Name: isolation and transcriptome analysis of plant cell types
Uploaded: 2023-04-07T12:40:00
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このプロトコルは、上海交通大学農生物学部のシングルセルマルチオミクス施設で設定され、中国国家自然科学財団(助成金番号32070608)、上海浦江プログラム(助成金番号20PJ1405800)、上海交通大学(助成金番号Agri-X20200202、2019TPB05)の支援を受けました。

以下のプロトコルは、次の根細胞タイプの蛍光および蛍光マーカーラインを持たないA. thaliana野生型(WT)種子用に最適化されています:木部極周環状細胞(J0121)、側根初期細胞、側根冠細胞(J3411)、内皮および皮質細胞(J0571)(図1A)。以前に発表された第14報告書に続いて、GATA23プロモーター駆動GFP構築物を野生型シロイヌナズナ植物に導入するこ...

<ol>
	<li>Zhang, T. -. Q., Chen, Y., Liu, Y., Lin, W. -. H., Wang, J. -. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-cell+transcriptome+atlas+and+chromatin+accessibility+landscape+reveal+differentiation+trajectories+in+the+rice+root.">Single-cell transcriptome atlas and chromatin accessibility landscape reveal differentiation trajectories in the rice root.</a> Nature Communications. 12 (1), 2053 (2021).</li><li>Denyer, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spatiotemporal+developmental+trajectories+in+the+Arabidopsis+root+revealed+using+high-throughput+single-cell+RNA+sequencing.">Spatiotemporal developmental trajectories in the Arabidopsis root revealed using high-throughput single-cell RNA sequencing.</a> Developmental Cell. 48 (6), 840-852 (2019).</li><li>Liu, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transcriptional+landscape+of+rice+roots+at+the+single-cell+resolution.">Transcriptional landscape of rice roots at the single-cell resolution.</a> Molecular Plant. 14 (3), 384-394 (2021).</li><li>Liu, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Global+dynamic+molecular+profiling+of+stomatal+lineage+cell+development+by+single-cell+RNA+sequencing.">Global dynamic molecular profiling of stomatal lineage cell development by single-cell RNA sequencing.</a> Molecular Plant. 13 (8), 1178-1193 (2020).</li><li>Shahan, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+single-cell+Arabidopsis+root+atlas+reveals+developmental+trajectories+in+wild-type+and+cell+identity+mutants.">A single-cell Arabidopsis root atlas reveals developmental trajectories in wild-type and cell identity mutants.</a> Developmental Cell. 57 (4), 543-560 (2022).</li><li>Wendrich, J. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Vascular+transcription+factors+guide+plant+epidermal+responses+to+limiting+phosphate+conditions.">Vascular transcription factors guide plant epidermal responses to limiting phosphate conditions.</a> Science. 370 (6518), (2020).</li><li>Carter, A. D., Bonyadi, R., Gifford, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+use+of+fluorescence-activated+cell+sorting+in+studying+plant+development+and+environmental+responses.">The use of fluorescence-activated cell sorting in studying plant development and environmental responses.</a> The International Journal of Developmental Biology. 57 (6-8), 545-552 (2013).</li><li>Picelli, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Full-length+RNA-seq+from+single+cells+using+Smart-seq2.">Full-length RNA-seq from single cells using Smart-seq2.</a> Nature Protocols. 9 (1), 171-181 (2014).</li><li>Wang, X., He, Y., Zhang, Q., Ren, X., Zhang, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Direct+comparative+analyses+of+10X+genomics+chromium+and+Smart-seq2.">Direct comparative analyses of 10X genomics chromium and Smart-seq2.</a> Genomics Proteomics Bioinformatics. 19 (2), 253-266 (2021).</li><li>Serrano-Ron, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reconstruction+of+lateral+root+formation+through+single-cell+RNAsequencing+reveals+order+of+tissue+initiation.">Reconstruction of lateral root formation through single-cell RNAsequencing reveals order of tissue initiation.</a> Molecular Plant. 14 (8), 1362-1378 (2021).</li><li>Hashimshony, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CEL-Seq2:+Sensitive+highly-multiplexed+single-cell+RNA-Seq.">CEL-Seq2: Sensitive highly-multiplexed single-cell RNA-Seq.</a> Genome Biology. 17, 77 (2016).</li><li>Macaulay, I. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=G&amp;T-seq:+Parallel+sequencing+of+single-cell+genomes+and+transcriptomes.">G&amp;T-seq: Parallel sequencing of single-cell genomes and transcriptomes.</a> Nature Methods. 12 (6), 519-522 (2015).</li><li>Angermueller, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Parallel+single-cell+sequencing+links+transcriptional+and+epigenetic+heterogeneity.">Parallel single-cell sequencing links transcriptional and epigenetic heterogeneity.