Name: isolation and transcriptome analysis of plant cell types
Uploaded: 2023-04-07T12:40:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Isolation and Transcriptome Analysis of Plant Cell Types at JoVE.com

Мы создали этот протокол в одноклеточном мультиомиксном центре Школы сельского хозяйства и биологии Шанхайского университета Цзяотун при поддержке Национального фонда естественных наук Китая (грант No 32070608), Шанхайской программы Пуцзян (грант No 20PJ1405800) и Шанхайского университета Цзяотун (грант No Agri-X20200202, 2019TPB05).

Следующий протокол был оптимизирован для семян дикого типа (WT) A. thaliana без флуоресцентных и флуоресцентных маркерных линий для следующих типов корневых клеток: клетки перицикла ксилемы-полюса (J0121), начальные клетки бокового корня, клетки боковой корневой крышки (J3411), клетки энтодер...

<ol>
	<li>Zhang, T. -. Q., Chen, Y., Liu, Y., Lin, W. -. H., Wang, J. -. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-cell+transcriptome+atlas+and+chromatin+accessibility+landscape+reveal+differentiation+trajectories+in+the+rice+root.">Single-cell transcriptome atlas and chromatin accessibility landscape reveal differentiation trajectories in the rice root.</a> Nature Communications. 12 (1), 2053 (2021).</li><li>Denyer, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spatiotemporal+developmental+trajectories+in+the+Arabidopsis+root+revealed+using+high-throughput+single-cell+RNA+sequencing.">Spatiotemporal developmental trajectories in the Arabidopsis root revealed using high-throughput single-cell RNA sequencing.</a> Developmental Cell. 48 (6), 840-852 (2019).</li><li>Liu, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transcriptional+landscape+of+rice+roots+at+the+single-cell+resolution.">Transcriptional landscape of rice roots at the single-cell resolution.</a> Molecular Plant. 14 (3), 384-394 (2021).</li><li>Liu, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Global+dynamic+molecular+profiling+of+stomatal+lineage+cell+development+by+single-cell+RNA+sequencing.">Global dynamic molecular profiling of stomatal lineage cell development by single-cell RNA sequencing.</a> Molecular Plant. 13 (8), 1178-1193 (2020).</li><li>Shahan, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+single-cell+Arabidopsis+root+atlas+reveals+developmental+trajectories+in+wild-type+and+cell+identity+mutants.">A single-cell Arabidopsis root atlas reveals developmental trajectories in wild-type and cell identity mutants.</a> Developmental Cell. 57 (4), 543-560 (2022).</li><li>Wendrich, J. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Vascular+transcription+factors+guide+plant+epidermal+responses+to+limiting+phosphate+conditions.">Vascular transcription factors guide plant epidermal responses to limiting phosphate conditions.</a> Science. 370 (6518), (2020).</li><li>Carter, A. D., Bonyadi, R., Gifford, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+use+of+fluorescence-activated+cell+sorting+in+studying+plant+development+and+environmental+responses.">The use of fluorescence-activated cell sorting in studying plant development and environmental responses.</a> The International Journal of Developmental Biology. 57 (6-8), 545-552 (2013).</li><li>Picelli, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Full-length+RNA-seq+from+single+cells+using+Smart-seq2.">Full-length RNA-seq from single cells using Smart-seq2.</a> Nature Protocols. 9 (1), 171-181 (2014).</li><li>Wang, X., He, Y., Zhang, Q., Ren, X., Zhang, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Direct+comparative+analyses+of+10X+genomics+chromium+and+Smart-seq2.">Direct comparative analyses of 10X genomics chromium and Smart-seq2.</a> Genomics Proteomics Bioinformatics. 19 (2), 253-266 (2021).</li><li>Serrano-Ron, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reconstruction+of+lateral+root+formation+through+single-cell+RNAsequencing+reveals+order+of+tissue+initiation.">Reconstruction of lateral root formation through single-cell RNAsequencing reveals order of tissue initiation.</a> Molecular Plant. 14 (8), 1362-1378 (2021).</li><li>Hashimshony, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CEL-Seq2:+Sensitive+highly-multiplexed+single-cell+RNA-Seq.">CEL-Seq2: Sensitive highly-multiplexed single-cell RNA-Seq.</a> Genome Biology. 17, 77 (2016).</li><li>Macaulay, I. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=G&amp;T-seq:+Parallel+sequencing+of+single-cell+genomes+and+transcriptomes.">G&amp;T-seq: Parallel sequencing of single-cell genomes and transcriptomes.</a> Nature Methods. 12 (6), 519-522 (2015).