Name: isolation and transcriptome analysis of plant cell types
Uploaded: 2023-04-07T12:40:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Isolation and Transcriptome Analysis of Plant Cell Types at JoVE.com

Nous avons mis en place ce protocole dans l’installation multi-omique unicellulaire de l’École d’agriculture et de biologie de l’Université Jiao Tong de Shanghai et avons été soutenus par la Fondation nationale des sciences naturelles de Chine (subvention n ° 32070608), le programme Pujiang de Shanghai (subvention n ° 20PJ1405800) et l’Université Jiao Tong de Shanghai (subvention n ° Agri-X20200202, 2019TPB05).

Le protocole suivant a été optimisé pour les semences de type sauvage (WT) d’A. thaliana sans fluorescence et les lignes marqueurs fluorescentes pour les types de cellules racinaires suivants : cellules péricycliques xylèmes-pôles (J0121), cellules initiales des racines latérales, cellules de la calotte radiculaire latérale (J3411), cellules de l’endoderme et du cortex (J0571) (Figure 1A). Toutes les lignées marqueurs ont été obtenues à partir d’une source commerci...

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	<li>Zhang, T. -. Q., Chen, Y., Liu, Y., Lin, W. -. H., Wang, J. -. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-cell+transcriptome+atlas+and+chromatin+accessibility+landscape+reveal+differentiation+trajectories+in+the+rice+root.">Single-cell transcriptome atlas and chromatin accessibility landscape reveal differentiation trajectories in the rice root.</a> Nature Communications. 12 (1), 2053 (2021).</li><li>Denyer, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spatiotemporal+developmental+trajectories+in+the+Arabidopsis+root+revealed+using+high-throughput+single-cell+RNA+sequencing.">Spatiotemporal developmental trajectories in the Arabidopsis root revealed using high-throughput single-cell RNA sequencing.</a> Developmental Cell. 48 (6), 840-852 (2019).</li><li>Liu, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transcriptional+landscape+of+rice+roots+at+the+single-cell+resolution.">Transcriptional landscape of rice roots at the single-cell resolution.</a> Molecular Plant. 14 (3), 384-394 (2021).</li><li>Liu, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Global+dynamic+molecular+profiling+of+stomatal+lineage+cell+development+by+single-cell+RNA+sequencing.">Global dynamic molecular profiling of stomatal lineage cell development by single-cell RNA sequencing.</a> Molecular Plant. 13 (8), 1178-1193 (2020).</li><li>Shahan, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+single-cell+Arabidopsis+root+atlas+reveals+developmental+trajectories+in+wild-type+and+cell+identity+mutants.">A single-cell Arabidopsis root atlas reveals developmental trajectories in wild-type and cell identity mutants.</a> Developmental Cell. 57 (4), 543-560 (2022).</li><li>Wendrich, J. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Vascular+transcription+factors+guide+plant+epidermal+responses+to+limiting+phosphate+conditions.">Vascular transcription factors guide plant epidermal responses to limiting phosphate conditions.</a> Science. 370 (6518), (2020).</li><li>Carter, A. D., Bonyadi, R., Gifford, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+use+of+fluorescence-activated+cell+sorting+in+studying+plant+development+and+environmental+responses.">The use of fluorescence-activated cell sorting in studying plant development and environmental responses.</a> The International Journal of Developmental Biology. 57 (6-8), 545-552 (2013).</li><li>Picelli, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Full-length+RNA-seq+from+single+cells+using+Smart-seq2.">Full-length RNA-seq from single cells using Smart-seq2.</a> Nature Protocols. 9 (1), 171-181 (2014).</li><li>Wang, X., He, Y., Zhang, Q., Ren, X., Zhang, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Direct+comparative+analyses+of+10X+genomics+chromium+and+Smart-seq2.">Direct comparative analyses of 10X genomics chromium and Smart-seq2.</a> Genomics Proteomics Bioinformatics. 19 (2), 253-266 (2021).</li><li>Serrano-Ron, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reconstruction+of+lateral+root+formation+through+single-cell+RNAsequencing+reveals+order+of+tissue+initiation.">Reconstruction of lateral root formation through single-cell RNAsequencing reveals order of tissue initiation.</a> Molecular Plant. 14 (8), 1362-1378 (2021).</li><li>Hashimshony, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CEL-Seq2:+Sensitive+highly-multiplexed+single-cell+RNA-Seq.">CEL-Seq2: Sensitive highly-multiplexed single-cell RNA-Seq.</a> Genome Biology. 17, 77 (2016).</li><li>Macaulay, I. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=G&amp;T-seq:+Parallel+sequencing+of+single-cell+genomes+and+transcriptomes.">G&amp;T-seq: Parallel sequencing of single-cell genomes and transcriptomes.