Name: isolation and transcriptome analysis of plant cell types
Uploaded: 2023-04-07T12:40:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Isolation and Transcriptome Analysis of Plant Cell Types at JoVE.com

Establecimos este protocolo en la instalación multiómica unicelular de la Escuela de Agricultura y Biología de la Universidad Jiao Tong de Shanghai, y contamos con el apoyo de la Fundación Nacional de Ciencias Naturales de China (Subvención No. 32070608), el Programa Pujiang de Shanghai (Subvención No. 20PJ1405800) y la Universidad Jiao Tong de Shanghai (Subvención No. Agri-X20200202, 2019TPB05).

El siguiente protocolo se ha optimizado para semillas de tipo salvaje (WT) de A. thaliana sin fluorescencia y líneas marcadoras fluorescentes para los siguientes tipos de células radiculares: células periciclo xilema-polo (J0121), células iniciales de raíz lateral, células de la tapa lateral de la raíz (J3411), endodermis y células de la corteza (J0571) (Figura 1A). Todas las líneas marcadoras se obtuvieron de una fuente comercial (ver Tabla de materiales),...

<ol>
	<li>Zhang, T. -. Q., Chen, Y., Liu, Y., Lin, W. -. H., Wang, J. -. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-cell+transcriptome+atlas+and+chromatin+accessibility+landscape+reveal+differentiation+trajectories+in+the+rice+root.">Single-cell transcriptome atlas and chromatin accessibility landscape reveal differentiation trajectories in the rice root.</a> Nature Communications. 12 (1), 2053 (2021).</li><li>Denyer, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spatiotemporal+developmental+trajectories+in+the+Arabidopsis+root+revealed+using+high-throughput+single-cell+RNA+sequencing.">Spatiotemporal developmental trajectories in the Arabidopsis root revealed using high-throughput single-cell RNA sequencing.</a> Developmental Cell. 48 (6), 840-852 (2019).</li><li>Liu, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transcriptional+landscape+of+rice+roots+at+the+single-cell+resolution.">Transcriptional landscape of rice roots at the single-cell resolution.</a> Molecular Plant. 14 (3), 384-394 (2021).</li><li>Liu, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Global+dynamic+molecular+profiling+of+stomatal+lineage+cell+development+by+single-cell+RNA+sequencing.">Global dynamic molecular profiling of stomatal lineage cell development by single-cell RNA sequencing.</a> Molecular Plant. 13 (8), 1178-1193 (2020).</li><li>Shahan, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+single-cell+Arabidopsis+root+atlas+reveals+developmental+trajectories+in+wild-type+and+cell+identity+mutants.">A single-cell Arabidopsis root atlas reveals developmental trajectories in wild-type and cell identity mutants.</a> Developmental Cell. 57 (4), 543-560 (2022).</li><li>Wendrich, J. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Vascular+transcription+factors+guide+plant+epidermal+responses+to+limiting+phosphate+conditions.">Vascular transcription factors guide plant epidermal responses to limiting phosphate conditions.</a> Science. 370 (6518), (2020).</li><li>Carter, A. D., Bonyadi, R., Gifford, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+use+of+fluorescence-activated+cell+sorting+in+studying+plant+development+and+environmental+responses.">The use of fluorescence-activated cell sorting in studying plant development and environmental responses.</a> The International Journal of Developmental Biology. 57 (6-8), 545-552 (2013).</li><li>Picelli, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Full-length+RNA-seq+from+single+cells+using+Smart-seq2.">Full-length RNA-seq from single cells using Smart-seq2.</a> Nature Protocols. 9 (1), 171-181 (2014).</li><li>Wang, X., He, Y., Zhang, Q., Ren, X., Zhang, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Direct+comparative+analyses+of+10X+genomics+chromium+and+Smart-seq2.">Direct comparative analyses of 10X genomics chromium and Smart-seq2.</a> Genomics Proteomics Bioinformatics. 19 (2), 253-266 (2021).</li><li>Serrano-Ron, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reconstruction+of+lateral+root+formation+through+single-cell+RNAsequencing+reveals+order+of+tissue+initiation.">Reconstruction of lateral root formation through single-cell RNAsequencing reveals order of tissue initiation.</a> Molecular Plant. 14 (8), 1362-1378 (2021).</li><li>Hashimshony, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CEL-Seq2:+Sensitive+highly-multiplexed+single-cell+RNA-Seq.">CEL-Seq2: Sensitive highly-multiplexed single-cell RNA-Seq.</a> Genome Biology. 17, 77 (2016).</li><li>Macaulay, I. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=G&amp;T-seq:+Parallel+sequencing+of+single-cell+genomes+and+transcriptomes.">G&amp;T-seq: Parallel sequencing of single-cell genomes and transcriptomes.