</li><li>Angermueller, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Parallel+single-cell+sequencing+links+transcriptional+and+epigenetic+heterogeneity.">Parallel single-cell sequencing links transcriptional and epigenetic heterogeneity.</a> Nature Methods. 13 (3), 229-232 (2016).</li><li>De Rybel, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+aux/IAA28+signaling+cascade+activates+GATA23-dependent+specification+of+lateral+root+founder+cell+identity.">A novel aux/IAA28 signaling cascade activates GATA23-dependent specification of lateral root founder cell identity.</a> Current Biology. 20 (19), 1697-1706 (2010).</li><li>Duncombe, S. G., Barnes, W. J., Anderson, C. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+the+delivery+and+behavior+of+cellulose+synthases+in+Arabidopsis+thaliana+using+confocal+microscopy.">Imaging the delivery and behavior of cellulose synthases in Arabidopsis thaliana using confocal microscopy.</a> Methods in Cell Biology. 160, 201-213 (2020).</li><li>Levy, S. E., Myers, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Advancements+in+next-generation+sequencing.">Advancements in next-generation sequencing.</a> Annual Review of Genomics and Human Genetics. 17 (1), 95-115 (2016).</li><li>Ooi, C. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-throughput+full-length+single-cell+mRNA-seq+of+rare+cells.">High-throughput full-length single-cell mRNA-seq of rare cells.</a> PLoS One. 12 (11), e0188510 (2017).</li><li>Pertea, M., Kim, D., Pertea, G. M., Leek, J. T., Salzberg, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transcript-level+expression+analysis+of+RNA-seq+experiments+with+HISAT,+StringTie+and+Ballgown.">Transcript-level expression analysis of RNA-seq experiments with HISAT, StringTie and Ballgown.</a> Nature Protocols. 11 (9), 1650-1667 (2016).</li><li>Tsyganov, K., Perry, A., Archer, S., Powell, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RNAsik:+A+Pipeline+for+complete+and+reproducible+RNA-seq+analysis+that+runs+anywhere+with+speed+and+ease.">RNAsik: A Pipeline for complete and reproducible RNA-seq analysis that runs anywhere with speed and ease.</a> Journal of Open Source Software. 3, 583 (2018).</li><li>Love, M. I., Huber, W., Anders, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Moderated+estimation+of+fold+change+and+dispersion+for+RNA-seq+data+with+DESeq2.">Moderated estimation of fold change and dispersion for RNA-seq data with DESeq2.</a> Genome Biology. 15 (12), 550 (2014).</li><li>Kamiya, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+MYB36+transcription+factor+orchestrates+Casparian+strip+formation.">The MYB36 transcription factor orchestrates Casparian strip formation.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 112 (33), 10533-10538 (2015).</li><li>Zhang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Two+types+of+bHLH+transcription+factor+determine+the+competence+of+the+pericycle+for+lateral+root+initiation.">Two types of bHLH transcription factor determine the competence of the pericycle for lateral root initiation.</a> Nature Plants. 7 (5), 633-643 (2021).</li><li>Haecker, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expression+dynamics+of+WOX+genes+mark+cell+fate+decisions+during+early+embryonic+patterning+in+Arabidopsis+thaliana.">Expression dynamics of WOX genes mark cell fate decisions during early embryonic patterning in Arabidopsis thaliana.</a> Development. 131 (3), 657-668 (2004).</li><li>Chen, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Auxin+overproduction+in+shoots+cannot+rescue+auxin+deficiencies+in+Arabidopsis+roots.">Auxin overproduction in shoots cannot rescue auxin deficiencies in Arabidopsis roots.</a> Plant Cell Physiol. 55 (6), 1072-1079 (2014).</li><li>Nichterwitz, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Laser+capture+microscopy+coupled+with+Smart-seq2+for+precise+spatial+transcriptomic+profiling.">Laser capture microscopy coupled with Smart-seq2 for precise spatial transcriptomic profiling.</a> Nature Communications. 7, 12139 (2016).</li><li>Long, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nurse+cell--derived+small+RNAs+define+paternal+epigenetic+inheritance+in+Arabidopsis.">Nurse cell--derived small RNAs define paternal epigenetic inheritance in Arabidopsis.</a> Science. 373 (6550), (2021).</li><li>Gutzat, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Arabidopsis+shoot+stem+cells+display+dynamic+transcription+and+DNA+methylation+patterns.">Arabidopsis shoot stem cells display dynamic transcription and DNA methylation patterns.</a> EMBO Journal. 39 (20), e103667 (2020).</li></ol>

