Name: isolation and transcriptome analysis of plant cell types
Uploaded: 2023-04-07T12:40:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Isolation and Transcriptome Analysis of Plant Cell Types at JoVE.com

Vi satte upp detta protokoll i encellsanläggningen för multi-omics vid School of Agriculture and Biology, Shanghai Jiao Tong University, och stöddes av National Natural Science Foundation of China (Grant No. 32070608), Shanghai Pujiang Program (Grant No. 20PJ1405800) och Shanghai Jiao Tong University (Grant Nos. Agri-X20200202, 2019TPB05).

Följande protokoll har optimerats för A. thaliana vildtypsfrön (WT) utan fluorescens och fluorescerande markörlinjer för följande rotcellstyper: xylempoliska pericykelceller (J0121), laterala rotinitialceller, laterala rotlockceller (J3411), endodermis och cortexceller (J0571) (figur 1A). Alla markörlinjer erhölls från en kommersiell källa (se materialförteckning), förutom den laterala rotinitieringscellmarkörlinjen, som genererades genom att införa en...

<ol>
	<li>Zhang, T. -. Q., Chen, Y., Liu, Y., Lin, W. -. H., Wang, J. -. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-cell+transcriptome+atlas+and+chromatin+accessibility+landscape+reveal+differentiation+trajectories+in+the+rice+root.">Single-cell transcriptome atlas and chromatin accessibility landscape reveal differentiation trajectories in the rice root.</a> Nature Communications. 12 (1), 2053 (2021).</li><li>Denyer, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spatiotemporal+developmental+trajectories+in+the+Arabidopsis+root+revealed+using+high-throughput+single-cell+RNA+sequencing.">Spatiotemporal developmental trajectories in the Arabidopsis root revealed using high-throughput single-cell RNA sequencing.</a> Developmental Cell. 48 (6), 840-852 (2019).</li><li>Liu, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transcriptional+landscape+of+rice+roots+at+the+single-cell+resolution.">Transcriptional landscape of rice roots at the single-cell resolution.</a> Molecular Plant. 14 (3), 384-394 (2021).</li><li>Liu, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Global+dynamic+molecular+profiling+of+stomatal+lineage+cell+development+by+single-cell+RNA+sequencing.">Global dynamic molecular profiling of stomatal lineage cell development by single-cell RNA sequencing.</a> Molecular Plant. 13 (8), 1178-1193 (2020).</li><li>Shahan, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+single-cell+Arabidopsis+root+atlas+reveals+developmental+trajectories+in+wild-type+and+cell+identity+mutants.">A single-cell Arabidopsis root atlas reveals developmental trajectories in wild-type and cell identity mutants.</a> Developmental Cell. 57 (4), 543-560 (2022).</li><li>Wendrich, J. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Vascular+transcription+factors+guide+plant+epidermal+responses+to+limiting+phosphate+conditions.">Vascular transcription factors guide plant epidermal responses to limiting phosphate conditions.</a> Science. 370 (6518), (2020).</li><li>Carter, A. D., Bonyadi, R., Gifford, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+use+of+fluorescence-activated+cell+sorting+in+studying+plant+development+and+environmental+responses.">The use of fluorescence-activated cell sorting in studying plant development and environmental responses.</a> The International Journal of Developmental Biology. 57 (6-8), 545-552 (2013).</li><li>Picelli, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Full-length+RNA-seq+from+single+cells+using+Smart-seq2.">Full-length RNA-seq from single cells using Smart-seq2.</a> Nature Protocols. 9 (1), 171-181 (2014).</li><li>Wang, X., He, Y., Zhang, Q., Ren, X., Zhang, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Direct+comparative+analyses+of+10X+genomics+chromium+and+Smart-seq2.">Direct comparative analyses of 10X genomics chromium and Smart-seq2.</a> Genomics Proteomics Bioinformatics. 19 (2), 253-266 (2021).</li><li>Serrano-Ron, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reconstruction+of+lateral+root+formation+through+single-cell+RNAsequencing+reveals+order+of+tissue+initiation.">Reconstruction of lateral root formation through single-cell RNAsequencing reveals order of tissue initiation.</a> Molecular Plant. 14 (8), 1362-1378 (2021).</li><li>Hashimshony, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CEL-Seq2:+Sensitive+highly-multiplexed+single-cell+RNA-Seq.">CEL-Seq2: Sensitive highly-multiplexed single-cell RNA-Seq.</a> Genome Biology. 17, 77 (2016).</li><li>Macaulay, I. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=G&amp;T-seq:+Parallel+sequencing+of+single-cell+genomes+and+transcriptomes.">G&amp;T-seq: Parallel sequencing of single-cell genomes and transcriptomes.