</a> Nature Methods. 12 (6), 519-522 (2015).</li><li>Angermueller, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Parallel+single-cell+sequencing+links+transcriptional+and+epigenetic+heterogeneity.">Parallel single-cell sequencing links transcriptional and epigenetic heterogeneity.</a> Nature Methods. 13 (3), 229-232 (2016).</li><li>De Rybel, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+aux/IAA28+signaling+cascade+activates+GATA23-dependent+specification+of+lateral+root+founder+cell+identity.">A novel aux/IAA28 signaling cascade activates GATA23-dependent specification of lateral root founder cell identity.</a> Current Biology. 20 (19), 1697-1706 (2010).</li><li>Duncombe, S. G., Barnes, W. J., Anderson, C. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+the+delivery+and+behavior+of+cellulose+synthases+in+Arabidopsis+thaliana+using+confocal+microscopy.">Imaging the delivery and behavior of cellulose synthases in Arabidopsis thaliana using confocal microscopy.</a> Methods in Cell Biology. 160, 201-213 (2020).</li><li>Levy, S. E., Myers, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Advancements+in+next-generation+sequencing.">Advancements in next-generation sequencing.</a> Annual Review of Genomics and Human Genetics. 17 (1), 95-115 (2016).</li><li>Ooi, C. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-throughput+full-length+single-cell+mRNA-seq+of+rare+cells.">High-throughput full-length single-cell mRNA-seq of rare cells.</a> PLoS One. 12 (11), e0188510 (2017).</li><li>Pertea, M., Kim, D., Pertea, G. M., Leek, J. T., Salzberg, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transcript-level+expression+analysis+of+RNA-seq+experiments+with+HISAT,+StringTie+and+Ballgown.">Transcript-level expression analysis of RNA-seq experiments with HISAT, StringTie and Ballgown.</a> Nature Protocols. 11 (9), 1650-1667 (2016).</li><li>Tsyganov, K., Perry, A., Archer, S., Powell, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RNAsik:+A+Pipeline+for+complete+and+reproducible+RNA-seq+analysis+that+runs+anywhere+with+speed+and+ease.">RNAsik: A Pipeline for complete and reproducible RNA-seq analysis that runs anywhere with speed and ease.</a> Journal of Open Source Software. 3, 583 (2018).</li><li>Love, M. I., Huber, W., Anders, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Moderated+estimation+of+fold+change+and+dispersion+for+RNA-seq+data+with+DESeq2.">Moderated estimation of fold change and dispersion for RNA-seq data with DESeq2.</a> Genome Biology. 15 (12), 550 (2014).</li><li>Kamiya, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+MYB36+transcription+factor+orchestrates+Casparian+strip+formation.">The MYB36 transcription factor orchestrates Casparian strip formation.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 112 (33), 10533-10538 (2015).</li><li>Zhang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Two+types+of+bHLH+transcription+factor+determine+the+competence+of+the+pericycle+for+lateral+root+initiation.">Two types of bHLH transcription factor determine the competence of the pericycle for lateral root initiation.</a> Nature Plants. 7 (5), 633-643 (2021).</li><li>Haecker, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expression+dynamics+of+WOX+genes+mark+cell+fate+decisions+during+early+embryonic+patterning+in+Arabidopsis+thaliana.">Expression dynamics of WOX genes mark cell fate decisions during early embryonic patterning in Arabidopsis thaliana.</a> Development. 131 (3), 657-668 (2004).</li><li>Chen, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Auxin+overproduction+in+shoots+cannot+rescue+auxin+deficiencies+in+Arabidopsis+roots.">Auxin overproduction in shoots cannot rescue auxin deficiencies in Arabidopsis roots.</a> Plant Cell Physiol. 55 (6), 1072-1079 (2014).</li><li>Nichterwitz, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Laser+capture+microscopy+coupled+with+Smart-seq2+for+precise+spatial+transcriptomic+profiling.">Laser capture microscopy coupled with Smart-seq2 for precise spatial transcriptomic profiling.</a> Nature Communications. 7, 12139 (2016).</li><li>Long, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nurse+cell--derived+small+RNAs+define+paternal+epigenetic+inheritance+in+Arabidopsis.">Nurse cell--derived small RNAs define paternal epigenetic inheritance in Arabidopsis.</a> Science. 373 (6550), (2021).</li><li>Gutzat, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Arabidopsis+shoot+stem+cells+display+dynamic+transcription+and+DNA+methylation+patterns.">Arabidopsis shoot stem cells display dynamic transcription and DNA methylation patterns.</a> EMBO Journal. 39 (20), e103667 (2020).</li></ol>

