Name: isolation and transcriptome analysis of plant cell types
Uploaded: 2023-04-07T12:40:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Isolation and Transcriptome Analysis of Plant Cell Types at JoVE.com

הקמנו פרוטוקול זה במתקן הרב-תאי היחיד של בית הספר לחקלאות וביולוגיה, אוניברסיטת ג'יאו טונג בשנחאי, ונתמכו על ידי הקרן הלאומית למדעי הטבע של סין (מענק מס '32070608), תוכנית שנחאי פוג'יאנג (מענק מס '20PJ1405800), ואוניברסיטת שנגחאי ג'יאו טונג (מענק מס 'Agri-X20200202, 2019TPB05).

הפרוטוקול הבא עבר אופטימיזציה עבור זרעי A. thaliana wild-type (WT) ללא קווי סמן פלואורסצנטי ופלואורסצנטי עבור סוגי תאי השורש הבאים: תאי פריסייקל בקוטב קסילם (J0121), תאי שורש ראשוניים לטרליים, תאי כובע שורש רוחביים (J3411), אנדודרמיס ותאי קליפת המוח (J0571) (איור 1A). כל קווי הסמנים התקבלו מ?...

<ol>
	<li>Zhang, T. -. Q., Chen, Y., Liu, Y., Lin, W. -. H., Wang, J. -. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-cell+transcriptome+atlas+and+chromatin+accessibility+landscape+reveal+differentiation+trajectories+in+the+rice+root.">Single-cell transcriptome atlas and chromatin accessibility landscape reveal differentiation trajectories in the rice root.</a> Nature Communications. 12 (1), 2053 (2021).</li><li>Denyer, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spatiotemporal+developmental+trajectories+in+the+Arabidopsis+root+revealed+using+high-throughput+single-cell+RNA+sequencing.">Spatiotemporal developmental trajectories in the Arabidopsis root revealed using high-throughput single-cell RNA sequencing.</a> Developmental Cell. 48 (6), 840-852 (2019).</li><li>Liu, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transcriptional+landscape+of+rice+roots+at+the+single-cell+resolution.">Transcriptional landscape of rice roots at the single-cell resolution.</a> Molecular Plant. 14 (3), 384-394 (2021).</li><li>Liu, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Global+dynamic+molecular+profiling+of+stomatal+lineage+cell+development+by+single-cell+RNA+sequencing.">Global dynamic molecular profiling of stomatal lineage cell development by single-cell RNA sequencing.</a> Molecular Plant. 13 (8), 1178-1193 (2020).</li><li>Shahan, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+single-cell+Arabidopsis+root+atlas+reveals+developmental+trajectories+in+wild-type+and+cell+identity+mutants.">A single-cell Arabidopsis root atlas reveals developmental trajectories in wild-type and cell identity mutants.</a> Developmental Cell. 57 (4), 543-560 (2022).</li><li>Wendrich, J. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Vascular+transcription+factors+guide+plant+epidermal+responses+to+limiting+phosphate+conditions.">Vascular transcription factors guide plant epidermal responses to limiting phosphate conditions.</a> Science. 370 (6518), (2020).</li><li>Carter, A. D., Bonyadi, R., Gifford, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+use+of+fluorescence-activated+cell+sorting+in+studying+plant+development+and+environmental+responses.">The use of fluorescence-activated cell sorting in studying plant development and environmental responses.</a> The International Journal of Developmental Biology. 57 (6-8), 545-552 (2013).</li><li>Picelli, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Full-length+RNA-seq+from+single+cells+using+Smart-seq2.">Full-length RNA-seq from single cells using Smart-seq2.</a> Nature Protocols. 9 (1), 171-181 (2014).</li><li>Wang, X., He, Y., Zhang, Q., Ren, X., Zhang, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Direct+comparative+analyses+of+10X+genomics+chromium+and+Smart-seq2.">Direct comparative analyses of 10X genomics chromium and Smart-seq2.</a> Genomics Proteomics Bioinformatics. 19 (2), 253-266 (2021).</li><li>Serrano-Ron, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reconstruction+of+lateral+root+formation+through+single-cell+RNAsequencing+reveals+order+of+tissue+initiation.">Reconstruction of lateral root formation through single-cell RNAsequencing reveals order of tissue initiation.</a> Molecular Plant. 14 (8), 1362-1378 (2021).</li><li>Hashimshony, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CEL-Seq2:+Sensitive+highly-multiplexed+single-cell+RNA-Seq.">CEL-Seq2: Sensitive highly-multiplexed single-cell RNA-Seq.</a> Genome Biology. 17, 77 (2016).</li><li>Macaulay, I. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=G&amp;T-seq:+Parallel+sequencing+of+single-cell+genomes+and+transcriptomes.">G&amp;T-seq: Parallel sequencing of single-cell genomes and transcriptomes.</a> Nature Methods. 12 (6), 519-522 (2015).