</a> Nature Methods. 12 (6), 519-522 (2015).</li><li>Angermueller, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Parallel+single-cell+sequencing+links+transcriptional+and+epigenetic+heterogeneity.">Parallel single-cell sequencing links transcriptional and epigenetic heterogeneity.</a> Nature Methods. 13 (3), 229-232 (2016).</li><li>De Rybel, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+aux/IAA28+signaling+cascade+activates+GATA23-dependent+specification+of+lateral+root+founder+cell+identity.">A novel aux/IAA28 signaling cascade activates GATA23-dependent specification of lateral root founder cell identity.</a> Current Biology. 20 (19), 1697-1706 (2010).</li><li>Duncombe, S. G., Barnes, W. J., Anderson, C. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+the+delivery+and+behavior+of+cellulose+synthases+in+Arabidopsis+thaliana+using+confocal+microscopy.">Imaging the delivery and behavior of cellulose synthases in Arabidopsis thaliana using confocal microscopy.</a> Methods in Cell Biology. 160, 201-213 (2020).</li><li>Levy, S. E., Myers, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Advancements+in+next-generation+sequencing.">Advancements in next-generation sequencing.</a> Annual Review of Genomics and Human Genetics. 17 (1), 95-115 (2016).</li><li>Ooi, C. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-throughput+full-length+single-cell+mRNA-seq+of+rare+cells.">High-throughput full-length single-cell mRNA-seq of rare cells.</a> PLoS One. 12 (11), e0188510 (2017).</li><li>Pertea, M., Kim, D., Pertea, G. M., Leek, J. T., Salzberg, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transcript-level+expression+analysis+of+RNA-seq+experiments+with+HISAT,+StringTie+and+Ballgown.">Transcript-level expression analysis of RNA-seq experiments with HISAT, StringTie and Ballgown.</a> Nature Protocols. 11 (9), 1650-1667 (2016).</li><li>Tsyganov, K., Perry, A., Archer, S., Powell, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RNAsik:+A+Pipeline+for+complete+and+reproducible+RNA-seq+analysis+that+runs+anywhere+with+speed+and+ease.">RNAsik: A Pipeline for complete and reproducible RNA-seq analysis that runs anywhere with speed and ease.</a> Journal of Open Source Software. 3, 583 (2018).</li><li>Love, M. I., Huber, W., Anders, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Moderated+estimation+of+fold+change+and+dispersion+for+RNA-seq+data+with+DESeq2.">Moderated estimation of fold change and dispersion for RNA-seq data with DESeq2.</a> Genome Biology. 15 (12), 550 (2014).</li><li>Kamiya, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+MYB36+transcription+factor+orchestrates+Casparian+strip+formation.">The MYB36 transcription factor orchestrates Casparian strip formation.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 112 (33), 10533-10538 (2015).</li><li>Zhang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Two+types+of+bHLH+transcription+factor+determine+the+competence+of+the+pericycle+for+lateral+root+initiation.">Two types of bHLH transcription factor determine the competence of the pericycle for lateral root initiation.</a> Nature Plants. 7 (5), 633-643 (2021).</li><li>Haecker, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expression+dynamics+of+WOX+genes+mark+cell+fate+decisions+during+early+embryonic+patterning+in+Arabidopsis+thaliana.">Expression dynamics of WOX genes mark cell fate decisions during early embryonic patterning in Arabidopsis thaliana.</a> Development. 131 (3), 657-668 (2004).</li><li>Chen, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Auxin+overproduction+in+shoots+cannot+rescue+auxin+deficiencies+in+Arabidopsis+roots.">Auxin overproduction in shoots cannot rescue auxin deficiencies in Arabidopsis roots.</a> Plant Cell Physiol. 55 (6), 1072-1079 (2014).</li><li>Nichterwitz, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Laser+capture+microscopy+coupled+with+Smart-seq2+for+precise+spatial+transcriptomic+profiling.">Laser capture microscopy coupled with Smart-seq2 for precise spatial transcriptomic profiling.</a> Nature Communications. 7, 12139 (2016).</li><li>Long, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nurse+cell--derived+small+RNAs+define+paternal+epigenetic+inheritance+in+Arabidopsis.">Nurse cell--derived small RNAs define paternal epigenetic inheritance in Arabidopsis.</a> Science. 373 (6550), (2021).</li><li>Gutzat, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Arabidopsis+shoot+stem+cells+display+dynamic+transcription+and+DNA+methylation+patterns.">Arabidopsis shoot stem cells display dynamic transcription and DNA methylation patterns.</a> EMBO Journal. 39 (20), e103667 (2020).</li></ol>

