Name: isolation and transcriptome analysis of plant cell types
Uploaded: 2023-04-07T12:40:00
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Wir haben dieses Protokoll in der Einzelzell-Multi-Omics-Einrichtung der School of Agriculture and Biology der Shanghai Jiao Tong University eingerichtet und wurden von der National Natural Science Foundation of China (Grant No. 32070608), dem Shanghai Pujiang Program (Grant No. 20PJ1405800) und der Shanghai Jiao Tong University (Grant Nos. Agri-X20200202, 2019TPB05) unterstützt.

Das folgende Protokoll wurde für A. thaliana-Wildtyp-Samen (WT) ohne Fluoreszenz- und Fluoreszenzmarkerlinien für die folgenden Wurzelzelltypen optimiert: Xylempol-Pericycluszellen (J0121), laterale Wurzelinitialzellen, laterale Wurzelkappenzellen (J3411), Endodermis- und Cortexzellen (J0571) (Abbildung 1A). Alle Markierungslinien wurden aus einer kommerziellen Quelle gewonnen (siehe Materialtabelle), mit Ausnahme der Lateralwurzel-Initiationszell-Markerlinie, die...

<ol>
	<li>Zhang, T. -. Q., Chen, Y., Liu, Y., Lin, W. -. H., Wang, J. -. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-cell+transcriptome+atlas+and+chromatin+accessibility+landscape+reveal+differentiation+trajectories+in+the+rice+root.">Single-cell transcriptome atlas and chromatin accessibility landscape reveal differentiation trajectories in the rice root.</a> Nature Communications. 12 (1), 2053 (2021).</li><li>Denyer, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spatiotemporal+developmental+trajectories+in+the+Arabidopsis+root+revealed+using+high-throughput+single-cell+RNA+sequencing.">Spatiotemporal developmental trajectories in the Arabidopsis root revealed using high-throughput single-cell RNA sequencing.</a> Developmental Cell. 48 (6), 840-852 (2019).</li><li>Liu, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transcriptional+landscape+of+rice+roots+at+the+single-cell+resolution.">Transcriptional landscape of rice roots at the single-cell resolution.</a> Molecular Plant. 14 (3), 384-394 (2021).</li><li>Liu, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Global+dynamic+molecular+profiling+of+stomatal+lineage+cell+development+by+single-cell+RNA+sequencing.">Global dynamic molecular profiling of stomatal lineage cell development by single-cell RNA sequencing.</a> Molecular Plant. 13 (8), 1178-1193 (2020).</li><li>Shahan, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+single-cell+Arabidopsis+root+atlas+reveals+developmental+trajectories+in+wild-type+and+cell+identity+mutants.">A single-cell Arabidopsis root atlas reveals developmental trajectories in wild-type and cell identity mutants.</a> Developmental Cell. 57 (4), 543-560 (2022).</li><li>Wendrich, J. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Vascular+transcription+factors+guide+plant+epidermal+responses+to+limiting+phosphate+conditions.">Vascular transcription factors guide plant epidermal responses to limiting phosphate conditions.</a> Science. 370 (6518), (2020).</li><li>Carter, A. D., Bonyadi, R., Gifford, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+use+of+fluorescence-activated+cell+sorting+in+studying+plant+development+and+environmental+responses.">The use of fluorescence-activated cell sorting in studying plant development and environmental responses.</a> The International Journal of Developmental Biology. 57 (6-8), 545-552 (2013).</li><li>Picelli, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Full-length+RNA-seq+from+single+cells+using+Smart-seq2.">Full-length RNA-seq from single cells using Smart-seq2.</a> Nature Protocols. 9 (1), 171-181 (2014).</li><li>Wang, X., He, Y., Zhang, Q., Ren, X., Zhang, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Direct+comparative+analyses+of+10X+genomics+chromium+and+Smart-seq2.">Direct comparative analyses of 10X genomics chromium and Smart-seq2.