Протокол на основе Smart-seq2 может генерировать надежные библиотеки секвенирования из нескольких сотен ячеек8. Качество исходного материала имеет важное значение для точности анализа транскриптома. FACS является мощным инструментом для подготовки клеток, представляющих инте?...

Клетки являются основной единицей всех живых организмов и выполняют структурные и физиологические функции. Хотя клетки в многоклеточных организмах демонстрируют кажущуюся синхронность, клетки разных типов и отдельные клетки демонстрируют различия в своих транскриптомах во время развития и реакций окружающей среды. Высокопроизводительное секвенирование одноклеточной РНК (scRNA-seq) обеспечивает беспрецедентную мощность для понимания клеточной гетерогенности. Применение scRNA-seq в науках о растениях способствовало успешному построению атласарастительных клеток 1, использовалось для идентификации редких клеточных таксонов в тканях растений2, дало представление о составе типов клеток в тканях растений и использовалось для идентификации клеточной идентичности и важных функций, используемых во время развития и дифференцировки растений. Кроме того, можно вывести пространственно-временные траектории развития в тканях растений 1,2,3, открыть новые гены-маркеры 4 и изучить функции важных факторов транскрипции5 с помощью scRNA-seq, чтобы выявить эволюционное сохранение одного и того же типа клеток у разных растений 3. Абиотические стрессы являются одними из наиболее важных факторов воздействия окружающей среды на рост и развитие растений. Исследуя изменения в составе типов клеток в тканях растений в различных условиях лечения с помощью секвенирования одноклеточного транскриптома, можно также разрешить механизм абиотической реакциина стресс 6.
Потенциал разрешения транскрипционной гетерогенности между типами клеток с использованием секвенирования скРНК зависит от метода выделения клеток и платформы секвенирования. Сортировка клеток, активируемая флуоресценцией (FACS), является широко используемым методом выделения субпопуляции клеток для scRNA-seq на основе рассеяния света и флуоресцентных свойств клеток. Разработка флуоресцентных маркерных линий с помощью трансгенной технологии значительно повысила эффективность выделения клеток с помощью FACS7. Проведение секвенирования скРНК с использованием Smart-seq28 еще больше усиливает способность препарировать клеточную гетерогенность. Метод Smart-seq2 обладает хорошей чувствительностью для детекции генов и может обнаруживать гены даже при низком входе транскрипта9. В дополнение к массовому сбору типов клеток, современные сортировщики клеток предоставляют формат сортировки индекса одной ячейки, что позволяет проводить анализ транскриптома с разрешением одной клетки с использованием Smart-seq210 или других мультиплексных методов секвенирования РНК, таких как CEL-seq211. Сортировка по одной ячейке или по ячейке потенциально может быть использована для многих других последующих приложений, таких как параллельные мультиомические исследования12,13. Здесь представлен надежный и универсальный протокол для выделения типов растительных клеток, таких как клетки перицикла ксилемы, клетки боковой корневой крышки, начальные клетки бокового корня, клетки коры и энтодермальные клетки из корней маркерных клеточных линий Arabidopsis thaliana с помощью FACS. Кроме того, протокол включает в себя создание библиотеки Smart-seq2 для последующего анализа транскриптома.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>0.22 &#181;m strainer</td>
			<td>Sorfa&#160;</td>
			<td>622110</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agar</td>
			<td>Yeasen</td>
			<td>70101ES76</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agilent fragment analyzer</td>
			<td>Aglient</td>
			<td>Aglient 5200</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agilent high-sensitivity DNA kit</td>
			<td>Aglient</td>
			<td>DNF-474-0500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ampure XP beads</td>
			<td>BECKMAN</td>
			<td>A63881</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Betaine</td>
			<td>yuanye</td>
			<td>S18046-100g</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bleach</td>
			<td>Mr Muscle</td>
			<td>FnBn83BK</td>
			<td>20% (v/v) bleach</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BSA</td>
			<td>sigma</td>
			<td>9048-46-8</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CaCl2</td>
			<td>yuanye</td>
			<td>S24109-500g</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cellulase R10</td>
			<td>Yakult (Japan)</td>
			<td>9012-54-8</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cellulase RS</td>
			<td>Yakult (Japan)</td>
			<td>9012-54-8</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge tube (1.5 mL)</td>
			<td>Eppendolf</td>
			<td>30121589</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNase, RNase, DNA and RNA Away Surface Decontaminants</td>
			<td>Beyotime</td>
			<td>R0127</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>dNTPs (10 mM)</td>
			<td>NEB</td>
			<td>N0447S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DTT (0.1 M)</td>
			<td> 
			invitrogen</td>
			<td>18090050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol</td>
			<td>Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd</td>
			<td>100092680</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FACS</td>