</a> Nature Methods. 12 (6), 519-522 (2015).</li><li>Angermueller, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Parallel+single-cell+sequencing+links+transcriptional+and+epigenetic+heterogeneity.">Parallel single-cell sequencing links transcriptional and epigenetic heterogeneity.</a> Nature Methods. 13 (3), 229-232 (2016).</li><li>De Rybel, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+aux/IAA28+signaling+cascade+activates+GATA23-dependent+specification+of+lateral+root+founder+cell+identity.">A novel aux/IAA28 signaling cascade activates GATA23-dependent specification of lateral root founder cell identity.</a> Current Biology. 20 (19), 1697-1706 (2010).</li><li>Duncombe, S. G., Barnes, W. J., Anderson, C. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+the+delivery+and+behavior+of+cellulose+synthases+in+Arabidopsis+thaliana+using+confocal+microscopy.">Imaging the delivery and behavior of cellulose synthases in Arabidopsis thaliana using confocal microscopy.</a> Methods in Cell Biology. 160, 201-213 (2020).</li><li>Levy, S. E., Myers, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Advancements+in+next-generation+sequencing.">Advancements in next-generation sequencing.</a> Annual Review of Genomics and Human Genetics. 17 (1), 95-115 (2016).</li><li>Ooi, C. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-throughput+full-length+single-cell+mRNA-seq+of+rare+cells.">High-throughput full-length single-cell mRNA-seq of rare cells.</a> PLoS One. 12 (11), e0188510 (2017).</li><li>Pertea, M., Kim, D., Pertea, G. M., Leek, J. T., Salzberg, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transcript-level+expression+analysis+of+RNA-seq+experiments+with+HISAT,+StringTie+and+Ballgown.">Transcript-level expression analysis of RNA-seq experiments with HISAT, StringTie and Ballgown.</a> Nature Protocols. 11 (9), 1650-1667 (2016).</li><li>Tsyganov, K., Perry, A., Archer, S., Powell, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RNAsik:+A+Pipeline+for+complete+and+reproducible+RNA-seq+analysis+that+runs+anywhere+with+speed+and+ease.">RNAsik: A Pipeline for complete and reproducible RNA-seq analysis that runs anywhere with speed and ease.</a> Journal of Open Source Software. 3, 583 (2018).</li><li>Love, M. I., Huber, W., Anders, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Moderated+estimation+of+fold+change+and+dispersion+for+RNA-seq+data+with+DESeq2.">Moderated estimation of fold change and dispersion for RNA-seq data with DESeq2.</a> Genome Biology. 15 (12), 550 (2014).</li><li>Kamiya, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+MYB36+transcription+factor+orchestrates+Casparian+strip+formation.">The MYB36 transcription factor orchestrates Casparian strip formation.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 112 (33), 10533-10538 (2015).</li><li>Zhang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Two+types+of+bHLH+transcription+factor+determine+the+competence+of+the+pericycle+for+lateral+root+initiation.">Two types of bHLH transcription factor determine the competence of the pericycle for lateral root initiation.</a> Nature Plants. 7 (5), 633-643 (2021).</li><li>Haecker, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expression+dynamics+of+WOX+genes+mark+cell+fate+decisions+during+early+embryonic+patterning+in+Arabidopsis+thaliana.">Expression dynamics of WOX genes mark cell fate decisions during early embryonic patterning in Arabidopsis thaliana.</a> Development. 131 (3), 657-668 (2004).</li><li>Chen, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Auxin+overproduction+in+shoots+cannot+rescue+auxin+deficiencies+in+Arabidopsis+roots.">Auxin overproduction in shoots cannot rescue auxin deficiencies in Arabidopsis roots.</a> Plant Cell Physiol. 55 (6), 1072-1079 (2014).</li><li>Nichterwitz, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Laser+capture+microscopy+coupled+with+Smart-seq2+for+precise+spatial+transcriptomic+profiling.">Laser capture microscopy coupled with Smart-seq2 for precise spatial transcriptomic profiling.</a> Nature Communications. 7, 12139 (2016).</li><li>Long, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nurse+cell--derived+small+RNAs+define+paternal+epigenetic+inheritance+in+Arabidopsis.">Nurse cell--derived small RNAs define paternal epigenetic inheritance in Arabidopsis.</a> Science. 373 (6550), (2021).</li><li>Gutzat, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Arabidopsis+shoot+stem+cells+display+dynamic+transcription+and+DNA+methylation+patterns.">Arabidopsis shoot stem cells display dynamic transcription and DNA methylation patterns.</a> EMBO Journal. 39 (20), e103667 (2020).</li></ol>