</a> Nature Methods. 13 (3), 229-232 (2016).</li><li>De Rybel, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+aux/IAA28+signaling+cascade+activates+GATA23-dependent+specification+of+lateral+root+founder+cell+identity.">A novel aux/IAA28 signaling cascade activates GATA23-dependent specification of lateral root founder cell identity.</a> Current Biology. 20 (19), 1697-1706 (2010).</li><li>Duncombe, S. G., Barnes, W. J., Anderson, C. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+the+delivery+and+behavior+of+cellulose+synthases+in+Arabidopsis+thaliana+using+confocal+microscopy.">Imaging the delivery and behavior of cellulose synthases in Arabidopsis thaliana using confocal microscopy.</a> Methods in Cell Biology. 160, 201-213 (2020).</li><li>Levy, S. E., Myers, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Advancements+in+next-generation+sequencing.">Advancements in next-generation sequencing.</a> Annual Review of Genomics and Human Genetics. 17 (1), 95-115 (2016).</li><li>Ooi, C. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-throughput+full-length+single-cell+mRNA-seq+of+rare+cells.">High-throughput full-length single-cell mRNA-seq of rare cells.</a> PLoS One. 12 (11), e0188510 (2017).</li><li>Pertea, M., Kim, D., Pertea, G. M., Leek, J. T., Salzberg, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transcript-level+expression+analysis+of+RNA-seq+experiments+with+HISAT,+StringTie+and+Ballgown.">Transcript-level expression analysis of RNA-seq experiments with HISAT, StringTie and Ballgown.</a> Nature Protocols. 11 (9), 1650-1667 (2016).</li><li>Tsyganov, K., Perry, A., Archer, S., Powell, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RNAsik:+A+Pipeline+for+complete+and+reproducible+RNA-seq+analysis+that+runs+anywhere+with+speed+and+ease.">RNAsik: A Pipeline for complete and reproducible RNA-seq analysis that runs anywhere with speed and ease.</a> Journal of Open Source Software. 3, 583 (2018).</li><li>Love, M. I., Huber, W., Anders, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Moderated+estimation+of+fold+change+and+dispersion+for+RNA-seq+data+with+DESeq2.">Moderated estimation of fold change and dispersion for RNA-seq data with DESeq2.</a> Genome Biology. 15 (12), 550 (2014).</li><li>Kamiya, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+MYB36+transcription+factor+orchestrates+Casparian+strip+formation.">The MYB36 transcription factor orchestrates Casparian strip formation.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 112 (33), 10533-10538 (2015).</li><li>Zhang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Two+types+of+bHLH+transcription+factor+determine+the+competence+of+the+pericycle+for+lateral+root+initiation.">Two types of bHLH transcription factor determine the competence of the pericycle for lateral root initiation.</a> Nature Plants. 7 (5), 633-643 (2021).</li><li>Haecker, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expression+dynamics+of+WOX+genes+mark+cell+fate+decisions+during+early+embryonic+patterning+in+Arabidopsis+thaliana.">Expression dynamics of WOX genes mark cell fate decisions during early embryonic patterning in Arabidopsis thaliana.</a> Development. 131 (3), 657-668 (2004).</li><li>Chen, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Auxin+overproduction+in+shoots+cannot+rescue+auxin+deficiencies+in+Arabidopsis+roots.">Auxin overproduction in shoots cannot rescue auxin deficiencies in Arabidopsis roots.</a> Plant Cell Physiol. 55 (6), 1072-1079 (2014).</li><li>Nichterwitz, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Laser+capture+microscopy+coupled+with+Smart-seq2+for+precise+spatial+transcriptomic+profiling.">Laser capture microscopy coupled with Smart-seq2 for precise spatial transcriptomic profiling.</a> Nature Communications. 7, 12139 (2016).</li><li>Long, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nurse+cell--derived+small+RNAs+define+paternal+epigenetic+inheritance+in+Arabidopsis.">Nurse cell--derived small RNAs define paternal epigenetic inheritance in Arabidopsis.</a> Science. 373 (6550), (2021).</li><li>Gutzat, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Arabidopsis+shoot+stem+cells+display+dynamic+transcription+and+DNA+methylation+patterns.">Arabidopsis shoot stem cells display dynamic transcription and DNA methylation patterns.</a> EMBO Journal. 39 (20), e103667 (2020).</li></ol>