</li><li>Angermueller, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Parallel+single-cell+sequencing+links+transcriptional+and+epigenetic+heterogeneity.">Parallel single-cell sequencing links transcriptional and epigenetic heterogeneity.</a> Nature Methods. 13 (3), 229-232 (2016).</li><li>De Rybel, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+aux/IAA28+signaling+cascade+activates+GATA23-dependent+specification+of+lateral+root+founder+cell+identity.">A novel aux/IAA28 signaling cascade activates GATA23-dependent specification of lateral root founder cell identity.</a> Current Biology. 20 (19), 1697-1706 (2010).</li><li>Duncombe, S. G., Barnes, W. J., Anderson, C. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+the+delivery+and+behavior+of+cellulose+synthases+in+Arabidopsis+thaliana+using+confocal+microscopy.">Imaging the delivery and behavior of cellulose synthases in Arabidopsis thaliana using confocal microscopy.</a> Methods in Cell Biology. 160, 201-213 (2020).</li><li>Levy, S. E., Myers, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Advancements+in+next-generation+sequencing.">Advancements in next-generation sequencing.</a> Annual Review of Genomics and Human Genetics. 17 (1), 95-115 (2016).</li><li>Ooi, C. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-throughput+full-length+single-cell+mRNA-seq+of+rare+cells.">High-throughput full-length single-cell mRNA-seq of rare cells.</a> PLoS One. 12 (11), e0188510 (2017).</li><li>Pertea, M., Kim, D., Pertea, G. M., Leek, J. T., Salzberg, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transcript-level+expression+analysis+of+RNA-seq+experiments+with+HISAT,+StringTie+and+Ballgown.">Transcript-level expression analysis of RNA-seq experiments with HISAT, StringTie and Ballgown.</a> Nature Protocols. 11 (9), 1650-1667 (2016).</li><li>Tsyganov, K., Perry, A., Archer, S., Powell, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RNAsik:+A+Pipeline+for+complete+and+reproducible+RNA-seq+analysis+that+runs+anywhere+with+speed+and+ease.">RNAsik: A Pipeline for complete and reproducible RNA-seq analysis that runs anywhere with speed and ease.</a> Journal of Open Source Software. 3, 583 (2018).</li><li>Love, M. I., Huber, W., Anders, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Moderated+estimation+of+fold+change+and+dispersion+for+RNA-seq+data+with+DESeq2.">Moderated estimation of fold change and dispersion for RNA-seq data with DESeq2.</a> Genome Biology. 15 (12), 550 (2014).</li><li>Kamiya, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+MYB36+transcription+factor+orchestrates+Casparian+strip+formation.">The MYB36 transcription factor orchestrates Casparian strip formation.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 112 (33), 10533-10538 (2015).</li><li>Zhang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Two+types+of+bHLH+transcription+factor+determine+the+competence+of+the+pericycle+for+lateral+root+initiation.">Two types of bHLH transcription factor determine the competence of the pericycle for lateral root initiation.</a> Nature Plants. 7 (5), 633-643 (2021).</li><li>Haecker, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expression+dynamics+of+WOX+genes+mark+cell+fate+decisions+during+early+embryonic+patterning+in+Arabidopsis+thaliana.">Expression dynamics of WOX genes mark cell fate decisions during early embryonic patterning in Arabidopsis thaliana.</a> Development. 131 (3), 657-668 (2004).</li><li>Chen, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Auxin+overproduction+in+shoots+cannot+rescue+auxin+deficiencies+in+Arabidopsis+roots.">Auxin overproduction in shoots cannot rescue auxin deficiencies in Arabidopsis roots.</a> Plant Cell Physiol. 55 (6), 1072-1079 (2014).</li><li>Nichterwitz, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Laser+capture+microscopy+coupled+with+Smart-seq2+for+precise+spatial+transcriptomic+profiling.">Laser capture microscopy coupled with Smart-seq2 for precise spatial transcriptomic profiling.</a> Nature Communications. 7, 12139 (2016).</li><li>Long, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nurse+cell--derived+small+RNAs+define+paternal+epigenetic+inheritance+in+Arabidopsis.">Nurse cell--derived small RNAs define paternal epigenetic inheritance in Arabidopsis.</a> Science. 373 (6550), (2021).</li><li>Gutzat, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Arabidopsis+shoot+stem+cells+display+dynamic+transcription+and+DNA+methylation+patterns.">Arabidopsis shoot stem cells display dynamic transcription and DNA methylation patterns.</a> EMBO Journal. 39 (20), e103667 (2020).</li></ol>