</a> Genomics Proteomics Bioinformatics. 19 (2), 253-266 (2021).</li><li>Serrano-Ron, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reconstruction+of+lateral+root+formation+through+single-cell+RNAsequencing+reveals+order+of+tissue+initiation.">Reconstruction of lateral root formation through single-cell RNAsequencing reveals order of tissue initiation.</a> Molecular Plant. 14 (8), 1362-1378 (2021).</li><li>Hashimshony, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CEL-Seq2:+Sensitive+highly-multiplexed+single-cell+RNA-Seq.">CEL-Seq2: Sensitive highly-multiplexed single-cell RNA-Seq.</a> Genome Biology. 17, 77 (2016).</li><li>Macaulay, I. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=G&amp;T-seq:+Parallel+sequencing+of+single-cell+genomes+and+transcriptomes.">G&amp;T-seq: Parallel sequencing of single-cell genomes and transcriptomes.</a> Nature Methods. 12 (6), 519-522 (2015).</li><li>Angermueller, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Parallel+single-cell+sequencing+links+transcriptional+and+epigenetic+heterogeneity.">Parallel single-cell sequencing links transcriptional and epigenetic heterogeneity.</a> Nature Methods. 13 (3), 229-232 (2016).</li><li>De Rybel, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+aux/IAA28+signaling+cascade+activates+GATA23-dependent+specification+of+lateral+root+founder+cell+identity.">A novel aux/IAA28 signaling cascade activates GATA23-dependent specification of lateral root founder cell identity.</a> Current Biology. 20 (19), 1697-1706 (2010).</li><li>Duncombe, S. G., Barnes, W. J., Anderson, C. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+the+delivery+and+behavior+of+cellulose+synthases+in+Arabidopsis+thaliana+using+confocal+microscopy.">Imaging the delivery and behavior of cellulose synthases in Arabidopsis thaliana using confocal microscopy.</a> Methods in Cell Biology. 160, 201-213 (2020).</li><li>Levy, S. E., Myers, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Advancements+in+next-generation+sequencing.">Advancements in next-generation sequencing.</a> Annual Review of Genomics and Human Genetics. 17 (1), 95-115 (2016).</li><li>Ooi, C. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-throughput+full-length+single-cell+mRNA-seq+of+rare+cells.">High-throughput full-length single-cell mRNA-seq of rare cells.</a> PLoS One. 12 (11), e0188510 (2017).</li><li>Pertea, M., Kim, D., Pertea, G. M., Leek, J. T., Salzberg, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transcript-level+expression+analysis+of+RNA-seq+experiments+with+HISAT,+StringTie+and+Ballgown.">Transcript-level expression analysis of RNA-seq experiments with HISAT, StringTie and Ballgown.</a> Nature Protocols. 11 (9), 1650-1667 (2016).</li><li>Tsyganov, K., Perry, A., Archer, S., Powell, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RNAsik:+A+Pipeline+for+complete+and+reproducible+RNA-seq+analysis+that+runs+anywhere+with+speed+and+ease.">RNAsik: A Pipeline for complete and reproducible RNA-seq analysis that runs anywhere with speed and ease.</a> Journal of Open Source Software. 3, 583 (2018).</li><li>Love, M. I., Huber, W., Anders, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Moderated+estimation+of+fold+change+and+dispersion+for+RNA-seq+data+with+DESeq2.">Moderated estimation of fold change and dispersion for RNA-seq data with DESeq2.</a> Genome Biology. 15 (12), 550 (2014).</li><li>Kamiya, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+MYB36+transcription+factor+orchestrates+Casparian+strip+formation.">The MYB36 transcription factor orchestrates Casparian strip formation.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 112 (33), 10533-10538 (2015).