El protocolo basado en Smart-seq2 puede generar bibliotecas de secuenciación fiables a partir de varios cientos de celdas8. La calidad del material de partida es esencial para la precisión del análisis del transcriptoma. FACS es una herramienta poderosa para preparar células de interés, pero este procedimiento, especialmente el paso de protoplasting , debe optimizarse para aplicaciones de plantas. La microdisección de captura láser (LCM) o las células diseccionadas manualmente también se ...

Las células son la unidad fundamental de todos los organismos vivos y realizan funciones estructurales y fisiológicas. Aunque las células en organismos multicelulares muestran una aparente sincronicidad, las células de diferentes tipos y células individuales presentan diferencias en sus transcriptomas durante el desarrollo y las respuestas ambientales. La secuenciación de ARN unicelular de alto rendimiento (scRNA-seq) proporciona una potencia sin precedentes para comprender la heterogeneidad celular. La aplicación de scRNA-seq en ciencias de las plantas ha contribuido a construir con éxito un atlas celularvegetal 1, se ha utilizado para identificar taxones celulares raros en tejidos vegetales2, ha proporcionado información sobre la composición de los tipos de células en los tejidos vegetales y se ha utilizado para identificar la identidad celular y las funciones importantes empleadas durante el desarrollo y la diferenciación de las plantas. Además, es posible inferir trayectorias de desarrollo espaciotemporal en tejidos vegetales 1,2,3 para descubrir nuevos genes marcadores4 y estudiar las funciones de importantes factores de transcripción5 utilizando scRNA-seq con el fin de revelar la conservación evolutiva del mismo tipo celular en diferentes plantas3. El estrés abiótico se encuentra entre las influencias ambientales más importantes en el crecimiento y desarrollo de las plantas. Al explorar los cambios en la composición de los tipos de células en los tejidos vegetales bajo diferentes condiciones de tratamiento a través de la secuenciación del transcriptoma unicelular, también se puede resolver el mecanismo de respuesta al estrés abiótico6.
El potencial para resolver la heterogeneidad transcripcional entre los tipos de células mediante la secuenciación de scRNA depende del método de aislamiento celular y la plataforma de secuenciación. La clasificación celular activada por fluorescencia (FACS) es una técnica ampliamente utilizada para aislar una subpoblación de células para scRNA-seq basada en la dispersión de la luz y las propiedades de fluorescencia de las células. El desarrollo de líneas marcadoras fluorescentes mediante tecnología transgénica ha mejorado considerablemente la eficiencia del aislamiento celular mediante el sistema de control de los datos sobre el terreno7. La realización de scRNA-seq utilizando Smart-seq28 mejora aún más la capacidad de diseccionar la heterogeneidad celular. El método Smart-seq2 tiene buena sensibilidad para la detección de genes y puede detectar genes incluso con una entrada de transcripción baja9. Además de la recolección masiva de tipos de células, los clasificadores de células modernos proporcionan un formato de clasificación de índice de una sola célula, lo que permite el análisis del transcriptoma a una resolución de una sola célula utilizando Smart-seq210 u otros métodos multiplexados de RNA-seq, como CEL-seq211. La clasificación de una sola célula o de tipo celular puede utilizarse potencialmente para muchas otras aplicaciones posteriores, como los estudios multiómicos paralelos12,13. Aquí se presenta un protocolo robusto y versátil para aislar tipos de células vegetales, como células periciclo xilema-polo, células de la tapa lateral de la raíz, células iniciales de la raíz lateral, células de la corteza y células endodérmicas de las raíces de las líneas celulares marcadoras de Arabidopsis thaliana por FACS. El protocolo implica además la construcción de la biblioteca Smart-seq2 para el análisis del transcriptoma aguas abajo.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>0.22 &#181;m strainer</td>
			<td>Sorfa&#160;</td>
			<td>622110</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agar</td>
			<td>Yeasen</td>
			<td>70101ES76</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agilent fragment analyzer</td>
			<td>Aglient</td>
			<td>Aglient 5200</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agilent high-sensitivity DNA kit</td>
			<td>Aglient</td>
			<td>DNF-474-0500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ampure XP beads</td>
			<td>BECKMAN</td>
			<td>A63881</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Betaine</td>
			<td>yuanye</td>
			<td>S18046-100g</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bleach</td>
			<td>Mr Muscle</td>
			<td>FnBn83BK</td>
			<td>20% (v/v) bleach</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BSA</td>
			<td>sigma</td>
			<td>9048-46-8</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CaCl2</td>
			<td>yuanye</td>
			<td>S24109-500g</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cellulase R10</td>
			<td>Yakult (Japan)</td>
			<td>9012-54-8</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cellulase RS</td>
			<td>Yakult (Japan)</td>
			<td>9012-54-8</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge tube (1.5 mL)</td>
			<td>Eppendolf</td>
			<td>30121589</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNase, RNase, DNA and RNA Away Surface Decontaminants</td>
			<td>Beyotime</td>
			<td>R0127</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>dNTPs (10 mM)</td>
			<td>NEB</td>