הפרוטוקול מבוסס Smart-seq2 יכול ליצור ספריות רצף אמינות מכמה מאות תאים8. איכות חומר המוצא חיונית לדיוק ניתוח התמלול. FACS הוא כלי רב עוצמה להכנת תאים מעניינים, אך הליך זה, במיוחד השלב הפרוטו-מתמשך, חייב להיות מותאם ליישומים צמחיים. מיקרודיסקציה ללכידת לייזר (LCM) או תאים מנותחים ידנית י...

תאים הם היחידה הבסיסית של כל האורגניזמים החיים ומבצעים פונקציות מבניות ופיזיולוגיות. למרות שהתאים באורגניזמים רב-תאיים מראים סינכרוניות לכאורה, תאים מסוגים שונים ותאים בודדים מציגים הבדלים בתעתיק שלהם במהלך ההתפתחות ובתגובות סביבתיות. ריצוף RNA חד-תאי בתפוקה גבוהה (scRNA-seq) מספק עוצמה חסרת תקדים להבנת הטרוגניות תאית. יישום scRNA-seq במדעי הצמח תרם לבנייה מוצלחת של אטלס תאי צמח1, שימש לזיהוי טקסים תאיים נדירים ברקמות צמח2, סיפק תובנה לגבי הרכב סוגי התאים ברקמות צמחים, ושימש לזיהוי זהות תאית ופונקציות חשובות המשמשות במהלך התפתחות והתמיינות צמחים. בנוסף, ניתן להסיק מסלולי התפתחות מרחביים-זמניים ברקמות צמחים 1,2,3 כדי לגלות גנים חדשים של סמן4 ולחקור את תפקודם של גורמי שעתוק חשובים5 באמצעות scRNA-seq כדי לחשוף את השימור האבולוציוני של אותו סוג תא בצמחים שונים3. עקה אביוטית היא בין ההשפעות הסביבתיות החשובות ביותר על גדילה והתפתחות של צמחים. על ידי חקירת השינויים בהרכב סוגי התאים ברקמות צמחים בתנאי טיפול שונים באמצעות ריצוף שעתוק חד-תאי, ניתן גם לפתור את מנגנון תגובת העקה הא-ביוטית6.
הפוטנציאל לפתרון הטרוגניות שעתוק בין סוגי תאים באמצעות ריצוף scRNA תלוי בשיטת בידוד התאים ובפלטפורמת הריצוף. מיון תאים המופעלים על ידי פלואורסצנטיות (FACS) היא טכניקה נפוצה לבידוד תת-אוכלוסייה של תאים עבור scRNA-seq בהתבסס על פיזור האור והתכונות הפלואורסצנטיות של התאים. פיתוח קווי סמן פלואורסצנטיים על ידי טכנולוגיה טרנסגנית שיפר מאוד את יעילות בידוד התאים על ידי FACS7. ביצוע scRNA-seq באמצעות Smart-seq28 משפר עוד יותר את היכולת לנתח את ההטרוגניות התאית. לשיטת Smart-seq2 יש רגישות טובה לזיהוי גנים והיא יכולה לזהות גנים גם עם קלט תעתיק נמוך9. בנוסף לאיסוף סוגי תאים בתפזורת, ממייני תאים מודרניים מספקים תבנית מיון אינדקס של תא יחיד, המאפשרת ניתוח תעתיק ברזולוציה של תא בודד באמצעות Smart-seq210 או שיטות RNA-seq מרובות אחרות, כגון CEL-seq211. מיון תא בודד או סוג תא יכול לשמש פוטנציאלית עבור יישומים רבים אחרים במורד הזרם, כגון מחקרי מולטי-אומיקה מקבילים12,13. מוצג כאן פרוטוקול חזק ורב-תכליתי לבידוד סוגי תאי צמחים, כגון תאי פריסייקל בקוטב קסילם, תאי כובע שורש רוחביים, תאי שורש ראשוניים רוחביים, תאי קליפת המוח ותאים אנדודרמליים משורשי קווי תאי סמן Arabidopsis thaliana על ידי FACS. הפרוטוקול כולל גם בניית ספריית Smart-seq2 לניתוח תמלול במורד הזרם.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>0.22 &#181;m strainer</td>
			<td>Sorfa&#160;</td>
			<td>622110</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agar</td>
			<td>Yeasen</td>
			<td>70101ES76</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agilent fragment analyzer</td>
			<td>Aglient</td>
			<td>Aglient 5200</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agilent high-sensitivity DNA kit</td>
			<td>Aglient</td>
			<td>DNF-474-0500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ampure XP beads</td>
			<td>BECKMAN</td>
			<td>A63881</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Betaine</td>
			<td>yuanye</td>
			<td>S18046-100g</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bleach</td>
			<td>Mr Muscle</td>
			<td>FnBn83BK</td>
			<td>20% (v/v) bleach</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BSA</td>
			<td>sigma</td>
			<td>9048-46-8</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CaCl2</td>
			<td>yuanye</td>
			<td>S24109-500g</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cellulase R10</td>
			<td>Yakult (Japan)</td>
			<td>9012-54-8</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cellulase RS</td>
			<td>Yakult (Japan)</td>
			<td>9012-54-8</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge tube (1.5 mL)</td>
			<td>Eppendolf</td>
			<td>30121589</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNase, RNase, DNA and RNA Away Surface Decontaminants</td>
			<td>Beyotime</td>
			<td>R0127</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>dNTPs (10 mM)</td>
			<td>NEB</td>
			<td>N0447S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DTT (0.1 M)</td>
			<td> 
			invitrogen</td>
			<td>18090050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol</td>
			<td>Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd</td>
			<td>100092680</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FACS</td>
			<td>BD FACS Melody</td>
			<td>BD-65745</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FACS</td>
			<td>Sony</td>