Smart-seq2ベースのプロトコルは、数百のセルから信頼性の高いシーケンシングライブラリを生成できます8。出発物質の品質は、トランスクリプトーム解析の精度に不可欠です。FACSは目的の細胞を調製するための強力なツールですが、この手順、特にプロトプラストステップは、植物用途に最適化する必要があります。レーザーキャプチャーマイクロダイセクション(LCM)また?...

細胞はすべての生物の基本単位であり、構造的および生理学的機能を果たします。多細胞生物の細胞は見かけのシンクロニシティを示しますが、異なる種類の細胞や個々の細胞は、発生中のトランスクリプトームと環境応答に違いを示します。ハイスループットシングルセルRNAシーケンシング(scRNA-seq)は、細胞の不均一性を理解するための前例のないパワーを提供します。scRNA-seqを植物科学に応用することは、植物細胞アトラスの構築に成功し1、植物組織2の希少な細胞分類群の同定に使用され、植物組織における細胞タイプの組成に関する洞察を提供し、細胞同一性と植物の発生および分化に使用される重要な機能を特定するために使用されてきました。さらに、植物組織1,2,3における時空間発生軌跡を推測して新しいマーカー遺伝子を発見し4、scRNA-seqを用いて重要な転写因子5の機能を研究することで、異なる植物における同じ細胞種の進化的保存を明らかにすることができます3。.非生物的ストレスは、植物の成長と発達に対する最も重要な環境影響の一つです。シングルセルトランスクリプトームシーケンシングを通じて、さまざまな処理条件下での植物組織の細胞タイプの組成の変化を調べることにより、非生物的ストレス応答メカニズムを解明することもできます6。
scRNAシーケンシングを使用して細胞タイプ間の転写不均一性を解決できる可能性は、細胞分離方法とシーケンシングプラットフォームによって異なります。蛍光活性化セルソーティング(FACS)は、光散乱と細胞の蛍光特性に基づいてscRNA-seqの細胞の亜集団を単離するために広く使用されている技術です。トランスジェニック技術による蛍光マーカー株の開発により、FACS7による細胞単離の効率が大幅に向上しました。Smart-seq28を用いてscRNA-seqを実施すると、細胞の不均一性を解剖する能力がさらに高まります。Smart-seq2法は遺伝子検出感度が高く、転写物入力量が少ない場合でも遺伝子を検出できます9。バルクセルタイプの収集に加えて、最新のセルソーターはシングルセルインデックスソーティングフォーマットを提供し、Smart-seq210またはCEL-seq211などの他のマルチプレックスRNA-seqメソッドを使用してシングルセル分解能でトランスクリプトーム解析を可能にします。シングルセルまたはセルタイプのソーティングは、並行マルチオミクス研究など、他の多くのダウンストリームアプリケーションに使用できる可能性があります12,13。ここでは、FACSによってシロイヌナズナマーカー細胞株の根から木部極周回細胞、側根冠細胞、側根初期細胞、皮質細胞、内胚葉細胞などの植物細胞タイプを単離するための堅牢で汎用性の高いプロトコルを紹介します。このプロトコルには、ダウンストリームトランスクリプトーム解析用のSmart-seq2ライブラリの構築もさらに含まれます。