			<td>BD FACS Melody</td>
			<td>BD-65745</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FACS</td>
			<td>Sony</td>
			<td>SH800S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Filter tip&#160; (1000 &#181;L)</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>TF112-1000-Q</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Filter tip&#160; (200 &#181;L)</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>TF140-200-Q</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Filter tip (10 &#181;L)</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>TF104-10-Q</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Filter tip (100 &#181;L)</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>TF113-100-Q</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluorescent microscope</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>Eclipse Ni-E</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Four-Dimensional Rotating Mixer</td>
			<td>Kylin -Bell</td>
			<td>BE-1100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hemicellulase</td>
			<td>sigma</td>
			<td>9025-56-3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IS PCR primer</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>5&#39;-AAGCAGTGGTATCAACGCAGAG 
			T-3&#39;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KAPA HiFi HotStart ReadyMix(2X)</td>
			<td>Roche&#160;</td>
			<td>7958935001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KCl</td>
			<td>Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd</td>
			<td>7447-40-7</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Macerozyme R10</td>
			<td>Yakult (Japan)</td>
			<td>9032-75-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnetic separation stand</td>
			<td>invitrogen</td>
			<td>12321D</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mannitol</td>
			<td>aladdin</td>
			<td>69-65-8</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MES</td>
			<td>aladdin</td>
			<td>145224948</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MgCl2&#160;</td>
			<td>yuanye</td>
			<td>R21455-500ml</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microcentrifuges</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>Centrifuge 5425</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micro-mini-centrifuge</td>
			<td>Titan</td>
			<td>Timi-10k</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MS</td>
			<td>Phytotech</td>
			<td>M519</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nextera XT DNA Library Preparation Kit</td>
			<td>illumina</td>
			<td>FC-131-1024</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>oligo-dT30VN primer</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>5&#39;-AAGCAGTGGTATCAACGCAGAG 
			TACTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTT 
			TTTTTTTTTTVN-3&#39;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PCR instrument</td>
			<td>Thermal cycler</td>
			<td>A24811</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pectolyase</td>
			<td>Yakult (Japan)</td>
			<td>9033-35-6</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plant marker lines</td>
			<td>Nottingham Arabidopsis Stock Centre (NASC)</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Qubit 1x dsDNA HS Assay Kit</td>
			<td>invitrogen</td>
			<td>Q33231</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Qubit 2.0 fluorometer</td>
			<td>invitrogen</td>
			<td>Q32866</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNase inhibitor&#160;</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>EO0382</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNase-free water</td>
			<td>invitrogen</td>
			<td>10977023</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Solution A</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>400 mM mannitol, 0.05 % BSA , 20 mM MES (pH5.7), 10 mM CaCl2, 20 mM KCl</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Solution B</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>1 % (w/v)cellulase R10, 1 % (w/v) cellulase RS, 1 %&#160; (w/v)hemicellulase, 0.5 %&#160; (w/v)pectolyase and 1 %&#160; (w/v) Macerozyme R10 of in a fresh aliquot of solution A</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile pestle</td>
			<td>BIOTREAT</td>
			<td>453463</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Strainer (40 &#181;m )</td>
			<td>Sorfa&#160;</td>
			<td>251100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Superscript enzyme (200 U/&#181;L)</td>
			<td>invitrogen</td>
			<td>18090050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SuperScript VI buffer (5x)</td>
			<td>invitrogen</td>
			<td>18090050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T0est tube (5 mL)</td>
			<td>BD Falcon</td>
			<td>352052</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thin-walled PCR tubes with caps (0.5 mL)</td>
			<td>AXYGEN</td>
			<td>PCR-05-C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>Sangon Biotech</td>
			<td>A600198-0500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TSO primer</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>5&#39;-AAGCAGTGGTATCAACGCAGAG 
			TACATrGrG+G-3&#39;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vortex</td>
			<td>Titan</td>
			<td>VM-T2</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