			<td>SH800S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Filter tip&#160; (1000 &#181;L)</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>TF112-1000-Q</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Filter tip&#160; (200 &#181;L)</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>TF140-200-Q</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Filter tip (10 &#181;L)</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>TF104-10-Q</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Filter tip (100 &#181;L)</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>TF113-100-Q</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluorescent microscope</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>Eclipse Ni-E</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Four-Dimensional Rotating Mixer</td>
			<td>Kylin -Bell</td>
			<td>BE-1100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hemicellulase</td>
			<td>sigma</td>
			<td>9025-56-3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IS PCR primer</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>5&#39;-AAGCAGTGGTATCAACGCAGAG 
			T-3&#39;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KAPA HiFi HotStart ReadyMix(2X)</td>
			<td>Roche&#160;</td>
			<td>7958935001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KCl</td>
			<td>Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd</td>
			<td>7447-40-7</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Macerozyme R10</td>
			<td>Yakult (Japan)</td>
			<td>9032-75-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnetic separation stand</td>
			<td>invitrogen</td>
			<td>12321D</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mannitol</td>
			<td>aladdin</td>
			<td>69-65-8</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MES</td>
			<td>aladdin</td>
			<td>145224948</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MgCl2&#160;</td>
			<td>yuanye</td>
			<td>R21455-500ml</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microcentrifuges</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>Centrifuge 5425</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micro-mini-centrifuge</td>
			<td>Titan</td>
			<td>Timi-10k</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MS</td>
			<td>Phytotech</td>
			<td>M519</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nextera XT DNA Library Preparation Kit</td>
			<td>illumina</td>
			<td>FC-131-1024</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>oligo-dT30VN primer</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>5&#39;-AAGCAGTGGTATCAACGCAGAG 
			TACTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTT 
			TTTTTTTTTTVN-3&#39;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PCR instrument</td>
			<td>Thermal cycler</td>
			<td>A24811</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pectolyase</td>
			<td>Yakult (Japan)</td>
			<td>9033-35-6</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plant marker lines</td>
			<td>Nottingham Arabidopsis Stock Centre (NASC)</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Qubit 1x dsDNA HS Assay Kit</td>
			<td>invitrogen</td>
			<td>Q33231</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Qubit 2.0 fluorometer</td>
			<td>invitrogen</td>
			<td>Q32866</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNase inhibitor&#160;</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>EO0382</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNase-free water</td>
			<td>invitrogen</td>
			<td>10977023</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Solution A</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>400 mM mannitol, 0.05 % BSA , 20 mM MES (pH5.7), 10 mM CaCl2, 20 mM KCl</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Solution B</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>1 % (w/v)cellulase R10, 1 % (w/v) cellulase RS, 1 %&#160; (w/v)hemicellulase, 0.5 %&#160; (w/v)pectolyase and 1 %&#160; (w/v) Macerozyme R10 of in a fresh aliquot of solution A</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile pestle</td>
			<td>BIOTREAT</td>
			<td>453463</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Strainer (40 &#181;m )</td>
			<td>Sorfa&#160;</td>
			<td>251100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Superscript enzyme (200 U/&#181;L)</td>
			<td>invitrogen</td>
			<td>18090050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SuperScript VI buffer (5x)</td>
			<td>invitrogen</td>
			<td>18090050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T0est tube (5 mL)</td>
			<td>BD Falcon</td>
			<td>352052</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thin-walled PCR tubes with caps (0.5 mL)</td>
			<td>AXYGEN</td>
			<td>PCR-05-C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>Sangon Biotech</td>
			<td>A600198-0500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TSO primer</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>5&#39;-AAGCAGTGGTATCAACGCAGAG 
			TACATrGrG+G-3&#39;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vortex</td>
			<td>Titan</td>
			<td>VM-T2</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