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>0.22 &#181;m strainer</td>
			<td>Sorfa&#160;</td>
			<td>622110</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agar</td>
			<td>Yeasen</td>
			<td>70101ES76</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agilent fragment analyzer</td>
			<td>Aglient</td>
			<td>Aglient 5200</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agilent high-sensitivity DNA kit</td>
			<td>Aglient</td>
			<td>DNF-474-0500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ampure XP beads</td>
			<td>BECKMAN</td>
			<td>A63881</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Betaine</td>
			<td>yuanye</td>
			<td>S18046-100g</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bleach</td>
			<td>Mr Muscle</td>
			<td>FnBn83BK</td>
			<td>20% (v/v) bleach</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BSA</td>
			<td>sigma</td>
			<td>9048-46-8</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CaCl2</td>
			<td>yuanye</td>
			<td>S24109-500g</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cellulase R10</td>
			<td>Yakult (Japan)</td>
			<td>9012-54-8</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cellulase RS</td>
			<td>Yakult (Japan)</td>
			<td>9012-54-8</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge tube (1.5 mL)</td>
			<td>Eppendolf</td>
			<td>30121589</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNase, RNase, DNA and RNA Away Surface Decontaminants</td>
			<td>Beyotime</td>
			<td>R0127</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>dNTPs (10 mM)</td>
			<td>NEB</td>
			<td>N0447S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DTT (0.1 M)</td>
			<td> 
			invitrogen</td>
			<td>18090050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol</td>
			<td>Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd</td>
			<td>100092680</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FACS</td>
			<td>BD FACS Melody</td>
			<td>BD-65745</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FACS</td>
			<td>Sony</td>
			<td>SH800S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Filter tip&#160; (1000 &#181;L)</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>TF112-1000-Q</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Filter tip&#160; (200 &#181;L)</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>TF140-200-Q</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Filter tip (10 &#181;L)</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>TF104-10-Q</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Filter tip (100 &#181;L)</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>TF113-100-Q</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluorescent microscope</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>Eclipse Ni-E</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Four-Dimensional Rotating Mixer</td>
			<td>Kylin -Bell</td>
			<td>BE-1100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hemicellulase</td>
			<td>sigma</td>
			<td>9025-56-3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IS PCR primer</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>5&#39;-AAGCAGTGGTATCAACGCAGAG 
			T-3&#39;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KAPA HiFi HotStart ReadyMix(2X)</td>
			<td>Roche&#160;</td>
			<td>7958935001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KCl</td>
			<td>Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd</td>
			<td>7447-40-7</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Macerozyme R10</td>
			<td>Yakult (Japan)</td>
			<td>9032-75-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnetic separation stand</td>
			<td>invitrogen</td>
			<td>12321D</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mannitol</td>
			<td>aladdin</td>
			<td>69-65-8</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MES</td>
			<td>aladdin</td>
			<td>145224948</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MgCl2&#160;</td>
			<td>yuanye</td>
			<td>R21455-500ml</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microcentrifuges</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>Centrifuge 5425</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micro-mini-centrifuge</td>
			<td>Titan</td>
			<td>Timi-10k</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MS</td>
			<td>Phytotech</td>
			<td>M519</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nextera XT DNA Library Preparation Kit</td>
			<td>illumina</td>
			<td>FC-131-1024</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>oligo-dT30VN primer</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>5&#39;-AAGCAGTGGTATCAACGCAGAG 
			TACTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTT 
			TTTTTTTTTTVN-3&#39;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PCR instrument</td>
			<td>Thermal cycler</td>
			<td>A24811</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pectolyase</td>
			<td>Yakult (Japan)</td>
			<td>9033-35-6</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plant marker lines</td>
			<td>Nottingham Arabidopsis Stock Centre (NASC)</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Qubit 1x dsDNA HS Assay Kit</td>
			<td>invitrogen</td>
			<td>Q33231</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Qubit 2.0 fluorometer</td>
			<td>invitrogen</td>
			<td>Q32866</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNase inhibitor&#160;</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>EO0382</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNase-free water</td>
			<td>invitrogen</td>
			<td>10977023</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Solution A</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>400 mM mannitol, 0.05 % BSA , 20 mM MES (pH5.7), 10 mM CaCl2, 20 mM KCl</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Solution B</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>1 % (w/v)cellulase R10, 1 % (w/v) cellulase RS, 1 %&#160; (w/v)hemicellulase, 0.5 %&#160; (w/v)pectolyase and 1 %&#160; (w/v) Macerozyme R10 of in a fresh aliquot of solution A</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile pestle</td>
			<td>BIOTREAT</td>
			<td>453463</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Strainer (40 &#181;m )</td>
			<td>Sorfa&#160;</td>
			<td>251100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Superscript enzyme (200 U/&#181;L)</td>
			<td>invitrogen</td>
			<td>18090050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SuperScript VI buffer (5x)</td>
			<td>invitrogen</td>
			<td>18090050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T0est tube (5 mL)</td>
			<td>BD Falcon</td>
			<td>352052</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thin-walled PCR tubes with caps (0.5 mL)</td>
			<td>AXYGEN</td>
			<td>PCR-05-C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>Sangon Biotech</td>
			<td>A600198-0500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TSO primer</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>5&#39;-AAGCAGTGGTATCAACGCAGAG 
			TACATrGrG+G-3&#39;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vortex</td>
			<td>Titan</td>
			<td>VM-T2</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