Le protocole basé sur Smart-seq2 peut générer des bibliothèques de séquençage fiables à partir de plusieurs centaines de cellules8. La qualité du matériel de départ est essentielle pour la précision de l’analyse du transcriptome. FACS est un outil puissant pour préparer les cellules d’intérêt, mais cette procédure, en particulier l’étape de protomination, doit être optimisée pour les applications en usine. La microdissection par capture laser (LCM) ou les cellules disséqu?...

Les cellules sont l’unité fondamentale de tous les organismes vivants et remplissent des fonctions structurelles et physiologiques. Bien que les cellules des organismes multicellulaires montrent une synchronicité apparente, les cellules de différents types et les cellules individuelles présentent des différences dans leurs transcriptomes au cours du développement et des réponses environnementales. Le séquençage d’ARN unicellulaire à haut débit (scRNA-seq) fournit une puissance sans précédent pour comprendre l’hétérogénéité cellulaire. L’application de scRNA-seq en sciences végétales a contribué à la construction réussie d’un atlas des cellules végétales1, a été utilisée pour identifier les taxons cellulaires rares dans les tissus végétaux2, a fourni un aperçu de la composition des types cellulaires dans les tissus végétaux et a été utilisée pour identifier l’identité cellulaire et les fonctions importantes utilisées pendant le développement et la différenciation des plantes. De plus, il est possible de déduire des trajectoires de développement spatio-temporelles dans les tissus végétaux 1,2,3 pour découvrir de nouveaux gènes marqueurs4 et étudier les fonctions de facteurs de transcription importants5 en utilisant scRNA-seq afin de révéler la conservation évolutive d’un même type cellulaire chez différentes plantes3. Les stress abiotiques sont parmi les influences environnementales les plus importantes sur la croissance et le développement des plantes. En explorant les changements dans la composition des types cellulaires dans les tissus végétaux dans différentes conditions de traitement grâce au séquençage du transcriptome unicellulaire, on peut également résoudre le mécanisme de réponse au stress abiotique6.
Le potentiel de résolution de l’hétérogénéité transcriptionnelle entre les types cellulaires à l’aide du séquençage de l’ARNc dépend de la méthode d’isolement cellulaire et de la plate-forme de séquençage. Le tri cellulaire activé par fluorescence (FACS) est une technique largement utilisée pour isoler une sous-population de cellules pour scRNA-seq en fonction de la diffusion de la lumière et des propriétés de fluorescence des cellules. Le développement de lignes de marqueurs fluorescentes par la technologie transgénique a considérablement amélioré l’efficacité de l’isolement cellulaire par FACS7. La réalisation de scRNA-seq à l’aide de Smart-seq28 améliore encore la capacité à disséquer l’hétérogénéité cellulaire. La méthode Smart-seq2 a une bonne sensibilité pour la détection des gènes et peut détecter les gènes même avec une faible entréede transcrit 9. En plus de la collecte de types de cellules en vrac, les trieurs cellulaires modernes fournissent un format de tri à index unicellulaire, permettant l’analyse du transcriptome à une résolution de cellule unique en utilisant Smart-seq210 ou d’autres méthodes de séquençage d’ARN multiplexé, telles que CEL-seq211. Le tri unicellulaire ou de type cellulaire peut être potentiellement utilisé pour de nombreuses autres applications en aval, telles que les études multi-omiques parallèles12,13. Un protocole robuste et polyvalent est présenté ici pour isoler les types de cellules végétales, telles que les cellules péricycliques xylèmes, les cellules de la calotte radiculaire latérale, les cellules initiales des racines latérales, les cellules du cortex et les cellules endodermiques des racines des lignées cellulaires marqueurs d’Arabidopsis thaliana par FACS. Le protocole implique en outre la construction de la bibliothèque Smart-seq2 pour l’analyse du transcriptome en aval.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>0.22 &#181;m strainer</td>
			<td>Sorfa&#160;</td>
			<td>622110</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agar</td>
			<td>Yeasen</td>
			<td>70101ES76</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agilent fragment analyzer</td>
			<td>Aglient</td>
			<td>Aglient 5200</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agilent high-sensitivity DNA kit</td>
			<td>Aglient</td>
			<td>DNF-474-0500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ampure XP beads</td>
			<td>BECKMAN</td>
			<td>A63881</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Betaine</td>
			<td>yuanye</td>
			<td>S18046-100g</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bleach</td>
			<td>Mr Muscle</td>
			<td>FnBn83BK</td>
			<td>20% (v/v) bleach</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BSA</td>
			<td>sigma</td>
			<td>9048-46-8</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CaCl2</td>
			<td>yuanye</td>
			<td>S24109-500g</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cellulase R10</td>
			<td>Yakult (Japan)</td>
			<td>9012-54-8</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cellulase RS</td>
			<td>Yakult (Japan)</td>
			<td>9012-54-8</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge tube (1.5 mL)</td>
			<td>Eppendolf</td>
			<td>30121589</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNase, RNase, DNA and RNA Away Surface Decontaminants</td>
			<td>Beyotime</td>
			<td>R0127</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>dNTPs (10 mM)</td>