</li><li>Zhang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Two+types+of+bHLH+transcription+factor+determine+the+competence+of+the+pericycle+for+lateral+root+initiation.">Two types of bHLH transcription factor determine the competence of the pericycle for lateral root initiation.</a> Nature Plants. 7 (5), 633-643 (2021).</li><li>Haecker, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expression+dynamics+of+WOX+genes+mark+cell+fate+decisions+during+early+embryonic+patterning+in+Arabidopsis+thaliana.">Expression dynamics of WOX genes mark cell fate decisions during early embryonic patterning in Arabidopsis thaliana.</a> Development. 131 (3), 657-668 (2004).</li><li>Chen, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Auxin+overproduction+in+shoots+cannot+rescue+auxin+deficiencies+in+Arabidopsis+roots.">Auxin overproduction in shoots cannot rescue auxin deficiencies in Arabidopsis roots.</a> Plant Cell Physiol. 55 (6), 1072-1079 (2014).</li><li>Nichterwitz, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Laser+capture+microscopy+coupled+with+Smart-seq2+for+precise+spatial+transcriptomic+profiling.">Laser capture microscopy coupled with Smart-seq2 for precise spatial transcriptomic profiling.</a> Nature Communications. 7, 12139 (2016).</li><li>Long, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nurse+cell--derived+small+RNAs+define+paternal+epigenetic+inheritance+in+Arabidopsis.">Nurse cell--derived small RNAs define paternal epigenetic inheritance in Arabidopsis.</a> Science. 373 (6550), (2021).</li><li>Gutzat, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Arabidopsis+shoot+stem+cells+display+dynamic+transcription+and+DNA+methylation+patterns.">Arabidopsis shoot stem cells display dynamic transcription and DNA methylation patterns.</a> EMBO Journal. 39 (20), e103667 (2020).</li></ol>

Das Smart-seq2-basierte Protokoll kann zuverlässige Sequenzierungsbibliotheken aus mehreren hundert Zellenerzeugen 8. Die Qualität des Ausgangsmaterials ist entscheidend für die Genauigkeit der Transkriptomanalyse. FACS ist ein leistungsfähiges Werkzeug für die Präparation von Zellen von Interesse, aber dieses Verfahren, insbesondere der Protoplasting-Schritt, muss für pflanzliche Anwendungen optimiert werden. Laser-Capture-Mikrodissektion (LCM) oder manuell präparierte Zellen können auch...

Zellen sind die Grundeinheit aller Lebewesen und erfüllen strukturelle und physiologische Funktionen. Obwohl die Zellen in mehrzelligen Organismen eine scheinbare Synchronizität aufweisen, weisen Zellen verschiedener Typen und einzelne Zellen Unterschiede in ihren Transkriptomen während der Entwicklung und der Umweltreaktionen auf. Die Hochdurchsatz-Einzelzell-RNA-Sequenzierung (scRNA-seq) bietet eine noch nie dagewesene Leistung für das Verständnis der zellulären Heterogenität. Die Anwendung von scRNA-seq in den Pflanzenwissenschaften hat zur erfolgreichen Erstellung eines Pflanzenzellatlas1 beigetragen, wurde zur Identifizierung seltener zellulärer Taxa in Pflanzengeweben2 verwendet, hat Einblicke in die Zusammensetzung von Zelltypen in Pflanzengeweben geliefert und wurde verwendet, um die zelluläre Identität und wichtige Funktionen zu identifizieren, die bei der Entwicklung und Differenzierung von Pflanzen eine Rolle spielen. Darüber hinaus ist es möglich, räumlich-zeitliche Entwicklungsverläufe in Pflanzengeweben 1,2,3 abzuleiten, um neue Markergene4 zu entdecken und die Funktionen wichtiger Transkriptionsfaktoren5 mit Hilfe von scRNA-seq zu untersuchen, um die evolutionäre Konservierung desselben Zelltyps in verschiedenen Pflanzen aufzudecken 3. Abiotische Belastungen gehören zu den wichtigsten Umwelteinflüssen auf das Wachstum und die Entwicklung von Pflanzen. Indem man die Veränderungen in der Zusammensetzung von Zelltypen in Pflanzengeweben unter verschiedenen Behandlungsbedingungen durch Einzelzell-Transkriptom-Sequenzierung untersucht, kann man auch den abiotischen Stressreaktionsmechanismus aufklären6.