			<td>N0447S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DTT (0.1 M)</td>
			<td> 
			invitrogen</td>
			<td>18090050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol</td>
			<td>Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd</td>
			<td>100092680</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FACS</td>
			<td>BD FACS Melody</td>
			<td>BD-65745</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FACS</td>
			<td>Sony</td>
			<td>SH800S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Filter tip&#160; (1000 &#181;L)</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>TF112-1000-Q</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Filter tip&#160; (200 &#181;L)</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>TF140-200-Q</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Filter tip (10 &#181;L)</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>TF104-10-Q</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Filter tip (100 &#181;L)</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>TF113-100-Q</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluorescent microscope</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>Eclipse Ni-E</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Four-Dimensional Rotating Mixer</td>
			<td>Kylin -Bell</td>
			<td>BE-1100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hemicellulase</td>
			<td>sigma</td>
			<td>9025-56-3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IS PCR primer</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>5&#39;-AAGCAGTGGTATCAACGCAGAG 
			T-3&#39;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KAPA HiFi HotStart ReadyMix(2X)</td>
			<td>Roche&#160;</td>
			<td>7958935001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KCl</td>
			<td>Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd</td>
			<td>7447-40-7</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Macerozyme R10</td>
			<td>Yakult (Japan)</td>
			<td>9032-75-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnetic separation stand</td>
			<td>invitrogen</td>
			<td>12321D</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mannitol</td>
			<td>aladdin</td>
			<td>69-65-8</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MES</td>
			<td>aladdin</td>
			<td>145224948</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MgCl2&#160;</td>
			<td>yuanye</td>
			<td>R21455-500ml</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microcentrifuges</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>Centrifuge 5425</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micro-mini-centrifuge</td>
			<td>Titan</td>
			<td>Timi-10k</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MS</td>
			<td>Phytotech</td>
			<td>M519</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nextera XT DNA Library Preparation Kit</td>
			<td>illumina</td>
			<td>FC-131-1024</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>oligo-dT30VN primer</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>5&#39;-AAGCAGTGGTATCAACGCAGAG 
			TACTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTT 
			TTTTTTTTTTVN-3&#39;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PCR instrument</td>
			<td>Thermal cycler</td>
			<td>A24811</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pectolyase</td>
			<td>Yakult (Japan)</td>
			<td>9033-35-6</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plant marker lines</td>
			<td>Nottingham Arabidopsis Stock Centre (NASC)</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Qubit 1x dsDNA HS Assay Kit</td>
			<td>invitrogen</td>
			<td>Q33231</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Qubit 2.0 fluorometer</td>
			<td>invitrogen</td>
			<td>Q32866</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNase inhibitor&#160;</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>EO0382</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNase-free water</td>
			<td>invitrogen</td>
			<td>10977023</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Solution A</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>400 mM mannitol, 0.05 % BSA , 20 mM MES (pH5.7), 10 mM CaCl2, 20 mM KCl</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Solution B</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>1 % (w/v)cellulase R10, 1 % (w/v) cellulase RS, 1 %&#160; (w/v)hemicellulase, 0.5 %&#160; (w/v)pectolyase and 1 %&#160; (w/v) Macerozyme R10 of in a fresh aliquot of solution A</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile pestle</td>
			<td>BIOTREAT</td>
			<td>453463</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Strainer (40 &#181;m )</td>
			<td>Sorfa&#160;</td>
			<td>251100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Superscript enzyme (200 U/&#181;L)</td>
			<td>invitrogen</td>
			<td>18090050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SuperScript VI buffer (5x)</td>
			<td>invitrogen</td>
			<td>18090050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T0est tube (5 mL)</td>
			<td>BD Falcon</td>
			<td>352052</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thin-walled PCR tubes with caps (0.5 mL)</td>
			<td>AXYGEN</td>
			<td>PCR-05-C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>Sangon Biotech</td>
			<td>A600198-0500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TSO primer</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>5&#39;-AAGCAGTGGTATCAACGCAGAG 
			TACATrGrG+G-3&#39;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vortex</td>
			<td>Titan</td>
			<td>VM-T2</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