			<td>NEB</td>
			<td>N0447S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DTT (0.1 M)</td>
			<td> 
			invitrogen</td>
			<td>18090050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol</td>
			<td>Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd</td>
			<td>100092680</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FACS</td>
			<td>BD FACS Melody</td>
			<td>BD-65745</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FACS</td>
			<td>Sony</td>
			<td>SH800S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Filter tip&#160; (1000 &#181;L)</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>TF112-1000-Q</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Filter tip&#160; (200 &#181;L)</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>TF140-200-Q</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Filter tip (10 &#181;L)</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>TF104-10-Q</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Filter tip (100 &#181;L)</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>TF113-100-Q</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluorescent microscope</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>Eclipse Ni-E</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Four-Dimensional Rotating Mixer</td>
			<td>Kylin -Bell</td>
			<td>BE-1100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hemicellulase</td>
			<td>sigma</td>
			<td>9025-56-3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IS PCR primer</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>5&#39;-AAGCAGTGGTATCAACGCAGAG 
			T-3&#39;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KAPA HiFi HotStart ReadyMix(2X)</td>
			<td>Roche&#160;</td>
			<td>7958935001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KCl</td>
			<td>Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd</td>
			<td>7447-40-7</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Macerozyme R10</td>
			<td>Yakult (Japan)</td>
			<td>9032-75-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnetic separation stand</td>
			<td>invitrogen</td>
			<td>12321D</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mannitol</td>
			<td>aladdin</td>
			<td>69-65-8</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MES</td>
			<td>aladdin</td>
			<td>145224948</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MgCl2&#160;</td>
			<td>yuanye</td>
			<td>R21455-500ml</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microcentrifuges</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>Centrifuge 5425</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micro-mini-centrifuge</td>
			<td>Titan</td>
			<td>Timi-10k</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MS</td>
			<td>Phytotech</td>
			<td>M519</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nextera XT DNA Library Preparation Kit</td>
			<td>illumina</td>
			<td>FC-131-1024</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>oligo-dT30VN primer</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>5&#39;-AAGCAGTGGTATCAACGCAGAG 
			TACTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTT 
			TTTTTTTTTTVN-3&#39;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PCR instrument</td>
			<td>Thermal cycler</td>
			<td>A24811</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pectolyase</td>
			<td>Yakult (Japan)</td>
			<td>9033-35-6</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plant marker lines</td>
			<td>Nottingham Arabidopsis Stock Centre (NASC)</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Qubit 1x dsDNA HS Assay Kit</td>
			<td>invitrogen</td>
			<td>Q33231</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Qubit 2.0 fluorometer</td>
			<td>invitrogen</td>
			<td>Q32866</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNase inhibitor&#160;</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>EO0382</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNase-free water</td>
			<td>invitrogen</td>
			<td>10977023</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Solution A</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>400 mM mannitol, 0.05 % BSA , 20 mM MES (pH5.7), 10 mM CaCl2, 20 mM KCl</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Solution B</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>1 % (w/v)cellulase R10, 1 % (w/v) cellulase RS, 1 %&#160; (w/v)hemicellulase, 0.5 %&#160; (w/v)pectolyase and 1 %&#160; (w/v) Macerozyme R10 of in a fresh aliquot of solution A</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile pestle</td>
			<td>BIOTREAT</td>
			<td>453463</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Strainer (40 &#181;m )</td>
			<td>Sorfa&#160;</td>
			<td>251100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Superscript enzyme (200 U/&#181;L)</td>
			<td>invitrogen</td>
			<td>18090050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SuperScript VI buffer (5x)</td>
			<td>invitrogen</td>
			<td>18090050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T0est tube (5 mL)</td>
			<td>BD Falcon</td>
			<td>352052</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thin-walled PCR tubes with caps (0.5 mL)</td>
			<td>AXYGEN</td>
			<td>PCR-05-C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>Sangon Biotech</td>
			<td>A600198-0500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TSO primer</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>5&#39;-AAGCAGTGGTATCAACGCAGAG 
			TACATrGrG+G-3&#39;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vortex</td>
			<td>Titan</td>
			<td>VM-T2</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