isolation and transcriptome analysis of plant cell types

В многоклеточных организмах программирование развития и реакции окружающей среды могут сильно различаться в разных типах клеток или даже внутри клеток, что известно как клеточная гетерогенность. В последние годы выделение отдельных клеток и клеток в сочетании с методами секвенирования следующего поколения (NGS) стали важными инструментами для изучения биологических процессов при разрешении в одной клетке. Однако выделение растительных клеток относительно сложнее из-за наличия клеточных стенок растений, что ограничивает применение одноклеточных подходов у растений. Этот протокол описывает надежную процедуру выделения одноклеточных и клеточных клеток на основе флуоресцентно-активированной сортировки (FACS) с растительными клетками, которая подходит для последующего мультиомиксного анализа и других исследований. Используя флуоресцентные маркерные линии корня арабидопсиса , мы демонстрируем, как выделяются определенные типы клеток, такие как клетки перицикла ксилемы, начальные клетки латерального корня, клетки боковой крышки корня, клетки коры и энтодермальные клетки. Кроме того, предусмотрен эффективный последующий метод анализа транскриптома с использованием Smart-seq2. Метод выделения клеток и методы анализа транскриптома могут быть адаптированы к другим типам клеток и видам растений и имеют широкий потенциал применения в науке о растениях.

Изоляция протопласта Этот протокол эффективен для сортировки протопластов флуоресцентных линий корневых маркеров A. thaliana. Эти маркерные линии были разработаны путем слияния флуоресцентных белков с генами, экспрессируемыми специфически в типах клеток-мишеней, или с ис?...

Watch this Scientific Journal Video about Isolation and Transcriptome Analysis of Plant Cell Types at JoVE.com

Isolation and Transcriptome Analysis of Plant Cell Types

Осуществимость и эффективность высокопроизводительных методов секвенирования скРНК предвещают эру одноклеточных исследований растений. Здесь представлена надежная и полная процедура выделения конкретных типов клеток корня Arabidopsis thaliana и последующего построения и анализа библиотеки транскриптома.

Выделение и транскриптомный анализ типов растительных клеток

In multicellular organisms, developmental programming and environmental responses can be highly divergent in different cell types or even within cells, ...