isolation and transcriptome analysis of plant cell types

En los organismos multicelulares, la programación del desarrollo y las respuestas ambientales pueden ser altamente divergentes en diferentes tipos de células o incluso dentro de las células, lo que se conoce como heterogeneidad celular. En los últimos años, el aislamiento de células individuales y de tipo celular combinado con técnicas de secuenciación de próxima generación (NGS) se han convertido en herramientas importantes para estudiar procesos biológicos a resolución de una sola célula. Sin embargo, aislar las células vegetales es relativamente más difícil debido a la presencia de paredes celulares vegetales, lo que limita la aplicación de enfoques unicelulares en las plantas. Este protocolo describe un procedimiento robusto para el aislamiento de células individuales y de tipo celular activado por fluorescencia (FACS) con células vegetales, que es adecuado para el análisis multiómico posterior y otros estudios. Usando líneas marcadoras fluorescentes de la raíz de Arabidopsis , demostramos cómo se aíslan tipos particulares de células, como las células periciclo del xilema-polo, las células iniciales de la raíz lateral, las células de la tapa de la raíz lateral, las células de la corteza y las células endodérmicas. Además, también se proporciona un método efectivo de análisis de transcriptoma aguas abajo utilizando Smart-seq2. El método de aislamiento celular y las técnicas de análisis del transcriptoma se pueden adaptar a otros tipos de células y especies de plantas y tienen un amplio potencial de aplicación en la ciencia de las plantas.

Aislamiento de protoplastos Este protocolo es efectivo para la clasificación de protoplastos de líneas marcadoras de raíces fluorescentes de A. thaliana. Estas líneas marcadoras se han desarrollado mediante la fusión de proteínas fluorescentes con genes expresados específicamente en tipos de células diana, o mediante el uso de líneas de trampa potenciadoras (Figura 1). Numerosos tejidos y órganos se han diseccionado en tipos de células que expresan mar...

Watch this Scientific Journal Video about Isolation and Transcriptome Analysis of Plant Cell Types at JoVE.com

Isolation and Transcriptome Analysis of Plant Cell Types

La viabilidad y efectividad de los métodos scRNA-seq de alto rendimiento anuncian una era unicelular en la investigación de plantas. Aquí se presenta un procedimiento robusto y completo para aislar tipos específicos de células de raíz de Arabidopsis thaliana y la posterior construcción y análisis de la biblioteca del transcriptoma.

