.Vul de mantelvloeistoftank en controleer de afvaltank. Schakel vervolgens de fluorescentie-geactiveerde celsorteer- of FACS-machine in. Voer de instrumentinstellingen en automatische kalibratiestappen uit op de sorteerder.Selecteer de fluorescentiekanalen en gebruik een wild type plant zonder fluorescentie als basislijncontrole. Pas de sorteerpoort aan op basis van de fluorescentie-intensiteit en voorwaartse verstrooiing en zijverstrooiing singlets. Na het toevoegen van 500 microliter oplossing A in een opvangbuis van 1,5 milliliter, begint u met sorteren en verzamelt u 2.000 tot 3.000 cellen per buis.Plaats de monsters na het sorteren onmiddellijk op ijs. Centrifugeer de opvangbuis met de cellen bij 300 G en vier graden Celsius gedurende vijf minuten en verwijder het supernatant met een pipet. Neem twee microliter gesorteerde cellen en controleer op fluorescentie met behulp van een fluorescentiemicroscoop.Bewaar de gesorteerde cellen bij min 80 graden Celsius als ze niet onmiddellijk worden gebruikt. Voor het sorteren van een enkele celindex plaatst u de 96-putsplaat met membraan in de adapter. Kalibreer de positie van de plaat zodat de druppel in het middelste gat van de plaat valt.Verwijder het membraan van de 96-putplaat en plaats de 96-putplaat in de adapter. Selecteer de sorteermodus met één cel tijdens het sorteren. Voer het doelaantal gesorteerde cellen als één in en begin met sorteren.Voordat u met het experiment begint, reinigt u de bank met een oppervlakteontsmettingsmiddel en 75% ethanol. Gebruik alle apparatuur alleen voor het sequentiëren van bibliotheekvoorbereiding. Nadat u een microliter vers bereid mengsel A aan het gesorteerde monster hebt toegevoegd, maalt u het met een steriele stamper.Vul met behulp van RNAse-vrij water het volume aan tot 14 microliter. Breng vervolgens elk monster over in een dunwandige PCR-buis van 0,2 milliliter. Bereid vervolgens mengsel B.Voeg 4,4 microliter in mengsel B toe aan elke PCR-buis met monsters en meng door voorzichtig pipetteren.Incubeer de monsters bij 72 graden Celsius gedurende drie minuten. Na incubatie zet u de monsters onmiddellijk op ijs om de oligo dT te hybridiseren naar de poly-A-staart. Bereid het omgekeerde transcriptiereactiemengsel of mengsel C in een 21,6 microliter ervan voor elke buis die de monsters bevat.Onderwerp de monsters aan een omgekeerde transcriptiereactie in een gemeenschappelijk PCR-instrument volgens het reverse transcriptieprogramma. Voeg 40,8 microliter van het vers bereide voorversterkingsreactiemengsel of mengsel D toe aan het omgekeerde transcriptiereactieproduct en voer het voorversterkingsprogramma uit. De amplificatiecyclus kan worden bepaald door kwantitatieve PCR wanneer de reactie net de exponentiële fase ingaat.Om de voorversterkingsreactieproducten te zuiveren, brengt u de voorversterkte producten over van een PCR-buis naar een buis van 1,5 milliliter. Voeg 48 microliter AMPure XP-kralen toe aan elk monster en meng voorzichtig door pipetteren voor incubatie. Plaats de buisjes van 1,5 milliliter met de monsters en kralen gedurende vijf minuten op een magnetische scheidingsstandaard.Gooi het supernatant voorzichtig uit de monsters weg zonder de kralen te verstoren. Nadat je ze opnieuw hebt gesuspendeerd in 200 microliter 80% ethanol, plaats je ze nog eens drie minuten op de magnetische scheidingsstandaard. Na het weggooien van de ethanol die supernatant bevat, drogen de monsters aan de lucht in een buis gedurende 10 minuten.Resuspendeer de kralen in 20 microliter nucleasevrij water en incubeer gedurende vijf minuten bij kamertemperatuur. Plaats ze vervolgens vijf minuten op de magnetische scheidingsstandaard. Breng met behulp van een pipet 18 microliter van het supernatant van elke buis over in een nieuwe centrifugebuis van 1,5 milliliter.Volg ten slotte de stappen die in de tekst worden beschreven om de pre-bibliotheek te karakteriseren, gevolgd door bibliotheekconstructie, zuivering en kwantificering. De fluorescerende Arabidopsis thaliana markers lijnen werden ontwikkeld door fluorescerende eiwitten te fuseren met genen die specifiek tot expressie komen in doelceltypen of door gebruik te maken van enhancer trap lijnen. De fluorescentie-specifieke gemarkeerde protoplasten werden met succes gesorteerd op basis van de fluorescentie-intensiteit en voorwaartse verstrooiing en zijverstrooiing singlets.De gesorteerde cellen werden gevisualiseerd met behulp van brightfield- en fluorescentiebeeldvorming. De representatieve resultaten van de RNA-sequencing bibliotheek van ongeveer 2.000 xyleem pool pericycle cellen, laterale wortel primordiale cellen, endodermis of cortex cellen, en laterale wortel cap cellen worden getoond. Een kleine bibliotheek met primer- of adapterdimerpieken kan na grootteselectie nog steeds worden gesequenced.Een bibliotheek met een abnormale grootteverdeling duidde op een mislukte bibliotheekvoorbereiding. De genexpressiepatronen werden geanalyseerd. De genen verrijkt in een van de vier wortelceltypen werden geclusterd en weergegeven in een heatmap die de specificiteit van genexpressies tussen verschillende celtypen laat zien.Hoge kwaliteit en zuiverheid van doelcellen door middel van correcte gating en sortering en het voorkomen van RNA-degradatie zijn de sleutel tot succesvolle bibliotheekconstructie. Voor RNA-seq in de single cell-modus zijn onlangs verschillende methoden gemeld die zijn geïntegreerd met de unieke moleculaire identificatie die de prestaties aanzienlijk hebben verbeterd.