Det Smart-seq2-baserade protokollet kan generera tillförlitliga sekvenseringsbibliotek från flera hundra celler8. Utgångsmaterialets kvalitet är avgörande för transkriptomanalysens noggrannhet. FACS är ett kraftfullt verktyg för att förbereda celler av intresse, men denna procedur, särskilt protoplastionssteget, måste optimeras för växtapplikationer. Laserinfångningsmikrodissektion (LCM) eller manuella dissekerade celler kan också användas som ingång25,26<s...

Celler är den grundläggande enheten för alla levande organismer och utför strukturella och fysiologiska funktioner. Även om cellerna i flercelliga organismer visar uppenbar synkronicitet, uppvisar celler av olika typer och enskilda celler skillnader i deras transkriptom under utveckling och miljösvar. High-throughput single-cell RNA-sekvensering (scRNA-seq) ger oöverträffad kraft för att förstå cellulär heterogenitet. Tillämpning av scRNA-seq inom växtvetenskap har bidragit till att framgångsrikt konstruera en växtcellatlas1, har använts för att identifiera sällsynta cellulära taxa i växtvävnader2, har gett insikt i sammansättningen av celltyper i växtvävnader och har använts för att identifiera cellulär identitet och viktiga funktioner som används under växtutveckling och differentiering. Dessutom är det möjligt att härleda spatiotemporala utvecklingsbanor i växtvävnader 1,2,3 för att upptäcka nya markörgener4 och studera funktionerna hos viktiga transkriptionsfaktorer 5 med hjälp av scRNA-seq för att avslöja det evolutionära bevarandet av samma celltyp i olika växter 3. Abiotiska påfrestningar är bland de viktigaste miljöpåverkan på växttillväxt och utveckling. Genom att utforska förändringarna i sammansättningen av celltyper i växtvävnader under olika behandlingsförhållanden genom encellstranskriptomsekvensering kan man också lösa den abiotiska stressresponsmekanismen6.
Potentialen för att lösa transkriptionell heterogenitet mellan celltyper med scRNA-sekvensering beror på cellisoleringsmetoden och sekvenseringsplattformen. Fluorescensaktiverad cellsortering (FACS) är en allmänt använd teknik för att isolera en subpopulation av celler för scRNA-seq baserat på ljusspridning och cellernas fluorescensegenskaper. Utvecklingen av fluorescerande markörlinjer med transgen teknik har avsevärt förbättrat effektiviteten av cellisolering med FACS7. Att genomföra scRNA-seq med Smart-seq28 förbättrar ytterligare förmågan att dissekera den cellulära heterogeniteten. Smart-seq2-metoden har god känslighet för gendetektion och kan detektera gener även med låg transkriptingång9. Förutom insamling av bulkcelltyp tillhandahåller moderna cellsorterare ett sorteringsformat för encellsindex, vilket möjliggör transkriptomanalys vid encellsupplösning med Smart-seq210 eller andra multiplexerade RNA-seq-metoder, såsom CEL-seq211. Sortering av encells- eller celltyp kan potentiellt användas för många andra nedströmsapplikationer, såsom parallella multi-omics-studier12,13. Här presenteras ett robust och mångsidigt protokoll för att isolera växtcelltyper, såsom xylem-pole pericykelceller, laterala rotlockceller, laterala rotinitialceller, cortexceller och endodermala celler från rötterna till Arabidopsis thaliana markörcellinjer av FACS. Protokollet innefattar vidare att konstruera Smart-seq2-biblioteket för transkriptomanalys nedströms.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>0.22 &#181;m strainer</td>
			<td>Sorfa&#160;</td>
			<td>622110</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agar</td>
			<td>Yeasen</td>
			<td>70101ES76</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agilent fragment analyzer</td>
			<td>Aglient</td>
			<td>Aglient 5200</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agilent high-sensitivity DNA kit</td>
			<td>Aglient</td>
			<td>DNF-474-0500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ampure XP beads</td>
			<td>BECKMAN</td>
			<td>A63881</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Betaine</td>
			<td>yuanye</td>
			<td>S18046-100g</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bleach</td>
			<td>Mr Muscle</td>
			<td>FnBn83BK</td>
			<td>20% (v/v) bleach</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BSA</td>
			<td>sigma</td>
			<td>9048-46-8</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CaCl2</td>
			<td>yuanye</td>
			<td>S24109-500g</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cellulase R10</td>
			<td>Yakult (Japan)</td>
			<td>9012-54-8</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cellulase RS</td>
			<td>Yakult (Japan)</td>
			<td>9012-54-8</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge tube (1.5 mL)</td>
			<td>Eppendolf</td>
			<td>30121589</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNase, RNase, DNA and RNA Away Surface Decontaminants</td>
			<td>Beyotime</td>
			<td>R0127</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>dNTPs (10 mM)</td>
			<td>NEB</td>
			<td>N0447S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DTT (0.1 M)</td>
			<td> 
			invitrogen</td>
			<td>18090050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol</td>
			<td>Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd</td>
			<td>100092680</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FACS</td>
			<td>BD FACS Melody</td>