isolation and transcriptome analysis of plant cell types

多細胞生物では、発生プログラミングと環境応答は、異なる細胞タイプまたは細胞内でさえ非常に異なる可能性があり、これは細胞の不均一性として知られています。近年、次世代シーケンシング(NGS)技術と組み合わせたシングルセルおよびセルタイプの分離は、シングルセル分解能で生物学的プロセスを研究するための重要なツールになっています。しかしながら、植物細胞壁が存在するため、植物細胞を単離することは比較的困難であり、それは植物における単一細胞アプローチの適用を制限する。このプロトコルは、植物細胞による蛍光活性化セルソーティング(FACS)ベースのシングルセルおよびセルタイプの分離のための堅牢な手順を説明しており、ダウンストリームのマルチオミクス解析やその他の研究に適しています。 シロイヌナ ズナの根蛍光マーカー株を用いて、木部極周回細胞、側根初期細胞、側根冠細胞、皮質細胞、内胚葉細胞などの特定の細胞種がどのように分離されるかを示します。さらに、Smart-seq2を用いた効果的なダウンストリームトランスクリプトーム解析法も提供します。細胞単離法とトランスクリプトーム解析技術は、他の細胞種や植物種にも適応でき、植物科学に幅広い応用の可能性を秘めています。

プロトプラスト単離 このプロトコルは、蛍光 A.タリアナ 根マーカー株のプロトプラストソーティングに有効です。これらのマーカー株は、蛍光タンパク質と標的細胞型で特異的に発現する遺伝子との融合、またはエンハンサートラップ株の使用によって開発されました(図1)。多数の組織や臓器が、モデル植物や作物で特定の蛍光マーカーを発現す...