Research

JoVE Journal

Biology

Mating and Tetrad Separation of Chlamydomonas reinhardtii for Genetic Analysis

Mating and Tetrad Separation of Chlamydomonas reinhardtii for Genetic Analysis

Paring en Viertal Scheiding van Chlamydomonas reinhardtii Voor Genetische analyse

The unicellular green alga Chlamydomonas reinhardtii (Chlamydomonas) has become a popular organism for research in diverse areas of cell biology and ...

Fluorescence Activated Cell Sorting of Plant Protoplasts

Fluorescentie geactiveerde celsortering van plantenprotoplasten

High-resolution, cell type-specific analysis of gene expression greatly enhances understanding of developmental regulation and responses to environmental ...

Comprehensive Compositional Analysis of Plant Cell Walls (Lignocellulosic biomass) Part I: Lignin

Comprehensive Compositional Analysis of Plant Cell Walls Lignocellulosic biomass Part I: Lignin

Uitgebreide analyse van de samenstelling van de celwanden (lignocellulose biomassa) Deel I: Lignine

The need for renewable, carbon neutral, and sustainable raw materials for industry and society has become one of the most pressing issues for the 21st ...

Comprehensive Compositional Analysis of Plant Cell Walls (Lignocellulosic biomass) Part II: Carbohydrates

Comprehensive Compositional Analysis of Plant Cell Walls Lignocellulosic biomass Part II: Carbohydrates

Uitgebreide analyse van de samenstelling van de celwanden (lignocellulose biomassa) Deel II: Koolhydraten

A Novel Bayesian Change-point Algorithm for Genome-wide Analysis of Diverse ChIPseq Data Types

A Novel Bayesiaanse Change-point algoritme voor Genoom-brede analyse van diverse ChIPseq Data Types

ChIPseq is a widely used technique for investigating protein-DNA interactions. Read density profiles are generated by using next-sequencing of ...

Efficient and Rapid Isolation of Early-stage Embryos from Arabidopsis thaliana Seeds

Efficient and Rapid Isolation of Early-stage Embryos from Arabidopsis thaliana Seeds

Efficiënte en snelle isolatie van een vroeg stadium embryo&#39;s van<em&gt; Arabidopsis thaliana</em&gt; Zaden

In flowering plants, the embryo develops within a nourishing tissue - the endosperm - surrounded by the maternal seed integuments (or seed coat). As a ...

Metabolic Labeling and Membrane Fractionation for Comparative Proteomic Analysis of Arabidopsis thaliana Suspension Cell Cultures

Metabolic Labeling and Membrane Fractionation for Comparative Proteomic Analysis of Arabidopsis thaliana Suspension Cell Cultures

Metabole Labeling en Membrane Fractionation for Comparative Proteomic analyse van<em&gt; Arabidopsis thaliana</em&gt; Schorsing Celkweken

Plasma membrane microdomains are features based on the physical properties of the lipid and sterol environment and have particular roles in signaling ...

Isolation and Physiological Analysis of Mouse Cardiomyocytes

Isolatie en fysiologische analyse van de Muis Cardiomyocyten

Cardiomyocytes, the workhorse cell of the heart, contain exquisitely organized cytoskeletal and contractile elements that generate the contractile force ...

An Efficient Method for Quantitative, Single-cell Analysis of Chromatin Modification and Nuclear Architecture in Whole-mount Ovules in Arabidopsis

An Efficient Method for Quantitative, Single-cell Analysis of Chromatin Modification and Nuclear Architecture in Whole-mount Ovules in Arabidopsis

Een efficiënte methode voor kwantitatieve, single-cell analyse van chromatine modificatie en Nucleaire Architectuur in zijn geheel-mount Ovules in<em&gt; Arabidopsis</em

In flowering plants, the somatic-to-reproductive cell fate transition is marked by the specification of spore mother cells (SMCs) in floral organs of the ...

Isolation and Compositional Analysis of Plant Cuticle Lipid Polyester Monomers

Isolatie en analyse van de samenstelling van de Plant Nagelriem Lipid Polyester Monomeren

Terrestrial plants produce extracellular aliphatic biopolyesters that modify cell walls of specific tissues. Epidermal cells synthesize cutin, a polyester ...