			<td>BD-65745</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FACS</td>
			<td>Sony</td>
			<td>SH800S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Filter tip&#160; (1000 &#181;L)</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>TF112-1000-Q</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Filter tip&#160; (200 &#181;L)</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>TF140-200-Q</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Filter tip (10 &#181;L)</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>TF104-10-Q</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Filter tip (100 &#181;L)</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>TF113-100-Q</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluorescent microscope</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>Eclipse Ni-E</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Four-Dimensional Rotating Mixer</td>
			<td>Kylin -Bell</td>
			<td>BE-1100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hemicellulase</td>
			<td>sigma</td>
			<td>9025-56-3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IS PCR primer</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>5&#39;-AAGCAGTGGTATCAACGCAGAG 
			T-3&#39;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KAPA HiFi HotStart ReadyMix(2X)</td>
			<td>Roche&#160;</td>
			<td>7958935001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KCl</td>
			<td>Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd</td>
			<td>7447-40-7</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Macerozyme R10</td>
			<td>Yakult (Japan)</td>
			<td>9032-75-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnetic separation stand</td>
			<td>invitrogen</td>
			<td>12321D</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mannitol</td>
			<td>aladdin</td>
			<td>69-65-8</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MES</td>
			<td>aladdin</td>
			<td>145224948</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MgCl2&#160;</td>
			<td>yuanye</td>
			<td>R21455-500ml</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microcentrifuges</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>Centrifuge 5425</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micro-mini-centrifuge</td>
			<td>Titan</td>
			<td>Timi-10k</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MS</td>
			<td>Phytotech</td>
			<td>M519</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nextera XT DNA Library Preparation Kit</td>
			<td>illumina</td>
			<td>FC-131-1024</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>oligo-dT30VN primer</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>5&#39;-AAGCAGTGGTATCAACGCAGAG 
			TACTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTT 
			TTTTTTTTTTVN-3&#39;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PCR instrument</td>
			<td>Thermal cycler</td>
			<td>A24811</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pectolyase</td>
			<td>Yakult (Japan)</td>
			<td>9033-35-6</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plant marker lines</td>
			<td>Nottingham Arabidopsis Stock Centre (NASC)</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Qubit 1x dsDNA HS Assay Kit</td>
			<td>invitrogen</td>
			<td>Q33231</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Qubit 2.0 fluorometer</td>
			<td>invitrogen</td>
			<td>Q32866</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNase inhibitor&#160;</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>EO0382</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNase-free water</td>
			<td>invitrogen</td>
			<td>10977023</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Solution A</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>400 mM mannitol, 0.05 % BSA , 20 mM MES (pH5.7), 10 mM CaCl2, 20 mM KCl</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Solution B</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>1 % (w/v)cellulase R10, 1 % (w/v) cellulase RS, 1 %&#160; (w/v)hemicellulase, 0.5 %&#160; (w/v)pectolyase and 1 %&#160; (w/v) Macerozyme R10 of in a fresh aliquot of solution A</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile pestle</td>
			<td>BIOTREAT</td>
			<td>453463</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Strainer (40 &#181;m )</td>
			<td>Sorfa&#160;</td>
			<td>251100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Superscript enzyme (200 U/&#181;L)</td>
			<td>invitrogen</td>
			<td>18090050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SuperScript VI buffer (5x)</td>
			<td>invitrogen</td>
			<td>18090050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T0est tube (5 mL)</td>
			<td>BD Falcon</td>
			<td>352052</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thin-walled PCR tubes with caps (0.5 mL)</td>
			<td>AXYGEN</td>
			<td>PCR-05-C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>Sangon Biotech</td>
			<td>A600198-0500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TSO primer</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>5&#39;-AAGCAGTGGTATCAACGCAGAG 
			TACATrGrG+G-3&#39;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vortex</td>
			<td>Titan</td>
			<td>VM-T2</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