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Isolation and Transcriptome Analysis of Plant Cell Types

ハイスループットscRNA-seqメソッドの実現可能性と有効性は、植物研究におけるシングルセル時代の到来を告げるものです。ここでは、シ ロイヌナズ ナの根の特定の細胞タイプを単離し、その後のトランスクリプトームライブラリの構築と解析を行うための堅牢で完全な手順を紹介します。

植物細胞タイプの単離とトランスクリプトーム解析

In multicellular organisms, developmental programming and environmental responses can be highly divergent in different cell types or even within cells, ...

単一細胞または細胞タイプのトランスクリプトーム解析は、不均一性によってマスクされる遺伝子発現の微妙な違いを検出することができ、これは精巧な細胞内制御メカニズムを明らかにするための強力なツールです。蛍光活性化セルソーティングとそれに続くRN-seq解析は、高い転写物検出感度と他のマルチオミクスアプローチとの互換性を備えたシングルセルまたはバルクセルタイプモードで実行できます。このプロトコルを初めて使用する場合は、プロトプラストのソーティングとRNA-seqライブラリの準備のいくつかのステップに注意を払う必要があります。Jun Zhangとともに、私たちの研究室のポスドクであるRongrong Xie博士が手順のデモンストレーションを支援します。まず、シロイヌナズナ野生型と蛍光マーカーラインの種子を20%漂白剤に入れ、回転インキュベーターを使用して室温で15分間インキュベートし、種子を殺菌します。滅菌ベンチで作業しながら、種子を二重蒸留水で3〜5回すすいでください。野生型とレポーターラインの種子を、体積あたり0.8%の重寒天培地で半強度のMS培地にプレートします。摂氏4度で2日間植物を層別化する。次に、16時間の光と18時間の暗のサイクルの下で、摂氏23度で5日間垂直に育てます。実験の前に、溶液Aおよび溶液Bと呼ばれるプロトプラスト溶液を氷上で穏やかに解凍します。きれいな刃またははさみを使って植物から根を切り取り、根を約0.5センチメートルに切り刻みます。刻んだ根を1.5ミリリットルの溶液Bに浸し、続いて室温で1.5〜2時間穏やかに回転させる。得られた根のプロトプラストを40ミクロンのストレーナーメッシュでろ過し、メッシュを1〜2ミリリットルの溶液ですすぎます A.合わせたろ液を300 Gで摂氏4度で5分間遠心分離します。ピペットを使用して上清を捨て、細胞ペレットを500〜600マイクロリットルの溶液Aに再懸濁し、直ちに氷上に置きます。細胞選別のために、再懸濁した細胞溶液を新しい5ミリリットルの試験管に移します。シース液タンクを満たし、廃棄物タンクを確認します。次に、蛍光活性化セルソーティングまたはFACSマシンの電源を入れます。ソーターで機器のセットアップと自動キャリブレーションの手順を実行します。蛍光チャンネルを選択し、蛍光のない野生型植物をベースラインコントロールとして使用します。蛍光強度と前方散乱および側方散乱シングレットに基づいてソーティングゲートを調整します。500マイクロリットルの溶液Aを1.5ミリリットルの収集チューブに加えた後、選別を開始し、チューブあたり2, 000〜3, 000セルを収集します。選別後、すぐにサンプルを氷の上に置きます。細胞を含む回収チューブを300G、摂氏4度で5分間遠心分離し、ピペットで上清を除去します。2マイクロリットルの選別された細胞を取り、蛍光顕微鏡を使用して蛍光を確認します。ソートされたセルをすぐに使用しない場合は、摂氏マイナス80度で保管します。シングルセルインデックスソーティングの場合は、メンブレン付きの96ウェルプレートをアダプターに入れます。