Транскриптомный анализ отдельных клеток или типов клеток может обнаружить тонкое различие в экспрессии генов, замаскированное гетерогенностью, что является мощным инструментом для раскрытия сложных внутриклеточных регуляторных механизмов. Флуоресцентно-активируемая сортировка клеток с последующим анализом RN-seq может быть выполнена как в режиме одиночной ячейки, так и в режиме объемного типа клетки с высокой чувствительностью обнаружения транскрипта и совместимостью с другими мультиомными подходами. Начинающим пользователям этого протокола необходимо обратить внимание на некоторые этапы сортировки протопластов и подготовки библиотеки RNA-seq.Вместе с Цзюнь Чжаном доктор Ронгронг Се, постдок в нашей лаборатории, поможет в демонстрации процедуры. Для начала поместите семена дикого типа Arabidopsis thaliana и флуоресцентного маркера в 20% отбеливатель и инкубируйте с помощью вращающегося инкубатора при комнатной температуре в течение 15 минут для стерилизации семян. Во время работы на стерильной скамье промойте семена три-пять раз в двойной дистиллированной воде.Положите семена дикорастущего типа и репортерной линии на среду MS половинной прочности с массой 0,8% на объем. Стратифицируйте растения в течение двух дней при четырех градусах тепла. Затем выращивайте их вертикально в течение пяти дней при температуре 23 градуса Цельсия при 16-часовом световом и 18-часовом темном циклах.Осторожно разморозьте протопластические растворы, называемые раствором А и раствором В, на льду перед экспериментом. Срежьте корни с растений с помощью чистого лезвия или ножниц и измельчите корни примерно на 0,5-сантиметровые кусочки. Погрузите измельченные корни в 1,5 миллилитра раствора B с последующим аккуратным вращением при комнатной температуре в течение 1,5-2 часов.Отфильтруйте полученные корневые протопласты через сетку ситечка 40 микрон и промойте сетку одним-двумя миллилитрами раствора А.Центрифугируйте комбинированные фильтраты при 300 г в течение пяти минут при четырех градусах Цельсия. Выбросьте надосадочную жидкость с помощью пипетки, ресуспендируйте гранулу клетки в 500-600 микролитрах раствора А и немедленно поместите ее на лед. Для сортировки клеток перенесите ресуспендированный клеточный раствор в новую пятимиллилитровую пробирку.Заполните резервуар для жидкости оболочки и проверьте резервуар для отходов. Затем включите камеру сортировки клеток, активируемую флуоресценцией, или машину FACS. Выполните этапы настройки прибора и автоматической калибровки на сортировщике.Выберите каналы флуоресценции и используйте растение дикорастущего типа без флуоресценции в качестве базового контроля. Отрегулируйте сортировочный затвор в зависимости от интенсивности флуоресценции и синглетов прямого и бокового рассеяния. После добавления 500 микролитров раствора А в 1,5-миллилитровую пробирку для сбора приступают к сортировке и собирают от 2 000 до 3 000 клеток в пробирке.После сортировки сразу же поместите образцы на лед. Центрифугируйте сборную пробирку, содержащую клетки, при температуре 300 г и четырех градусах Цельсия в течение пяти минут и удалите надосадочную жидкость с помощью пипетки. Возьмите два микролитра отсортированных клеток и проверьте наличие флуоресценции с помощью флуоресцентного микроскопа.Храните отсортированные ячейки при температуре минус 80 градусов по Цельсию, если не использовать их немедленно. Для сортировки индекса одной ячейки поместите 96-луночную пластину с мембраной в адаптер. Откалибруйте положение пластины так, чтобы капля попадала в центральное отверстие пластины.Снимите мембрану с 96-луночной пластины и поместите 96-луночную пластину в адаптер. Выберите режим сортировки по одной ячейке при сортировке. Введите целевое количество отсортированных ячеек как одну и начните сортировку.