isolation and transcriptome analysis of plant cell types

I flercelliga organismer kan utvecklingsprogrammering och miljösvar vara mycket divergerande i olika celltyper eller till och med inom celler, vilket är känt som cellulär heterogenitet. Under de senaste åren har isolering av encells- och celltyp i kombination med nästa generations sekvenseringstekniker (NGS) blivit viktiga verktyg för att studera biologiska processer med encellsupplösning. Att isolera växtceller är emellertid relativt svårare på grund av närvaron av växtcellväggar, vilket begränsar tillämpningen av encelliga metoder i växter. Detta protokoll beskriver en robust procedur för fluorescensaktiverad cellsortering (FACS)-baserad encells- och celltypisolering med växtceller, vilket är lämpligt för nedströms multi-omics-analys och andra studier. Med hjälp av Arabidopsis rotfluorescerande markörlinjer demonstrerar vi hur specifika celltyper, såsom xylem-pole pericycle-celler, laterala rotinitialceller, laterala rotlockceller, cortexceller och endodermala celler, isoleras. Dessutom tillhandahålls en effektiv nedströms transkriptomanalysmetod med Smart-seq2. Cellisoleringsmetoden och transkriptomanalysteknikerna kan anpassas till andra celltyper och växtarter och har bred tillämpningspotential inom växtvetenskap.

Protoplast isolering Detta protokoll är effektivt för protoplastsortering av fluorescerande A. thaliana rotmarkörlinjer. Dessa markörlinjer har utvecklats genom fusion av fluorescerande proteiner med gener som uttrycks specifikt i målcelltyper, eller med hjälp av förstärkare fälllinjer (figur 1). Många vävnader och organ har dissekerats i celltyper som uttrycker specifika fluorescerande markörer i modellväxter och grödor.
<p class="jove_content"...