液滴がプレートの中央の穴に落ちるようにプレートの位置を調整します。96 ウェル・プレートからメンブレンを取り外し、96 ウェル・プレートをアダプターに入れます。並べ替え時に単一セルの並べ替えモードを選択します。ソートされたセルの目標数を1つとして入力し、ソートを開始します。実験を開始する前に、表面の除染剤と75%エタノールでベンチを清掃してください。すべての機器は、シーケンシングライブラリの準備にのみ使用してください。選別したサンプルに1マイクロリットルの新たに調製した混合物Aを加えた後、滅菌乳棒で粉砕する。RNAseフリー水を使用して、容量を14マイクロリットルに構成します。次に、各サンプルを0.2ミリリットルの薄肉PCRチューブに移します。次に、混合物Bを準備し、サンプルを含む各PCRチューブに混合物Bの4.4マイクロリットルを追加し、穏やかなピペッティングで混合します。サンプルを摂氏72度で3分間インキュベートします。インキュベーション後、直ちにサンプルを氷上に置いて、オリゴdTをポリAテールにハイブリダイズさせる。逆転写反応混合物または混合物Cを21.6マイクロリットルで調製し、サンプルを含む各チューブに。逆転写プログラムに従って、一般的なPCR機器でサンプルを逆転写反応にかけます。新たに調製したプレアンプ反応混合物または混合物Dを逆転写反応産物に40.8マイクロリットル加え、プレアンププログラムを実行します。増幅サイクルは、反応が指数関数的段階に入ったばかりのときの定量的PCRによって決定できます。プレアンプ反応産物を精製するには、プリアンプ産物をPCRチューブから1.5ミリリットルチューブに移します。48マイクロリットルのAMPure XPビーズを各サンプルに加え、インキュベーション前にピペッティングで穏やかに混合します。サンプルとビーズを入れた1.5ミリリットルのチューブを磁気分離スタンドに5分間置きます。ビーズを乱すことなく、サンプルから上清を慎重に廃棄します。それらを200マイクロリットルの80%エタノールに再懸濁した後、さらに3分間磁気分離スタンドに置きます。エタノール含有上清を捨てた後、サンプルをチューブ中で10分間風乾する。ビーズを20マイクロリットルのヌクレアーゼ遊離水に再懸濁し、室温で5分間インキュベートします。次に、それらを磁気分離スタンドに5分間置きます。ピペットを使用して、各チューブから18マイクロリットルの上清を新しい1.5ミリリットルの遠沈管に移します。最後に、本文に記載されている手順に従ってプレライブラリの特性評価を行い、ライブラリの構築、精製、定量を行います。蛍光性シロイヌナズナマーカー株は、蛍光タンパク質と標的細胞型に特異的に発現する遺伝子を融合させること、またはエンハンサートラップ株を用いて開発されました。蛍光特異的にマーキングされたプロトプラストは、蛍光強度と前方散乱および側方散乱一重項に基づいて正常にソートされました。選別された細胞を明視野および蛍光イメージングを用いて可視化した。約2,000個の木部極周回細胞、側根始原細胞、内皮または皮質細胞、および側根冠細胞のRNAシーケンシングライブラリの代表的な結果が示されている。プライマーまたはアダプターの二量体ピークを含む小さなサイズのライブラリでも、サイズ選択後に配列決定することができます。異常なサイズ分布を持つライブラリーは、ライブラリーの準備に失敗したことを示しています。遺伝子発現パターンを解析した。4つの根細胞タイプのいずれかで濃縮された遺伝子をクラスター化し、異なる細胞タイプ間の遺伝子発現の特異性を示すヒートマップに示しました。正しいゲーティングとソーティング、RNA分解の防止による標的細胞の高品質と純度は、ライブラリ構築を成功させるための鍵です。シングルセルモードのRNA-seqについては、ユニークな分子識別子と統合されたいくつかの方法が最近報告されており、パフォーマンスが大幅に向上しています。

Research

JoVE Journal

Biology

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