Перед началом эксперимента очистите стенд обеззараживающим средством для поверхностей и 75% этанолом. Используйте все оборудование только для подготовки библиотеки секвенирования. Добавив в отсортированный образец один микролитр свежеприготовленной смеси А, измельчите ее стерильным пестиком.Используя воду, свободную от РНК, доведите объем до 14 микролитров. Затем переложите каждый образец в тонкостенную пробирку для ПЦР объемом 0,2 миллилитра. Затем приготовьте смесь B. Добавьте 4,4 микролитра смеси B в каждую пробирку для ПЦР, содержащую образцы, и перемешайте путем щадящего пипетирования.Инкубируйте образцы при температуре 72 градуса Цельсия в течение трех минут. После инкубации немедленно поместите образцы на лед, чтобы гибридизировать олиго dT с поли-А-хвостом. Готовят реакционную смесь обратной транскрипции или смесь С в 21,6 мкл ее в каждую пробирку, содержащую образцы.Подвергните образцы реакции обратной транскрипции в обычном приборе ПЦР в соответствии с программой обратной транскрипции. Добавьте 40,8 микролитра свежеприготовленной реакционной смеси предварительного усиления или смеси D к продукту реакции обратной транскрипции и запустите программу предварительной амплификации. Цикл амплификации можно определить с помощью количественной ПЦР, когда реакция только входит в экспоненциальную фазу.Чтобы очистить продукты реакции предварительной амплификации, перенесите предварительно амплифицированные продукты из пробирки для ПЦР в пробирку объемом 1,5 миллилитра. Добавьте 48 микролитров шариков AMPure XP в каждый образец и аккуратно перемешайте пипеткой перед инкубацией. Поместите 1,5-миллилитровые пробирки с образцами и шариками на подставку для магнитной сепарации на пять минут.Аккуратно сбрасывайте надосадочную жидкость с образцов, не повреждая бусины. После ресуспендирования их в 200 микролитрах 80% этанола поместите их на подставку для магнитной сепарации еще на три минуты. После удаления надосадочной жидкости, содержащей этанол, высушите образцы на воздухе в пробирке в течение 10 минут.Ресуспендируйте шарики в 20 микролитрах воды, не содержащей нуклеаз, и выдерживайте при комнатной температуре в течение пяти минут. Затем поместите их на подставку для магнитной сепарации на пять минут. С помощью пипетки перелейте 18 микролитров надосадочной жидкости из каждой пробирки в новую центрифужную пробирку объемом 1,5 миллилитра.Наконец, следуйте шагам, описанным в тексте, чтобы охарактеризовать предварительную библиотеку, а затем построение, очистку и количественную оценку библиотеки. Флуоресцентные линии маркеров Arabidopsis thaliana были разработаны путем слияния флуоресцентных белков с генами, экспрессируемыми специфически в типах клеток-мишеней, или с использованием линий-ловушек энхансеров. Флуоресцентно-специфические маркированные протопласты были успешно отсортированы по интенсивности флуоресценции и синглетам прямого рассеяния и бокового рассеяния.Отсортированные клетки визуализировали с помощью светлого поля и флуоресцентной визуализации. Показаны репрезентативные результаты библиотеки секвенирования РНК, содержащей около 2 000 клеток перицикла полюсов ксилемы, первичных клеток боковых корней, клеток энтодермы или коры головного мозга и клеток бокового корня. Библиотека небольшого размера с пиками праймера или адаптера димера все еще может быть секвенирована после выбора размера.Библиотека с ненормальным распределением по размерам указывает на неудачную подготовку библиотеки. Были проанализированы паттерны экспрессии генов. Гены, обогащенные любым из четырех типов корневых клеток, были сгруппированы и изображены на тепловой карте, показывающей специфичность экспрессии генов среди различных типов клеток.Высокое качество и чистота клеток-мишеней за счет правильного стробирования и сортировки, а также предотвращения деградации РНК являются ключом к успешному построению библиотеки. Для RNA-seq в режиме одной клетки недавно сообщалось о нескольких методах, интегрированных с уникальным молекулярным идентификатором, что значительно улучшило производительность.