Das Potenzial für die Auflösung der transkriptionellen Heterogenität zwischen Zelltypen durch scRNA-Sequenzierung hängt von der Zellisolationsmethode und der Sequenzierungsplattform ab. Die fluoreszenzaktivierte Zellsortierung (FACS) ist eine weit verbreitete Technik zur Isolierung einer Subpopulation von Zellen für scRNA-seq basierend auf Lichtstreuung und den Fluoreszenzeigenschaften der Zellen. Die Entwicklung von fluoreszierenden Markerlinien mittels transgener Technologie hat die Effizienz der Zellisolierung durch FACS7 erheblich verbessert. Die Durchführung von scRNA-seq mit Smart-seq28 verbessert die Fähigkeit, die zelluläre Heterogenität zu analysieren. Die Smart-seq2-Methode hat eine gute Sensitivität für den Gennachweis und kann Gene auch mit einem geringen Transkripteintrag nachweisen9. Zusätzlich zur Massenerfassung von Zelltypen bieten moderne Zellsortierer ein Einzelzell-Index-Sortierformat, das eine Transkriptomanalyse mit Einzelzellauflösung unter Verwendung von Smart-seq210 oder anderen gemultiplexten RNA-seq-Methoden, wie z. B. CEL-seq211, ermöglicht. Die Einzelzell- oder Zellsortierung kann potenziell für viele andere nachgelagerte Anwendungen verwendet werden, z. B. für parallele Multi-Omics-Studien12,13. Hier wird ein robustes und vielseitiges Protokoll zur Isolierung von Pflanzenzelltypen, wie z.B. Xylempol-Pericyclenzellen, lateralen Wurzelkappenzellen, lateralen Wurzelinitialzellen, Kortexzellen und endodermalen Zellen aus den Wurzeln von Arabidopsis thaliana-Markerzelllinien mittels FACS vorgestellt. Das Protokoll beinhaltet außerdem den Aufbau der Smart-seq2-Bibliothek für die nachgelagerte Transkriptomanalyse.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>0.22 &#181;m strainer</td>
			<td>Sorfa&#160;</td>
			<td>622110</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agar</td>
			<td>Yeasen</td>
			<td>70101ES76</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agilent fragment analyzer</td>
			<td>Aglient</td>
			<td>Aglient 5200</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agilent high-sensitivity DNA kit</td>
			<td>Aglient</td>
			<td>DNF-474-0500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ampure XP beads</td>
			<td>BECKMAN</td>
			<td>A63881</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Betaine</td>
			<td>yuanye</td>
			<td>S18046-100g</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bleach</td>
			<td>Mr Muscle</td>
			<td>FnBn83BK</td>
			<td>20% (v/v) bleach</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BSA</td>
			<td>sigma</td>
			<td>9048-46-8</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CaCl2</td>
			<td>yuanye</td>
			<td>S24109-500g</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cellulase R10</td>
			<td>Yakult (Japan)</td>
			<td>9012-54-8</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cellulase RS</td>
			<td>Yakult (Japan)</td>
			<td>9012-54-8</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge tube (1.5 mL)</td>
			<td>Eppendolf</td>
			<td>30121589</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNase, RNase, DNA and RNA Away Surface Decontaminants</td>
			<td>Beyotime</td>
			<td>R0127</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>dNTPs (10 mM)</td>
			<td>NEB</td>
			<td>N0447S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DTT (0.1 M)</td>
			<td> 
			invitrogen</td>
			<td>18090050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol</td>
			<td>Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd</td>
			<td>100092680</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FACS</td>
			<td>BD FACS Melody</td>
			<td>BD-65745</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FACS</td>
			<td>Sony</td>
			<td>SH800S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Filter tip&#160; (1000 &#181;L)</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>TF112-1000-Q</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Filter tip&#160; (200 &#181;L)</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>TF140-200-Q</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Filter tip (10 &#181;L)</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>TF104-10-Q</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Filter tip (100 &#181;L)</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>TF113-100-Q</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluorescent microscope</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>Eclipse Ni-E</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Four-Dimensional Rotating Mixer</td>
			<td>Kylin -Bell</td>
			<td>BE-1100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hemicellulase</td>
			<td>sigma</td>
			<td>9025-56-3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IS PCR primer</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>5&#39;-AAGCAGTGGTATCAACGCAGAG 
			T-3&#39;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KAPA HiFi HotStart ReadyMix(2X)</td>
			<td>Roche&#160;</td>
			<td>7958935001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KCl</td>
			<td>Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd</td>
			<td>7447-40-7</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Macerozyme R10</td>