Análisis de aislamiento y transcriptoma de tipos de células vegetales

In multicellular organisms, developmental programming and environmental responses can be highly divergent in different cell types or even within cells, ...

El análisis del transcriptoma en células individuales o tipos de células puede detectar la sutil diferencia de la expresión génica enmascarada por la heterogeneidad, que es una herramienta poderosa para descubrir los elaborados mecanismos reguladores intracelulares. La clasificación celular activada por fluorescencia seguida del análisis RN-seq se puede realizar en modo de celda única o de tipo de celda a granel con alta sensibilidad de detección de transcripción y compatibilidad con otros enfoques multiómicos. Los usuarios primerizos de este protocolo deben prestar atención a algunos pasos en la clasificación de protoplastos y la preparación de la biblioteca RNA-seq.Junto con Jun Zhang, el Dr. Rongrong Xie, un post-doc en nuestro laboratorio, ayudará a demostrar el procedimiento. Para comenzar, coloque las semillas de Arabidopsis thaliana wild type y fluorescent marker line en lejía al 20% e incube usando una incubadora giratoria a temperatura ambiente durante 15 minutos para esterilizar las semillas. Mientras trabaja en un banco estéril, enjuague las semillas de tres a cinco veces en agua destilada doble.Coloque en placa las semillas de tipo silvestre y línea reporter en medio MS de fuerza media con 0.8% de peso por volumen de agar. Estratificar las plantas durante dos días a cuatro grados centígrados. Luego cróquelos verticalmente durante cinco días a 23 grados centígrados bajo ciclos de luz de 16 horas y ciclos oscuros de 18 horas.Descongele suavemente las soluciones de protoplasting denominadas solución A y solución B en hielo antes del experimento. Corte las raíces de las plantas con una cuchilla limpia o tijeras y corte las raíces en trozos de aproximadamente 0,5 centímetros. Sumerja las raíces picadas en 1,5 mililitros de solución B seguido de una rotación suave a temperatura ambiente durante 1,5 a 2 horas.Filtrar los protoplastos radiculares resultantes a través de una malla filtrante de 40 micras y enjuagar la malla con uno o dos mililitros de solución A.Centrifugar los filtrados combinados a 300 G durante cinco minutos a cuatro grados centígrados. Deseche el sobrenadante con una pipeta, resuspenda el pellet celular en 500 a 600 microlitros de solución A y colóquelo en hielo inmediatamente. Para la clasificación celular, transfiera la solución celular resuspendida a un nuevo tubo de ensayo de cinco mililitros.Llene el tanque de fluido de la vaina y verifique el tanque de desechos. Luego encienda la máquina de clasificación de células activada por fluorescencia o FACS. Lleve a cabo los pasos de configuración del instrumento y calibración automática en el clasificador.Seleccione los canales de fluorescencia y use una planta de tipo silvestre sin fluorescencia como control de referencia. Ajuste la puerta de clasificación en función de la intensidad de fluorescencia y los singles de dispersión directa y dispersión lateral. Después de agregar 500 microlitros de solución A en un tubo de recolección de 1.5 mililitros, comience a clasificar y recolecte de 2, 000 a 3, 000 células por tubo.Después de clasificar, coloque inmediatamente las muestras en hielo. Centrifugar el tubo de recolección que contiene las células a 300 G y cuatro grados centígrados durante cinco minutos y retirar el sobrenadante con una pipeta. Tome dos microlitros de células clasificadas y verifique la fluorescencia con un microscopio de fluorescencia.Almacene las celdas clasificadas a menos 80 grados centígrados si no se usa inmediatamente. Para la clasificación del índice de una sola celda, coloque la placa de 96 pocillos con membrana en el adaptador. Calibre la posición de la placa para que la gota caiga en el orificio central de la placa.Retire la membrana de la placa de 96 pocillos y coloque la placa de 96 pocillos en el adaptador. Seleccione el modo de clasificación de celda única al ordenar. Introduzca el número objetivo de celdas ordenadas como una sola y comience a ordenar.Antes de comenzar el experimento, limpie el banco con