isolation and transcriptome analysis of plant cell types

באורגניזמים רב-תאיים, תכנות התפתחותי ותגובות סביבתיות יכולים להיות שונים מאוד בסוגי תאים שונים או אפילו בתוך תאים, מה שידוע בשם הטרוגניות תאית. בשנים האחרונות, בידוד תא בודד וסוג תא בשילוב עם טכניקות ריצוף הדור הבא (NGS) הפכו לכלים חשובים לחקר תהליכים ביולוגיים ברזולוציה של תא יחיד. עם זאת, בידוד תאי צמח הוא יחסית קשה יותר בשל נוכחותם של קירות תאי הצמח, אשר מגביל את היישום של גישות חד-תאיות בצמחים. פרוטוקול זה מתאר הליך חזק למיון תאים המופעלים על ידי פלואורסצנטיות (FACS) המבוסס על בידוד תא בודד וסוג תא עם תאי צמחים, המתאים לניתוח מולטי-אומיקס במורד הזרם ולמחקרים אחרים. באמצעות שימוש בקווי סמן פלואורסצנטיים של שורש Arabidopsis אנו מדגימים כיצד סוגי תאים מסוימים, כגון תאי פריסייקל של קוטב קסילם, תאי שורש ראשוניים רוחביים, תאי כובע שורש רוחביים, תאי קליפת המוח ותאים אנדודרמליים, מבודדים. יתר על כן, שיטת ניתוח תמלול יעילה במורד הזרם באמצעות Smart-seq2 מסופקת גם כן. שיטת בידוד התאים וטכניקות ניתוח התעתיק ניתנות להתאמה לסוגי תאים אחרים ולמיני צמחים ויש להן פוטנציאל יישום רחב במדעי הצמח.

בידוד פרוטופלסט פרוטוקול זה יעיל למיון פרוטופלסטים של קווי סמן שורש פלואורסצנטי A. thaliana . קווי הסמנים האלה פותחו על-ידי מיזוג של חלבונים פלואורסצנטיים עם גנים שמתבטאים באופן ספציפי בסוגי תאי מטרה, או על-ידי שימוש בקווי מלכודת משפרים (איור 1). רקמות ואיברים רב?...

Watch this Scientific Journal Video about Isolation and Transcriptome Analysis of Plant Cell Types at JoVE.com

Isolation and Transcriptome Analysis of Plant Cell Types

ההיתכנות והיעילות של שיטות scRNA-seq בעלות תפוקה גבוהה מבשרות על עידן חד-תאי בחקר צמחים. מוצג כאן הליך חזק ומלא לבידוד סוגי תאי שורש ספציפיים של Arabidopsis thaliana ובנייה וניתוח של ספריית שעתוק לאחר מכן.

בידוד וניתוח שעתוק של סוגי תאי צמח

In multicellular organisms, developmental programming and environmental responses can be highly divergent in different cell types or even within cells, ...