			<td>Yakult (Japan)</td>
			<td>9032-75-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnetic separation stand</td>
			<td>invitrogen</td>
			<td>12321D</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mannitol</td>
			<td>aladdin</td>
			<td>69-65-8</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MES</td>
			<td>aladdin</td>
			<td>145224948</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MgCl2&#160;</td>
			<td>yuanye</td>
			<td>R21455-500ml</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microcentrifuges</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>Centrifuge 5425</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micro-mini-centrifuge</td>
			<td>Titan</td>
			<td>Timi-10k</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MS</td>
			<td>Phytotech</td>
			<td>M519</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nextera XT DNA Library Preparation Kit</td>
			<td>illumina</td>
			<td>FC-131-1024</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>oligo-dT30VN primer</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>5&#39;-AAGCAGTGGTATCAACGCAGAG 
			TACTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTT 
			TTTTTTTTTTVN-3&#39;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PCR instrument</td>
			<td>Thermal cycler</td>
			<td>A24811</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pectolyase</td>
			<td>Yakult (Japan)</td>
			<td>9033-35-6</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plant marker lines</td>
			<td>Nottingham Arabidopsis Stock Centre (NASC)</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Qubit 1x dsDNA HS Assay Kit</td>
			<td>invitrogen</td>
			<td>Q33231</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Qubit 2.0 fluorometer</td>
			<td>invitrogen</td>
			<td>Q32866</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNase inhibitor&#160;</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>EO0382</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNase-free water</td>
			<td>invitrogen</td>
			<td>10977023</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Solution A</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>400 mM mannitol, 0.05 % BSA , 20 mM MES (pH5.7), 10 mM CaCl2, 20 mM KCl</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Solution B</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>1 % (w/v)cellulase R10, 1 % (w/v) cellulase RS, 1 %&#160; (w/v)hemicellulase, 0.5 %&#160; (w/v)pectolyase and 1 %&#160; (w/v) Macerozyme R10 of in a fresh aliquot of solution A</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile pestle</td>
			<td>BIOTREAT</td>
			<td>453463</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Strainer (40 &#181;m )</td>
			<td>Sorfa&#160;</td>
			<td>251100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Superscript enzyme (200 U/&#181;L)</td>
			<td>invitrogen</td>
			<td>18090050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SuperScript VI buffer (5x)</td>
			<td>invitrogen</td>
			<td>18090050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T0est tube (5 mL)</td>
			<td>BD Falcon</td>
			<td>352052</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thin-walled PCR tubes with caps (0.5 mL)</td>
			<td>AXYGEN</td>
			<td>PCR-05-C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>Sangon Biotech</td>
			<td>A600198-0500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TSO primer</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>5&#39;-AAGCAGTGGTATCAACGCAGAG 
			TACATrGrG+G-3&#39;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vortex</td>
			<td>Titan</td>
			<td>VM-T2</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

isolation and transcriptome analysis of plant cell types

In mehrzelligen Organismen können die Entwicklungsprogrammierung und die Umweltreaktionen in verschiedenen Zelltypen oder sogar innerhalb von Zellen sehr unterschiedlich sein, was als zelluläre Heterogenität bezeichnet wird. In den letzten Jahren haben sich Einzelzell- und Zelltypisolierungen in Kombination mit Next-Generation-Sequencing-Techniken (NGS) zu wichtigen Werkzeugen entwickelt, um biologische Prozesse mit Einzelzellauflösung zu untersuchen. Die Isolierung von Pflanzenzellen ist jedoch aufgrund des Vorhandenseins von pflanzlichen Zellwänden relativ schwierig, was die Anwendung von Einzelzellansätzen in Pflanzen einschränkt. Dieses Protokoll beschreibt ein robustes Verfahren zur Fluoreszenz-aktivierten Zellsortierung (FACS)-basierten Einzelzell- und Zelltypisolierung mit Pflanzenzellen, das sich für nachgelagerte Multi-Omics-Analysen und andere Studien eignet. Anhand von Arabidopsis-Wurzel-Fluoreszenzmarkerlinien zeigen wir, wie bestimmte Zelltypen, wie z.B. Xylempol-Pericyclenzellen, laterale Wurzelinitialzellen, laterale Wurzelkappenzellen, Kortexzellen und endodermale Zellen, isoliert werden. Darüber hinaus wird eine effektive Downstream-Transkriptom-Analysemethode unter Verwendung von Smart-seq2 bereitgestellt. Die Zellisolationsmethode und die Transkriptomanalysetechniken können auf andere Zelltypen und Pflanzenarten übertragen werden und haben ein breites Anwendungspotenzial in den Pflanzenwissenschaften.