isolation and transcriptome analysis of plant cell types

Dans les organismes multicellulaires, la programmation du développement et les réponses environnementales peuvent être très divergentes dans différents types de cellules ou même au sein des cellules, ce qui est connu sous le nom d’hétérogénéité cellulaire. Ces dernières années, l’isolement unicellulaire et de type cellulaire combiné aux techniques de séquençage de nouvelle génération (NGS) sont devenus des outils importants pour étudier les processus biologiques à résolution unicellulaire. Cependant, l’isolement des cellules végétales est relativement plus difficile en raison de la présence de parois cellulaires végétales, ce qui limite l’application d’approches unicellulaires chez les plantes. Ce protocole décrit une procédure robuste pour l’isolement unicellulaire et de type cellulaire basé sur le tri activé par fluorescence (FACS) avec des cellules végétales, qui convient à l’analyse multi-omique en aval et à d’autres études. À l’aide de lignes de marqueurs fluorescents racinaires d’Arabidopsis , nous démontrons comment des types de cellules particuliers, tels que les cellules péricycliques xylèmes, les cellules initiales des racines latérales, les cellules de la calotte radiculaire latérale, les cellules du cortex et les cellules endodermiques, sont isolés. En outre, une méthode efficace d’analyse du transcriptome en aval utilisant Smart-seq2 est également fournie. La méthode d’isolement cellulaire et les techniques d’analyse du transcriptome peuvent être adaptées à d’autres types de cellules et espèces végétales et ont un large potentiel d’application en phytotechnie.

Isolation du protoplaste Ce protocole est efficace pour le tri des protoplastes des lignées marqueurs radiculaires fluorescentes d’A. thaliana. Ces lignées de marqueurs ont été développées par la fusion de protéines fluorescentes avec des gènes exprimés spécifiquement dans les types de cellules cibles, ou en utilisant des lignes de pièges amplificateurs (Figure 1). De nombreux tissus et organes ont été disséqués en types cellulaires exprimant des...

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Isolation and Transcriptome Analysis of Plant Cell Types

La faisabilité et l’efficacité des méthodes de séquençage de l’ARNc à haut débit annoncent une ère unicellulaire dans la recherche sur les plantes. La présente ici est une procédure robuste et complète pour isoler des types spécifiques de cellules racinaires d’Arabidopsis thaliana et la construction et l’analyse ultérieures de la bibliothèque de transcriptomes.

Isolement et analyse transcriptome de types de cellules végétales

In multicellular organisms, developmental programming and environmental responses can be highly divergent in different cell types or even within cells, ...