Watch this Scientific Journal Video about Isolation and Transcriptome Analysis of Plant Cell Types at JoVE.com

Isolation and Transcriptome Analysis of Plant Cell Types

Genomförbarheten och effektiviteten av scRNA-seq-metoder med hög genomströmning förebådar en encellsera i växtforskning. Här presenteras en robust och komplett procedur för att isolera specifika Arabidopsis thaliana rotcellstyper och efterföljande transkriptombibliotekskonstruktion och analys.

Isolering och transkriptomanalys av växtcelltyper

In multicellular organisms, developmental programming and environmental responses can be highly divergent in different cell types or even within cells, ...

Transkriptomanalys på enstaka cell- eller celltyper kan upptäcka den subtila skillnaden i genuttryck som maskeras av heterogenitet, vilket är ett kraftfullt verktyg för att avslöja de utarbetade intracellulära regleringsmekanismerna. Fluorescensaktiverad cellsortering följt av RN-seq-analys kan utföras på antingen encells- eller bulkcelltypsläge med hög transkriptdetekteringskänslighet och kompatibilitet med andra multi-omiska metoder. Första gången användare av detta protokoll måste vara uppmärksamma på några steg i protoplastsorteringen och RNA-seq-biblioteksberedningen.Tillsammans med Jun Zhang kommer Dr.Rongrong Xie, en postdoktor vid vårt laboratorium, att hjälpa till att demonstrera proceduren. Börja med att sätta Arabidopsis thaliana vildtyp och fluorescerande markörlinjefrön i 20% blekmedel och inkubera med en roterande inkubator vid rumstemperatur i 15 minuter för att sterilisera fröna. När du arbetar på en steril bänk, skölj fröna tre till fem gånger i dubbeldestillerat vatten.Platta vildtypen och reporterlinjefrön på halvstyrka MS-medium med 0,8% vikt per volymagar. Stratifiera växterna i två dagar vid fyra grader Celsius. Odla dem sedan vertikalt i fem dagar vid 23 grader Celsius under 16-timmars ljus och 18-timmars mörka cykler.Tina försiktigt de protoblastlösningar som kallas lösning A och lösning B på is före experimentet. Skär av rötterna från växterna med ett rent blad eller sax och hugga rötterna i cirka 0,5 centimeter bitar. Sänk ner de hackade rötterna i 1,5 ml lösning B följt av mild rotation vid rumstemperatur i 1,5 till 2 timmar.Filtrera de resulterande rotprotoplasterna genom ett 40 mikron silnät och skölj nätet med en till två milliliter lösning A.Centrifugera de kombinerade filtraten vid 300 G i fem minuter vid fyra grader Celsius. Kassera supernatanten med en pipett, suspendera cellpelleten i 500 till 600 mikroliter lösning A och lägg den omedelbart på is. För cellsortering, överför den återsuspenderade celllösningen till ett nytt fem milliliter provrör.Fyll mantelvätsketanken och kontrollera avfallstanken. Slå sedan på den fluorescensaktiverade cellsorterings- eller FACS-maskinen. Utför instrumentinställningar och automatisk kalibrering på sorteraren.Välj fluorescenskanalerna och använd en vildtypsväxt utan fluorescens som baslinjekontroll. Justera sorteringsgrinden baserat på fluorescensintensiteten och undersegarna för framåtspridning och sidospridning. Efter tillsats av 500 mikroliter lösning A i ett 1, 5 ml uppsamlingsrör, börja sortera och samla 2 000 till 3 000 celler per rör.Efter sortering, placera omedelbart proverna på is. Centrifugera uppsamlingsröret som innehåller cellerna vid 300 G och fyra grader Celsius i fem minuter och avlägsna supernatanten med en pipett. Ta två mikroliter sorterade celler och kontrollera fluorescens med hjälp av ett fluorescensmikroskop.Förvara de sorterade cellerna vid minus 80 grader Celsius om de inte används omedelbart. För sortering av encellsindex, placera 96-brunnsplattan med membran i adaptern. Kalibrera plattans position så att droppen faller i plattans mitthål.Ta bort membranet från 