Isolierung von Protoplasten Dieses Protokoll ist effektiv für die Protoplastensortierung von fluoreszierenden A. thaliana-Wurzelmarkerlinien . Diese Markerlinien wurden durch die Fusion von fluoreszierenden Proteinen mit Genen, die spezifisch in Zielzelltypen exprimiert werden, oder durch die Verwendung von Enhancer-Fallenlinien entwickelt (Abbildung 1). Zahlreiche Gewebe und Organe wurden in Zelltypen zerlegt, die spezifische Fluoreszenzmarker in Modellpflanzen...

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Isolation and Transcriptome Analysis of Plant Cell Types

Die Machbarkeit und Effektivität von Hochdurchsatz-scRNA-seq-Methoden läutet eine Einzelzell-Ära in der Pflanzenforschung ein. Hier wird ein robustes und vollständiges Verfahren zur Isolierung spezifischer Arabidopsis thaliana-Wurzelzelltypen und zum anschließenden Aufbau und zur Analyse von Transkriptombibliotheken vorgestellt.

Isolierung und Transkriptomanalyse pflanzlicher Zelltypen

In multicellular organisms, developmental programming and environmental responses can be highly divergent in different cell types or even within cells, ...

Die Transkriptomanalyse an einzelnen Zellen oder Zelltypen kann den feinen Unterschied der Genexpression erkennen, der durch Heterogenität maskiert wird, was ein leistungsfähiges Werkzeug ist, um die ausgeklügelten intrazellulären Regulationsmechanismen aufzudecken. Die fluoreszenzaktivierte Zellsortierung mit anschließender RN-seq-Analyse kann entweder im Einzelzell- oder Massenzellmodus mit hoher Transkriptdetektionsempfindlichkeit und Kompatibilität mit anderen Multi-Omik-Ansätzen durchgeführt werden. Erstanwender dieses Protokolls müssen auf einige Schritte bei der Protoplastensortierung und der Vorbereitung der RNA-seq-Bibliothek achten.Zusammen mit Jun Zhang wird Dr. Rongrong Xie, ein Postdoktorand in unserem Labor, bei der Demonstration des Verfahrens helfen. Geben Sie zunächst die Samen des Wildtyps Arabidopsis thaliana und der fluoreszierenden Markierungslinie in 20%iges Bleichmittel und inkubieren Sie sie 15 Minuten lang mit einem rotierenden Inkubator bei Raumtemperatur, um die Samen zu sterilisieren. Während Sie auf einer sterilen Werkbank arbeiten, spülen Sie die Samen drei- bis fünfmal in doppelt destilliertem Wasser ab.Die Samen des Wildtyps und der Reporterlinie werden auf halbstarkem MS-Medium mit 0,8 Gew.-% pro Volumen-Agar angerichtet. Stratieren Sie die Pflanzen zwei Tage lang bei vier Grad Celsius. Dann züchten Sie sie fünf Tage lang vertikal bei 23 Grad Celsius unter 16-stündigen Licht- und 18-stündigen Dunkelzyklen.Tauen Sie die protoplasting Lösungen, die als Lösung A und Lösung B bezeichnet werden, vor dem Experiment vorsichtig auf Eis auf. Schneiden Sie die Wurzeln mit einer sauberen Klinge oder Schere von den Pflanzen ab und hacken Sie die Wurzeln in ca. 0,5 Zentimeter große Stücke. Tauchen Sie die gehackten Wurzeln in 1,5 Milliliter Lösung B und drehen Sie sie anschließend 1,5 bis 2 Stunden lang vorsichtig bei Raumtemperatur.Filtern Sie die resultierenden Wurzelprotoplasten durch ein 40-Mikron-Siebgewebe und spülen Sie das Gewebe mit ein bis zwei