un descontaminante superficial y etanol al 75%. Utilice todo el equipo solo para la preparación de la biblioteca de secuenciación. Después de agregar un microlitro de mezcla A recién preparada a la muestra clasificada, muélala con un mortero estéril.Usando agua libre de ARNasa, enrasar el volumen a 14 microlitros. Luego transfiera cada muestra en un tubo de PCR de pared delgada de 0.2 mililitros. Luego prepare la mezcla B.Agregue 4.4 microlitros en la mezcla B a cada tubo de PCR que contenga muestras y mezcle con un pipeteo suave.Incubar las muestras a 72 grados centígrados durante tres minutos. Después de la incubación, coloque inmediatamente las muestras en hielo para hibridar el oligo dT a la cola poli-A. Preparar la mezcla de reacción de transcripción inversa o mezcla C en un microlitro de 21,6 microlitros de la misma a cada tubo que contenga las muestras.Someter las muestras a una reacción de transcripción inversa en un instrumento de PCR común según el programa de transcripción inversa. Agregue 40.8 microlitros de la mezcla de reacción de preamplificación recién preparada o la mezcla D al producto de reacción de transcripción inversa y ejecute el programa de preamplificación. El ciclo de amplificación se puede determinar mediante PCR cuantitativa cuando la reacción acaba de entrar en la fase exponencial.Para purificar los productos de reacción de preamplificación, transfiera los productos preamplificados de un tubo de PCR a un tubo de 1,5 mililitros. Agregue 48 microlitros de perlas AMPure XP en cada muestra y mezcle suavemente con pipeteo antes de la incubación. Coloque los tubos de 1,5 mililitros que contienen las muestras y las perlas en un soporte de separación magnética durante cinco minutos.Deseche cuidadosamente el sobrenadante de las muestras sin alterar las cuentas. Después de resuspenderlos en 200 microlitros de etanol al 80%, colóquelos en el soporte de separación magnética durante otros tres minutos. Después de desechar el sobrenadante que contiene etanol, seque las muestras al aire en un tubo durante 10 minutos.Resuspender las perlas en 20 microlitros de agua libre de nucleasas e incubar a temperatura ambiente durante cinco minutos. Luego colóquelos en el soporte de separación magnética durante cinco minutos. Con una pipeta, transfiera 18 microlitros del sobrenadante de cada tubo a un nuevo tubo centrífugo de 1,5 mililitros.Finalmente, siga los pasos descritos en el texto para caracterizar la prebiblioteca, seguido de la construcción, purificación y cuantificación de la biblioteca. Las líneas de marcadores fluorescentes de Arabidopsis thaliana se desarrollaron fusionando proteínas fluorescentes con genes expresados específicamente en tipos de células diana o mediante el uso de líneas de trampa potenciadoras. Los protoplastos marcados específicos de fluorescencia se clasificaron con éxito en función de la intensidad de fluorescencia y la dispersión directa y las singletas de dispersión lateral.Las células clasificadas se visualizaron utilizando imágenes de campo claro y fluorescencia. Se muestran los resultados representativos de la biblioteca de secuenciación de ARN de aproximadamente 2, 000 células periciclo del polo del xilema, células primordiales de la raíz lateral, células de endodermis o corteza y células de la tapa lateral de la raíz. Una biblioteca de tamaño pequeño con picos de imprimación o dímero adaptador aún podría secuenciarse después de la selección del tamaño.Una biblioteca con una distribución de tamaño anormal indicó una preparación de biblioteca fallida. Se analizaron los patrones de expresión génica. Los genes enriquecidos en cualquiera de los cuatro tipos de células de raíz se agruparon y se representaron en un mapa de calor que muestra la especificidad de las expresiones génicas entre diferentes tipos de células.La alta calidad y pureza de las células diana a través de la correcta activación y clasificación y la prevención de la degradación del ARN son clave para la construcción exitosa de la biblioteca. Para RNA-seq en el modo de célula única, recientemente se han reportado varios métodos integrados con el identificador molecular único que mejoraron significativamente el rendimiento.