96-brunnsplattan och placera 96-brunnsplattan i adaptern. Välj sorteringsläge för en cell vid sortering. Ange målantalet sorterade celler som en och börja sortera.Innan du börjar experimentet, rengör bänken med en ytdekontaminant och 75% etanol. Använd all utrustning endast för att sekvensera biblioteksförberedelser. Efter tillsats av en mikroliter nyberedd blandning A i det sorterade provet, slipa det med en steril stöt.Använd RNAse-fritt vatten och fyll på volymen till 14 mikroliter. Överför sedan varje prov till 0,2 ml tunnväggigt PCR-rör. Bered sedan blandning B.Tillsätt 4,4 mikroliter i blandning B till varje PCR-rör som innehåller prover och blanda genom försiktig pipettering.Inkubera proverna vid 72 grader Celsius i tre minuter. Efter inkubation, lägg omedelbart proverna på is för att hybridisera oligo dT till poly-A-svansen. Bered reaktionsblandningen med omvänd transkription eller blandning C i en 21,6 mikroliter av den till varje rör som innehåller proverna.Utsätt proverna för omvänd transkriptionsreaktion i ett vanligt PCR-instrument enligt det omvända transkriptionsprogrammet. Tillsätt 40,8 mikroliter av den nyberedda föramplifieringsreaktionsblandningen eller blandningen D till reaktionsprodukten med omvänd transkription och kör förförstärkningsprogrammet. Förstärkningscykeln kan bestämmas med kvantitativ PCR när reaktionen bara går in i exponentiell fas.För att rena förförstärkningsreaktionsprodukterna, överför de förförstärkta produkterna från ett PCR-rör till ett 1,5 ml rör. Tillsätt 48 mikroliter AMPure XP-pärlor i varje prov och blanda försiktigt genom pipettering före inkubation. Placera 1,5 milliliterrören som innehåller proverna och pärlorna på ett magnetiskt separationsstativ i fem minuter.Kassera försiktigt supernatanten från proverna utan att störa pärlorna. Efter resuspendering av dem i 200 mikroliter 80% etanol, placera dem på magnetseparationsstället i ytterligare tre minuter. Efter kassering av etanolen som innehåller supernatant, lufttorka proverna i ett rör i 10 minuter.Resuspendera pärlorna i 20 mikroliter nukleasfritt vatten och inkubera vid rumstemperatur i fem minuter. Placera dem sedan på det magnetiska separationsstället i fem minuter. Överför 18 mikroliter av supernatanten från varje rör till ett nytt 1,5 ml centrifugrör med pipett.Slutligen följer du stegen som beskrivs i texten för att karakterisera förbiblioteket, följt av bibliotekskonstruktion, rening och kvantifiering. De fluorescerande Arabidopsis thaliana-markörlinjerna utvecklades genom att smälta fluorescerande proteiner med gener uttryckta specifikt i målcelltyper eller genom att använda förstärkare. De fluorescensspecifika markerade protoplasterna sorterades framgångsrikt baserat på fluorescensintensiteten och framåtspridning och sidospridningssingletter.De sorterade cellerna visualiserades med hjälp av ljusfält och fluorescensavbildning. De representativa resultaten av RNA-sekvenseringsbiblioteket på cirka 2 000 xylempolpericykelceller, laterala rotprimordiala celler, endodermis- eller cortexceller och laterala rotlockceller visas. Ett litet bibliotek med primer- eller adapterdimertoppar kan fortfarande sekvenseras efter storleksval.Ett bibliotek med en onormal storleksfördelning indikerade misslyckad biblioteksförberedelse. Genuttrycksmönstren analyserades. Generna anrikade i någon av de fyra rotcellstyperna grupperades och avbildades i en värmekarta som visade specificiteten av genuttryck bland olika celltyper.Hög kvalitet och renhet hos målceller genom korrekt grindning och sortering och förebyggande av RNA-nedbrytning är nyckeln till framgångsrik bibliotekskonstruktion. För RNA-seq i single cell mode har flera metoder integrerade med den unika molekylära identifieraren rapporterats nyligen vilket avsevärt förbättrat prestandan.