ניתוח שעתוק על תאים בודדים או סוגי תאים יכול לזהות את ההבדל העדין של ביטוי גנים להיות מוסווה על ידי הטרוגניות, שהוא כלי רב עוצמה כדי לחשוף את מנגנוני הבקרה התוך-תאיים המשוכללים. מיון תאים מופעל פלואורסצנטי ואחריו ניתוח RN-seq יכול להתבצע במצב תא בודד או סוג תא בתפזורת עם רגישות גבוהה לזיהוי תעתיק ותאימות עם גישות מולטי-אומיות אחרות. משתמשים בפעם הראשונה של פרוטוקול זה צריכים לשים לב כמה שלבים במיון protoplast והכנת ספריית RNA-seq.יחד עם ג'ון ג'אנג, ד"ר Rongrong Xie, פוסט-דוקטורנט במעבדה שלנו, יעזור להדגים את ההליך. כדי להתחיל, לשים את Arabidopsis thaliana סוג בר סמן קו זרעים פלואורסצנטי ב 20% אקונומיקה לדגור באמצעות אינקובטור מסתובב בטמפרטורת החדר במשך 15 דקות כדי לעקר את הזרעים. בזמן העבודה על ספסל סטרילי, שוטפים את הזרעים שלוש עד חמש פעמים במים מזוקקים כפולים.צלחת את סוג הבר ואת זרעי קו כתב על מדיום MS חצי חוזק עם 0.8% משקל לכל אגר נפח. לרבד את הצמחים במשך יומיים בארבע מעלות צלזיוס. לאחר מכן גדל אותם אנכית במשך חמישה ימים ב 23 מעלות צלזיוס תחת 16 שעות אור ו 18 שעות חושך מחזורים.הפשירו בעדינות את התמיסות הפרוטו-עמידות המכונות תמיסה A ותמיסה B על קרח לפני הניסוי. חותכים את השורשים מהצמחים בעזרת להב נקי או מספריים וקוצצים את השורשים לחתיכות של כ-0.5 ס"מ. השקיעו את השורשים הקצוצים במיליליטר 1.5 של תמיסה B ולאחר מכן סיבוב עדין בטמפרטורת החדר למשך שעה וחצי עד שעתיים.מסננים את פרוטופלסטי השורש המתקבלים דרך רשת מסננת של 40 מיקרון ושוטפים את הרשת במיליליטר אחד עד שניים של תמיסה A.צנטריפוגה התסנין המשולב ב 300 גרם למשך חמש דקות בארבע מעלות צלזיוס. השליכו את הסופרנאטנט בעזרת פיפטה, השהו מחדש את גלולת התא ב-500 עד 600 מיקרוליטר של תמיסה A, והניחו אותה מיד על קרח. למיון תאים, העבר את תמיסת התאים המרחפים למבחנה חדשה של חמישה מיליליטר.מלאו את מיכל נוזל הנדן ובדקו את מיכל האשפה. לאחר מכן הפעל את מיון התאים המופעל על ידי פלואורסצנטיות או את מכונת FACS. בצע את שלבי הגדרת המכשיר והכיול האוטומטי במיון.בחר את תעלות הפלואורסצנטיות והשתמש בצמח מסוג בר ללא פלואורסצנטיות כבקרה בסיסית. התאימו את שער המיון בהתאם לעוצמת הפלואורסצנטיות ולפיזור הקדמי ולפיזור הצדדי. לאחר הוספת 500 מיקרוליטר של פתרון A לתוך צינור איסוף 1.5 מיליליטר, להתחיל מיון ולאסוף 2, 000 עד 3, 000 תאים לכל צינור.לאחר המיון, מיד מניחים את הדגימות על קרח. צנטריפוגה את צינור האיסוף המכיל את התאים ב 300 G וארבע מעלות צלזיוס במשך חמש דקות ולהסיר את supernatant עם פיפטה. קחו שני מיקרוליטרים של תאים ממוינים ובדקו אם יש פלואורסצנטיות באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי.אחסן את התאים הממוינים בטמפרטורה של מינוס 80 מעלות צלזיוס אם לא נעשה בהם שימוש מיידי. למיון אינדקס תא יחיד, מקם את צלחת 96 הבארות עם הממברנה למתאם. כיילו את מיקום הצלחת כך שהטיפה תיפול בחור המרכזי של הצלחת.הסר את הממברנה מהצלחת של 96 בארות והכנס את צלחת 96 הבארות למתאם. בחר מצב מיון של תא בודד בעת המיון. הזן את מספר היעד של התאים הממוינים כאחד והתחל במיון.