Research

JoVE Journal

Biology

Mating and Tetrad Separation of Chlamydomonas reinhardtii for Genetic Analysis

Mating and Tetrad Separation of Chlamydomonas reinhardtii for Genetic Analysis

Спаривание и Тетрада Разделение Chlamydomonas reinhardtii Для генетического анализа

The unicellular green alga Chlamydomonas reinhardtii (Chlamydomonas) has become a popular organism for research in diverse areas of cell biology and ...

Fluorescence Activated Cell Sorting of Plant Protoplasts

Флуоресценция Активированный сортировки клеток растений Протопласты

High-resolution, cell type-specific analysis of gene expression greatly enhances understanding of developmental regulation and responses to environmental ...

Comprehensive Compositional Analysis of Plant Cell Walls (Lignocellulosic biomass) Part I: Lignin

Comprehensive Compositional Analysis of Plant Cell Walls Lignocellulosic biomass Part I: Lignin

Всеобъемлющее Композиционные Анализ стен растительной клетки (лигноцеллюлозной биомассы) Часть I: Лигнин

The need for renewable, carbon neutral, and sustainable raw materials for industry and society has become one of the most pressing issues for the 21st ...

Comprehensive Compositional Analysis of Plant Cell Walls (Lignocellulosic biomass) Part II: Carbohydrates

Comprehensive Compositional Analysis of Plant Cell Walls Lignocellulosic biomass Part II: Carbohydrates

Всеобъемлющее Композиционные Анализ стен растительной клетки (лигноцеллюлозной биомассы) Часть II: Углеводы

A Novel Bayesian Change-point Algorithm for Genome-wide Analysis of Diverse ChIPseq Data Types

Роман байесовского Изменение точки Алгоритм всему геному анализ различных типов данных ChIPseq

ChIPseq is a widely used technique for investigating protein-DNA interactions. Read density profiles are generated by using next-sequencing of ...

Efficient and Rapid Isolation of Early-stage Embryos from Arabidopsis thaliana Seeds

Efficient and Rapid Isolation of Early-stage Embryos from Arabidopsis thaliana Seeds

Эффективной и быстрой изоляции на ранней стадии эмбрионы из<em&gt; Arabidopsis THALIANA</em&gt; Семена

In flowering plants, the embryo develops within a nourishing tissue - the endosperm - surrounded by the maternal seed integuments (or seed coat). As a ...

Metabolic Labeling and Membrane Fractionation for Comparative Proteomic Analysis of Arabidopsis thaliana Suspension Cell Cultures

Metabolic Labeling and Membrane Fractionation for Comparative Proteomic Analysis of Arabidopsis thaliana Suspension Cell Cultures

Метаболический Маркировка и мембраны фракционирования для сравнительного Proteomic Анализ<em&gt; Арабидопсис</em&gt; Подвеска Клеточные культуры

Plasma membrane microdomains are features based on the physical properties of the lipid and sterol environment and have particular roles in signaling ...

Isolation and Physiological Analysis of Mouse Cardiomyocytes

Выделение и физиологический анализ мыши кардиомиоцитов

Cardiomyocytes, the workhorse cell of the heart, contain exquisitely organized cytoskeletal and contractile elements that generate the contractile force ...

An Efficient Method for Quantitative, Single-cell Analysis of Chromatin Modification and Nuclear Architecture in Whole-mount Ovules in Arabidopsis

An Efficient Method for Quantitative, Single-cell Analysis of Chromatin Modification and Nuclear Architecture in Whole-mount Ovules in Arabidopsis

Эффективный метод для количественного, анализа одноклеточные хроматина Модификация и ядерной архитектуры в целом монтажа яйцеклеток в<em&gt; Arabidopsis</em

In flowering plants, the somatic-to-reproductive cell fate transition is marked by the specification of spore mother cells (SMCs) in floral organs of the ...

Isolation and Compositional Analysis of Plant Cuticle Lipid Polyester Monomers

Выделение и анализ состава растительных липидов кутикулы полиэфирные мономеры

Terrestrial plants produce extracellular aliphatic biopolyesters that modify cell walls of specific tissues. Epidermal cells synthesize cutin, a polyester ...