Research

JoVE Journal

Biology

Mating and Tetrad Separation of Chlamydomonas reinhardtii for Genetic Analysis

Mating and Tetrad Separation of Chlamydomonas reinhardtii for Genetic Analysis

El apareamiento y la separación de la Tétrada Chlamydomonas reinhardtii Para el análisis genético

The unicellular green alga Chlamydomonas reinhardtii (Chlamydomonas) has become a popular organism for research in diverse areas of cell biology and ...

Investigación

Biología

Fluorescence Activated Cell Sorting of Plant Protoplasts

Fluorescencia de células activadas por la clasificación de los protoplastos de la planta

High-resolution, cell type-specific analysis of gene expression greatly enhances understanding of developmental regulation and responses to environmental ...

Comprehensive Compositional Analysis of Plant Cell Walls (Lignocellulosic biomass) Part I: Lignin

Comprehensive Compositional Analysis of Plant Cell Walls Lignocellulosic biomass Part I: Lignin

Análisis Integral de la composición de las paredes celulares vegetales (biomasa lignocelulósica) Parte I: La lignina

The need for renewable, carbon neutral, and sustainable raw materials for industry and society has become one of the most pressing issues for the 21st ...

Comprehensive Compositional Analysis of Plant Cell Walls (Lignocellulosic biomass) Part II: Carbohydrates

Comprehensive Compositional Analysis of Plant Cell Walls Lignocellulosic biomass Part II: Carbohydrates

Análisis Integral de la composición de las paredes celulares vegetales (biomasa lignocelulósica) Parte II: Los hidratos de carbono

A Novel Bayesian Change-point Algorithm for Genome-wide Analysis of Diverse ChIPseq Data Types

Un bayesiano novela Cambio de punto Algoritmo para el Genoma en todo el análisis de diversos tipos de datos ChIPseq

ChIPseq is a widely used technique for investigating protein-DNA interactions. Read density profiles are generated by using next-sequencing of ...

Efficient and Rapid Isolation of Early-stage Embryos from Arabidopsis thaliana Seeds

Efficient and Rapid Isolation of Early-stage Embryos from Arabidopsis thaliana Seeds

Aislamiento eficaz y rápida de los embriones en etapa temprana de<em&gt; Arabidopsis thaliana</em&gt; Semillas

In flowering plants, the embryo develops within a nourishing tissue - the endosperm - surrounded by the maternal seed integuments (or seed coat). As a ...

Metabolic Labeling and Membrane Fractionation for Comparative Proteomic Analysis of Arabidopsis thaliana Suspension Cell Cultures

Metabolic Labeling and Membrane Fractionation for Comparative Proteomic Analysis of Arabidopsis thaliana Suspension Cell Cultures

Metabólicas etiquetado y de membrana de fraccionamiento para Comparativo Proteómica Análisis de<em&gt; Arabidopsis thaliana</em&gt; Culturas suspensión celular

Plasma membrane microdomains are features based on the physical properties of the lipid and sterol environment and have particular roles in signaling ...

Isolation and Physiological Analysis of Mouse Cardiomyocytes

Aislamiento y fisiológica Análisis de Ratón cardiomiocitos

Cardiomyocytes, the workhorse cell of the heart, contain exquisitely organized cytoskeletal and contractile elements that generate the contractile force ...

An Efficient Method for Quantitative, Single-cell Analysis of Chromatin Modification and Nuclear Architecture in Whole-mount Ovules in Arabidopsis

An Efficient Method for Quantitative, Single-cell Analysis of Chromatin Modification and Nuclear Architecture in Whole-mount Ovules in Arabidopsis

Un método eficaz para Cuantitativo, Análisis de celda única de la cromatina modificación y Arquitectura Nuclear en Todo el montaje en Óvulos<em&gt; Arabidopsis</em

In flowering plants, the somatic-to-reproductive cell fate transition is marked by the specification of spore mother cells (SMCs) in floral organs of the ...

Isolation and Compositional Analysis of Plant Cuticle Lipid Polyester Monomers

Aislamiento y composicional Análisis de Planta cutícula lípidos poliéster Monómeros

Terrestrial plants produce extracellular aliphatic biopolyesters that modify cell walls of specific tissues. Epidermal cells synthesize cutin, a polyester ...