Millilitern Lösung A. Zentrifugieren Sie die kombinierten Filtrate bei 300 G fünf Minuten lang bei vier Grad Celsius. Entsorgen Sie den Überstand mit einer Pipette, resuspendieren Sie das Zellpellet in 500 bis 600 Mikrolitern Lösung A und legen Sie es sofort auf Eis. Zur Zellsortierung wird die resuspendierte Zelllösung in ein neues Fünf-Milliliter-Reagenzglas überführt.Füllen Sie den Mantelflüssigkeitstank und überprüfen Sie den Fäkalientank. Schalten Sie dann die fluoreszenzaktivierte Zellsortier- oder FACS-Maschine ein. Führen Sie die Schritte zum Einrichten des Geräts und zur automatischen Kalibrierung am Sortierer durch.Wählen Sie die Fluoreszenzkanäle aus und verwenden Sie eine Wildtyppflanze ohne Fluoreszenz als Basiskontrolle. Passen Sie den Sortierschieber basierend auf der Fluoreszenzintensität und den Singuletts der Vorwärtsstreuung und der Seitenstreuung an. Nachdem Sie 500 Mikroliter Lösung A in ein 1,5-Milliliter-Sammelröhrchen gegeben haben, beginnen Sie mit der Sortierung und sammeln Sie 2.000 bis 3.000 Zellen pro Röhrchen.Legen Sie die Proben nach dem Sortieren sofort auf Eis. Zentrifugieren Sie das Sammelröhrchen mit den Zellen bei 300 G und vier Grad Celsius für fünf Minuten und entfernen Sie den Überstand mit einer Pipette. Nehmen Sie zwei Mikroliter sortierte Zellen und prüfen Sie sie mit einem Fluoreszenzmikroskop auf Fluoreszenz.Lagern Sie die sortierten Zellen bei minus 80 Grad Celsius, wenn sie nicht sofort verwendet werden. Für die Sortierung des Einzelzellindex setzen Sie die 96-Well-Platte mit Membran in den Adapter ein. Kalibrieren Sie die Position der Platte so, dass der Tropfen in das mittlere Loch der Platte fällt.Entfernen Sie die Membran von der 96-Well-Platte und setzen Sie die 96-Well-Platte in den Adapter ein. Wählen Sie beim Sortieren den Sortiermodus für einzelne Zellen aus. Geben Sie die Zielanzahl der sortierten Zellen als eine ein und beginnen Sie mit der Sortierung.Bevor Sie mit dem Experiment beginnen, reinigen Sie die Bank mit einem Oberflächendekontaminationsmittel und 75%igem Ethanol. Verwenden Sie alle Geräte nur für die Vorbereitung der Sequenzierungsbibliothek. Nachdem Sie einen Mikroliter der frisch zubereiteten Mischung A in die sortierte Probe gegeben haben, mahlen Sie sie mit einem sterilen Stößel.Mit RNAse-freiem Wasser wird das Volumen auf 14 Mikroliter erhöht. Anschließend wird jede Probe in ein dünnwandiges 0,2-Milliliter-PCR-Röhrchen überführt. Bereiten Sie dann die Mischung B vor.Geben Sie 4,4 Mikroliter in Mischung B in jedes PCR-Röhrchen mit den Proben und mischen Sie es durch sanftes Pipettieren.Inkubieren Sie die Proben drei Minuten lang bei 72 Grad Celsius. Nach der Inkubation werden die Proben sofort auf Eis gelegt, um das Oligo dT mit dem Poly-A-Schwanz zu hybridisieren. Bereiten Sie das Reverse-Transkriptions-Reaktionsgemisch oder das Gemisch C in 21,6 Mikrolitern davon in jedem Röhrchen vor, das die Proben enthält.Die Proben werden einer reversen Transkriptionsreaktion in einem gängigen PCR-Gerät gemäß dem reversen Transkriptionsprogramm unterzogen. Fügen Sie dem Produkt der reversen Transkriptionsreaktion 40,8 Mikroliter