לפני תחילת הניסוי, נקו את הספסל עם מזהם פני השטח ואתנול 75%. השתמש בכל הציוד רק להכנת רצף הספרייה. לאחר הוספת מיקרוליטר אחד של תערובת טרייה מוכנה A לתוך מדגם ממוין, לטחון אותו עם מזיק סטרילי.באמצעות מים נטולי RNAse, לפצות את נפח 14 מיקרוליטר. לאחר מכן להעביר כל דגימה לתוך 0.2 מיליליטר דק דופן PCR צינור. לאחר מכן מכינים תערובת B.מוסיפים 4.4 מיקרוליטר בתערובת B לכל צינור PCR המכיל דגימות ומערבבים בפיפטינג עדין.לדגור על הדגימות ב 72 מעלות צלזיוס במשך שלוש דקות. לאחר הדגירה, מיד לשים את הדגימות על קרח כדי הכלאה של אוליגו dT לזנב poly-A. הכינו את תערובת תגובת השעתוק ההפוך או תערובת C ב-21.6 מיקרוליטר ממנה לכל צינור המכיל את הדגימות.הכפיפו את הדגימות לתגובת שעתוק לאחור במכשיר PCR נפוץ לפי תוכנית התמלול ההפוך. הוסף 40.8 מיקרוליטר של תערובת תגובת קדם-הגברה טרייה שהוכנה מראש או תערובת D למוצר תגובת השעתוק לאחור והפעל את תוכנית קדם-הגברה. מחזור ההגברה יכול להיקבע על ידי PCR כמותי כאשר התגובה רק נכנסת לשלב המעריכי.כדי לטהר את תוצרי התגובה לפני הגברה, העבר את המוצרים המוגברים מראש מצינור PCR לצינור 1.5 מיליליטר. הוסיפו 48 מיקרוליטר של חרוזי AMPure XP לכל דגימה וערבבו בעדינות על ידי פיפטינג לפני הדגירה. הניחו את צינורות ה-1.5 מיליליטר המכילים את הדגימות והחרוזים על מעמד הפרדה מגנטית למשך חמש דקות.יש להשליך בזהירות את הסופרנאטנט מהדגימות מבלי להפריע לחרוזים. לאחר השעייתם מחדש ב -200 מיקרוליטר של 80% אתנול, הניחו אותם על מעמד ההפרדה המגנטית למשך שלוש דקות נוספות. לאחר השלכת האתנול המכיל סופרנטנט, יש לייבש את הדגימות באוויר בצינור למשך 10 דקות.מרחפים מחדש את החרוזים ב-20 מיקרוליטר מים נטולי נוקלאז ודגרים בטמפרטורת החדר למשך חמש דקות. לאחר מכן הניחו אותם על מעמד ההפרדה המגנטית למשך חמש דקות. בעזרת פיפטה מעבירים 18 מיקרוליטר של הסופרנאטנט מכל צינור לצינור צנטריפוגה חדש של 1.5 מיליליטר.לבסוף, בצע את השלבים המתוארים בטקסט כדי לאפיין את הספרייה המוקדמת, ולאחר מכן בנייה, טיהור וכימות הספרייה. קווי הסמנים הפלואורסצנטיים Arabidopsis thaliana פותחו על ידי התכה של חלבונים פלואורסצנטיים עם גנים המבוטאים באופן ספציפי בסוגי תאי מטרה או על ידי שימוש בקווי מלכודת משפרים. הפרוטופלסטים המסומנים הספציפיים לפלואורסצנטיות מוינו בהצלחה בהתבסס על עוצמת הפלואורסצנטיות וסינגלטים של פיזור קדמי ופיזור צדדי.התאים הממוינים הודגמו באמצעות שדה בהיר והדמיית פלואורסצנטיות. התוצאות המייצגות של ספריית ריצוף הרנ"א של כ -2, 000 תאי פריסייקל קוטב קסילם, תאי שורש קדמוניים רוחביים, תאי אנדודרמיס או קליפת המוח, ותאי כובע שורש רוחביים מוצגים. ספריה בגודל קטן עם פסגות דימר של פריימר או מתאם עדיין יכולה להיות מרוצפת לאחר בחירת גודל.ספרייה עם התפלגות בגודל חריג הצביעה על הכנה לא מוצלחת של הספרייה. דפוסי ביטוי הגנים נותחו. הגנים המועשרים בכל אחד מארבעת סוגי תאי השורש קובצו ותוארו במפת חום המראה את הספציפיות של ביטויי גנים בין סוגי תאים שונים.איכות גבוהה וטוהר של תאי המטרה באמצעות גיטוט נכון ומיון ומניעה של פירוק RNA הם המפתח לבניית ספרייה מוצלחת. עבור RNA-seq במצב תא בודד, דווחו לאחרונה מספר שיטות המשולבות עם המזהה המולקולרי הייחודי אשר שיפרו באופן משמעותי את הביצועים.