Research

JoVE Journal

Biology

Mating and Tetrad Separation of Chlamydomonas reinhardtii for Genetic Analysis

Mating and Tetrad Separation of Chlamydomonas reinhardtii for Genetic Analysis

Parning och tetrad Separation av Chlamydomonas reinhardtii För genetisk analys

The unicellular green alga Chlamydomonas reinhardtii (Chlamydomonas) has become a popular organism for research in diverse areas of cell biology and ...

Fluorescence Activated Cell Sorting of Plant Protoplasts

Fluorescens Aktiverade cellsortering för växt Protoplasts

High-resolution, cell type-specific analysis of gene expression greatly enhances understanding of developmental regulation and responses to environmental ...

Comprehensive Compositional Analysis of Plant Cell Walls (Lignocellulosic biomass) Part I: Lignin

Comprehensive Compositional Analysis of Plant Cell Walls Lignocellulosic biomass Part I: Lignin

Omfattande analysen av sammansättningen av växternas cellväggar (lignocellulosa) Del I: Lignin

The need for renewable, carbon neutral, and sustainable raw materials for industry and society has become one of the most pressing issues for the 21st ...

Comprehensive Compositional Analysis of Plant Cell Walls (Lignocellulosic biomass) Part II: Carbohydrates

Comprehensive Compositional Analysis of Plant Cell Walls Lignocellulosic biomass Part II: Carbohydrates

Omfattande analysen av sammansättningen av växternas cellväggar (lignocellulosa) Del II: Kolhydrater

A Novel Bayesian Change-point Algorithm for Genome-wide Analysis of Diverse ChIPseq Data Types

A Novel Bayesian Change-punkt Algoritm för Genomvid analys av olika ChIPseq datatyper

ChIPseq is a widely used technique for investigating protein-DNA interactions. Read density profiles are generated by using next-sequencing of ...

Efficient and Rapid Isolation of Early-stage Embryos from Arabidopsis thaliana Seeds

Efficient and Rapid Isolation of Early-stage Embryos from Arabidopsis thaliana Seeds

Effektiv och snabb isolering av tidigt stadium embryon från<em&gt; Arabidopsis thaliana</em&gt; Frön

In flowering plants, the embryo develops within a nourishing tissue - the endosperm - surrounded by the maternal seed integuments (or seed coat). As a ...

Metabolic Labeling and Membrane Fractionation for Comparative Proteomic Analysis of Arabidopsis thaliana Suspension Cell Cultures

Metabolic Labeling and Membrane Fractionation for Comparative Proteomic Analysis of Arabidopsis thaliana Suspension Cell Cultures

Metabola Märkning och Membrane Fraktione för jämförande proteomik analys av<em&gt; Arabidopsis thaliana</em&gt; Fjädring cellkulturer

Plasma membrane microdomains are features based on the physical properties of the lipid and sterol environment and have particular roles in signaling ...

Isolation and Physiological Analysis of Mouse Cardiomyocytes

Isolering och fysiologisk Analys av Mus Cardiomyocytes

Cardiomyocytes, the workhorse cell of the heart, contain exquisitely organized cytoskeletal and contractile elements that generate the contractile force ...

An Efficient Method for Quantitative, Single-cell Analysis of Chromatin Modification and Nuclear Architecture in Whole-mount Ovules in Arabidopsis

An Efficient Method for Quantitative, Single-cell Analysis of Chromatin Modification and Nuclear Architecture in Whole-mount Ovules in Arabidopsis

En effektiv metod för kvantitativ, analys Encelliga av Chromatin Ändring och Nuclear Arkitektur i hela-fäste fröämnen i<em&gt; Arabidopsis</em

In flowering plants, the somatic-to-reproductive cell fate transition is marked by the specification of spore mother cells (SMCs) in floral organs of the ...

Isolation and Compositional Analysis of Plant Cuticle Lipid Polyester Monomers

Isolering och analysen av sammansättningen av Kutikula Lipid Polyester monomerer

Terrestrial plants produce extracellular aliphatic biopolyesters that modify cell walls of specific tissues. Epidermal cells synthesize cutin, a polyester ...