L’analyse du transcriptome sur une seule cellule ou des types de cellules peut détecter la différence subtile d’expression génique masquée par l’hétérogénéité, ce qui est un outil puissant pour découvrir les mécanismes de régulation intracellulaires élaborés. Le tri cellulaire activé par fluorescence suivi d’une analyse RN-seq peut être effectué en mode cellule unique ou en vrac avec une sensibilité de détection de transcrit élevée et une compatibilité avec d’autres approches multi-omiques. Les nouveaux utilisateurs de ce protocole doivent prêter attention à certaines étapes du tri des protoplastes et de la préparation de la bibliothèque RNA-seq.Avec Jun Zhang, le Dr Rongrong Xie, post-doctorant dans notre laboratoire, aidera à démontrer la procédure. Pour commencer, mettez les graines de type sauvage et de lignée de marqueurs fluorescents d’Arabidopsis thaliana dans de l’eau de Javel à 20% et incuber à l’aide d’un incubateur rotatif à température ambiante pendant 15 minutes pour stériliser les graines. Tout en travaillant sur un banc stérile, rincer les graines trois à cinq fois dans de l’eau distillée double.Écôler les graines de la lignée sauvage et reporter sur un milieu MS à demi-concentration avec une gélose de 0,8 % en poids par volume. Stratifier les plantes pendant deux jours à quatre degrés Celsius. Ensuite, cultivez-les verticalement pendant cinq jours à 23 degrés Celsius sous des cycles de lumière de 16 heures et d’obscurité de 18 heures.Décongeler doucement les solutions protoplastiques appelées solution A et solution B sur de la glace avant l’expérience. Coupez les racines des plantes à l’aide d’une lame propre ou de ciseaux et coupez les racines en morceaux d’environ 0,5 centimètre. Immerger les racines hachées dans 1,5 millilitre de solution B suivie d’une rotation douce à température ambiante pendant 1,5 à 2 heures.Filtrer les protoplastes racinaires obtenus à travers un filet de crépine de 40 microns et rincer le filet avec un à deux millilitres de solution A.Centrifuger les filtrats combinés à 300 G pendant cinq minutes à quatre degrés Celsius. Jeter le surnageant à l’aide d’une pipette, remettre en suspension la pastille de cellule dans 500 à 600 microlitres de solution A et la placer immédiatement sur de la glace. Pour le tri des cellules, transférer la solution cellulaire remise en suspension dans un nouveau tube à essai de cinq millilitres.Remplissez le réservoir de liquide de gaine et vérifiez le réservoir de déchets. Allumez ensuite la machine de tri cellulaire activée par fluorescence ou FACS. Effectuez les étapes de configuration et d’auto-étalonnage de l’instrument sur le trieur.Sélectionnez les canaux de fluorescence et utilisez une plante de type sauvage sans fluorescence comme témoin de base. Ajustez la porte de tri en fonction de l’intensité de fluorescence et des singlets de diffusion vers l’avant et à diffusion latérale. Après avoir ajouté 500 microlitres de solution A dans un tube de collecte de 1,5 millilitre, commencez à trier et collectez 2 000 à 3 000 cellules par tube.Après le tri, placez immédiatement les échantillons sur de la glace. Centrifuger le tube collecteur contenant les cellules à 300 G et quatre degrés Celsius pendant cinq minutes et retirer le surnageant à l’aide d’une pipette. Prenez deux microlitres de cellules triées et vérifiez la fluorescence à l’aide d’un microscope à fluorescence.Conservez les cellules triées à moins 80 degrés Celsius si elles ne sont pas utilisées immédiatement. Pour le tri de l’index unicellulaire, placez la plaque de 96 puits avec membrane dans l’adaptateur. Calibrer la position de la plaque de sorte que la gouttelette tombe dans le trou central de la plaque.Retirez la membrane de la plaque de 96 puits et placez la plaque de 96 puits dans l’adaptateur. Sélectionnez le mode de tri d’une seule cellule lors du tri. Entrez le nombre cible de cellules triées en une seule et commencez le tri.Avant de commencer l’expérience, nettoyez le banc avec un décontaminant de surface et de l’éthanol à 75%. Utilisez tout l’équipement uniquement pour la préparation de la bibliothèque de séquençage. Après avoir ajouté un microlitre de mélange A fraîchement préparé dans l’échantillon