Research

JoVE Journal

Biology

Mating and Tetrad Separation of Chlamydomonas reinhardtii for Genetic Analysis

Mating and Tetrad Separation of Chlamydomonas reinhardtii for Genetic Analysis

הזדווגות והפרדה של הטטרדה Chlamydomonas reinhardtii עבור ניתוח גנטי

The unicellular green alga Chlamydomonas reinhardtii (Chlamydomonas) has become a popular organism for research in diverse areas of cell biology and ...

Fluorescence Activated Cell Sorting of Plant Protoplasts

מיון פלואורסצנטי תא פעיל של Protoplasts הצמח

High-resolution, cell type-specific analysis of gene expression greatly enhances understanding of developmental regulation and responses to environmental ...

Comprehensive Compositional Analysis of Plant Cell Walls (Lignocellulosic biomass) Part I: Lignin

Comprehensive Compositional Analysis of Plant Cell Walls Lignocellulosic biomass Part I: Lignin

ניתוח מקיף של ההלחנה קירות התא הצומח (ביומסה Lignocellulosic) חלק א: ליגנין

The need for renewable, carbon neutral, and sustainable raw materials for industry and society has become one of the most pressing issues for the 21st ...

Comprehensive Compositional Analysis of Plant Cell Walls (Lignocellulosic biomass) Part II: Carbohydrates

Comprehensive Compositional Analysis of Plant Cell Walls Lignocellulosic biomass Part II: Carbohydrates

ניתוח מקיף של ההלחנה קירות התא הצומח (ביומסה Lignocellulosic) חלק II: פחמימות

A Novel Bayesian Change-point Algorithm for Genome-wide Analysis of Diverse ChIPseq Data Types

אלגוריתם רומן ייס שינוי נקודות לניתוח הגנום רחב, של סוגי נתוני ChIPseq מגוונים

ChIPseq is a widely used technique for investigating protein-DNA interactions. Read density profiles are generated by using next-sequencing of ...

Efficient and Rapid Isolation of Early-stage Embryos from Arabidopsis thaliana Seeds

Efficient and Rapid Isolation of Early-stage Embryos from Arabidopsis thaliana Seeds

בידוד יעיל ומהיר של עוברים משלבים מוקדמים<em&gt; Thaliana ארבידופסיס</em&gt; זרעים

In flowering plants, the embryo develops within a nourishing tissue - the endosperm - surrounded by the maternal seed integuments (or seed coat). As a ...

Metabolic Labeling and Membrane Fractionation for Comparative Proteomic Analysis of Arabidopsis thaliana Suspension Cell Cultures

Metabolic Labeling and Membrane Fractionation for Comparative Proteomic Analysis of Arabidopsis thaliana Suspension Cell Cultures

מטבולית תיוג וממברנה היפוך חלוקה לניתוח השוואתי של proteomic<em&gt; Thaliana ארבידופסיס</em&gt; תא תרבויות השעיה

Plasma membrane microdomains are features based on the physical properties of the lipid and sterol environment and have particular roles in signaling ...

Isolation and Physiological Analysis of Mouse Cardiomyocytes

בידוד ופיזיולוגי ניתוח של שריר לב העכבר

Cardiomyocytes, the workhorse cell of the heart, contain exquisitely organized cytoskeletal and contractile elements that generate the contractile force ...

An Efficient Method for Quantitative, Single-cell Analysis of Chromatin Modification and Nuclear Architecture in Whole-mount Ovules in Arabidopsis

An Efficient Method for Quantitative, Single-cell Analysis of Chromatin Modification and Nuclear Architecture in Whole-mount Ovules in Arabidopsis

שיטה יעילה לניתוח כמותי, תא בודד של הכרומטין שינוי ואדריכלות גרעינית בהר שלם-ביציות ב<em&gt; ארבידופסיס</em

In flowering plants, the somatic-to-reproductive cell fate transition is marked by the specification of spore mother cells (SMCs) in floral organs of the ...

Isolation and Compositional Analysis of Plant Cuticle Lipid Polyester Monomers

בידוד והלחנת ניתוח של צמח מונומרים פוליאסטר שומנים ציפורן

Terrestrial plants produce extracellular aliphatic biopolyesters that modify cell walls of specific tissues. Epidermal cells synthesize cutin, a polyester ...