der frisch zubereiteten Voramplifikationsreaktionsmischung oder des Gemisches D hinzu und führen Sie das Voramplifikationsprogramm aus. Der Amplifikationszyklus kann durch quantitative PCR bestimmt werden, wenn die Reaktion gerade in die exponentielle Phase eintritt.Um die Produkte der Voramplifikationsreaktion aufzureinigen, werden die voramplifizierten Produkte aus einem PCR-Röhrchen in ein 1,5-Milliliter-Röhrchen überführt. Geben Sie 48 Mikroliter AMPure XP-Beads in jede Probe und mischen Sie sie vor der Inkubation vorsichtig durch Pipettieren. Legen Sie die 1,5-Milliliter-Röhrchen mit den Proben und Kügelchen für fünf Minuten auf einen magnetischen Trennständer.Entsorgen Sie den Überstand vorsichtig aus den Proben, ohne die Kügelchen zu stören. Nachdem Sie sie in 200 Mikrolitern 80%igem Ethanol resuspendiert haben, legen Sie sie für weitere drei Minuten auf den Magnetabscheideständer. Nachdem Sie den Ethanolüberstand verworfen haben, trocknen Sie die Proben 10 Minuten lang in einem Röhrchen an der Luft.Resuspendieren Sie die Kügelchen in 20 Mikrolitern nukleasefreiem Wasser und inkubieren Sie sie fünf Minuten lang bei Raumtemperatur. Legen Sie sie dann für fünf Minuten auf den magnetischen Trennständer. Übertragen Sie mit einer Pipette 18 Mikroliter des Überstands aus jedem Röhrchen in ein neues 1,5-Milliliter-Zentrifugenröhrchen.Befolgen Sie schließlich die im Text beschriebenen Schritte, um die Vorbibliothek zu charakterisieren, gefolgt von der Erstellung, Reinigung und Quantifizierung der Bibliothek. Die fluoreszierenden Arabidopsis thaliana-Markerlinien wurden durch die Fusion von fluoreszierenden Proteinen mit Genen, die spezifisch in Zielzelltypen exprimiert werden, oder durch die Verwendung von Enhancer-Trap-Linien entwickelt. Die fluoreszenzspezifisch markierten Protoplasten wurden erfolgreich anhand der Fluoreszenzintensität und der Vorwärtsstreuung und der seitlichen Streuung von Singuletts sortiert.Die sortierten Zellen wurden mittels Hellfeld- und Fluoreszenzbildgebung visualisiert. Die repräsentativen Ergebnisse der RNA-Sequenzierungsbibliothek von etwa 2.000 Xylempol-Pericycluszellen, lateralen Wurzelprimordialzellen, Endodermis- oder Cortexzellen und lateralen Wurzelkappenzellen werden gezeigt. Eine kleine Bibliothek mit Primer- oder Adapter-Dimer-Peaks konnte nach der Größenauswahl noch sequenziert werden.Eine Bibliothek mit einer abnormalen Größenverteilung deutete auf eine nicht erfolgreiche Bibliotheksvorbereitung hin. Die Genexpressionsmuster wurden analysiert. Die Gene, die in einem der vier Wurzelzelltypen angereichert waren, wurden geclustert und in einer Heatmap dargestellt, die die Spezifität der Genexpression zwischen verschiedenen Zelltypen zeigt.Hohe Qualität und Reinheit der Zielzellen durch korrektes Gating und Sortieren sowie die Verhinderung des RNA-Abbaus sind der Schlüssel zum erfolgreichen Bibliotheksaufbau. Für RNA-seq im Einzelzellmodus wurden kürzlich mehrere Methoden beschrieben, die mit dem eindeutigen molekularen Identifikator integriert sind und die Leistung signifikant verbessert haben.

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