trié, broyez-le avec un pilon stérile.En utilisant de l’eau libre d’ARNase, porter le volume à 14 microlitres. Transférez ensuite chaque échantillon dans un tube PCR à paroi mince de 0,2 millilitre. Ajouter ensuite le mélange B.Ajouter 4,4 microlitres dans le mélange B à chaque tube de PCR contenant des échantillons et mélanger par pipetage doux.Incuber les échantillons à 72 degrés Celsius pendant trois minutes. Après l’incubation, mettre immédiatement les échantillons sur de la glace pour hybrider l’oligo dT à la queue poly-A. Préparer le mélange réactionnel de transcription inverse ou le mélange C dans 21,6 microlitres de celui-ci dans chaque tube contenant les échantillons.Soumettre les échantillons à une réaction de transcription inverse dans un instrument de PCR commun selon le programme de transcription inverse. Ajouter 40,8 microlitres du mélange réactionnel de préamplification fraîchement préparé ou du mélange D au produit de réaction de transcription inverse et exécuter le programme de préamplification. Le cycle d’amplification peut être déterminé par PCR quantitative lorsque la réaction entre dans la phase exponentielle.Pour purifier les produits de réaction de préamplification, transférer les produits préamplifiés d’un tube PCR vers un tube de 1,5 millilitre. Ajouter 48 microlitres de billes AMPure XP dans chaque échantillon et mélanger délicatement par pipetage avant incubation. Placez les tubes de 1,5 millilitre contenant les échantillons et les perles sur un support de séparation magnétique pendant cinq minutes.Jetez soigneusement le surnageant des échantillons sans déranger les perles. Après les avoir remis en suspension dans 200 microlitres d’éthanol à 80%, placez-les sur le support de séparation magnétique pendant trois minutes supplémentaires. Après avoir éliminé le surnageant contenant de l’éthanol, sécher les échantillons à l’air libre dans un tube pendant 10 minutes.Remettez les billes en suspension dans 20 microlitres d’eau sans nucléase et incuber à température ambiante pendant cinq minutes. Ensuite, placez-les sur le support de séparation magnétique pendant cinq minutes. À l’aide d’une pipette, transférer 18 microlitres du surnageant de chaque tube dans un nouveau tube à centrifuger de 1,5 millilitre.Enfin, suivez les étapes décrites dans le texte pour caractériser la pré-bibliothèque, suivies de la construction, de la purification et de la quantification de la bibliothèque. Les lignées de marqueurs fluorescents d’Arabidopsis thaliana ont été développées en fusionnant des protéines fluorescentes avec des gènes exprimés spécifiquement dans les types de cellules cibles ou en utilisant des lignes de piégeage d’amplificateur. Les protoplastes marqués spécifiques à la fluorescence ont été triés avec succès en fonction de l’intensité de fluorescence et des singlets à diffusion vers l’avant et à diffusion latérale.Les cellules triées ont été visualisées à l’aide de l’imagerie en fond clair et en fluorescence. Les résultats représentatifs de la bibliothèque de séquençage de l’ARN d’environ 2 000 cellules péricycliques xylèmes, cellules primordiales racines latérales, cellules endodermiques ou cortex et cellules de la calotte radiculaire latérale sont présentés. Une bibliothèque de petite taille avec des pics de dimères d’amorce ou d’adaptateur peut toujours être séquencée après la sélection de la taille.Une bibliothèque avec une distribution de taille anormale indiquait un échec de la préparation de la bibliothèque. Les profils d’expression génique ont été analysés. Les gènes enrichis dans l’un des quatre types de cellules racinaires ont été regroupés et représentés dans une carte thermique montrant la spécificité des expressions géniques parmi les différents types cellulaires.La haute qualité et la pureté des cellules cibles grâce à un contrôle et à un tri corrects et à la prévention de la dégradation de l’ARN sont essentielles à la construction réussie de la bibliothèque. Pour le séquençage de l’ARN en mode cellule unique, plusieurs méthodes intégrées à l’identifiant moléculaire unique ont été rapportées récemment, ce qui a considérablement amélioré les performances.

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