Name: isolation and transcriptome analysis of plant cell types
Uploaded: 2023-04-07T12:40:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Isolation and Transcriptome Analysis of Plant Cell Types at JoVE.com

Bu protokolü Şangay Jiao Tong Üniversitesi Tarım ve Biyoloji Fakültesi'nin tek hücreli multi-omik tesisinde kurduk ve Çin Ulusal Doğa Bilimleri Vakfı (Hibe No. 32070608), Şangay Pujiang Programı (Hibe No. 20PJ1405800) ve Şangay Jiao Tong Üniversitesi (Hibe No. Agri-X20200202, 2019TPB05) tarafından desteklendik.

Aşağıdaki protokol, aşağıdaki kök hücre tipleri için floresan ve floresan işaretleyici çizgileri olmayan A. thaliana vahşi tip (WT) tohumlar için optimize edilmiştir: ksilem-kutuplu perisiklus hücreleri (J0121), lateral kök başlangıç hücreleri, lateral kök kapak hücreleri (J3411), endodermis ve korteks hücreleri (J0571) (Şekil 1A). Tüm işaretleyici çizgileri, daha önce yayınlanmış bir rapor14'ü takiben vahşi tip bir Arabid...

<ol>
	<li>Zhang, T. -. Q., Chen, Y., Liu, Y., Lin, W. -. H., Wang, J. -. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-cell+transcriptome+atlas+and+chromatin+accessibility+landscape+reveal+differentiation+trajectories+in+the+rice+root.">Single-cell transcriptome atlas and chromatin accessibility landscape reveal differentiation trajectories in the rice root.</a> Nature Communications. 12 (1), 2053 (2021).</li><li>Denyer, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spatiotemporal+developmental+trajectories+in+the+Arabidopsis+root+revealed+using+high-throughput+single-cell+RNA+sequencing.">Spatiotemporal developmental trajectories in the Arabidopsis root revealed using high-throughput single-cell RNA sequencing.</a> Developmental Cell. 48 (6), 840-852 (2019).</li><li>Liu, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transcriptional+landscape+of+rice+roots+at+the+single-cell+resolution.">Transcriptional landscape of rice roots at the single-cell resolution.</a> Molecular Plant. 14 (3), 384-394 (2021).</li><li>Liu, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Global+dynamic+molecular+profiling+of+stomatal+lineage+cell+development+by+single-cell+RNA+sequencing.">Global dynamic molecular profiling of stomatal lineage cell development by single-cell RNA sequencing.</a> Molecular Plant. 13 (8), 1178-1193 (2020).</li><li>Shahan, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+single-cell+Arabidopsis+root+atlas+reveals+developmental+trajectories+in+wild-type+and+cell+identity+mutants.">A single-cell Arabidopsis root atlas reveals developmental trajectories in wild-type and cell identity mutants.</a> Developmental Cell. 57 (4), 543-560 (2022).</li><li>Wendrich, J. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Vascular+transcription+factors+guide+plant+epidermal+responses+to+limiting+phosphate+conditions.">Vascular transcription factors guide plant epidermal responses to limiting phosphate conditions.</a> Science. 370 (6518), (2020).</li><li>Carter, A. D., Bonyadi, R., Gifford, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+use+of+fluorescence-activated+cell+sorting+in+studying+plant+development+and+environmental+responses.">The use of fluorescence-activated cell sorting in studying plant development and environmental responses.</a> The International Journal of Developmental Biology. 57 (6-8), 545-552 (2013).</li><li>Picelli, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Full-length+RNA-seq+from+single+cells+using+Smart-seq2.">Full-length RNA-seq from single cells using Smart-seq2.</a> Nature Protocols. 9 (1), 171-181 (2014).</li><li>Wang, X., He, Y., Zhang, Q., Ren, X., Zhang, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Direct+comparative+analyses+of+10X+genomics+chromium+and+Smart-seq2.">Direct comparative analyses of 10X genomics chromium and Smart-seq2.</a> Genomics Proteomics Bioinformatics. 19 (2), 253-266 (2021).</li><li>Serrano-Ron, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reconstruction+of+lateral+root+formation+through+single-cell+RNAsequencing+reveals+order+of+tissue+initiation.">Reconstruction of lateral root formation through single-cell RNAsequencing reveals order of tissue initiation.</a> Molecular Plant. 14 (8), 1362-1378 (2021).</li><li>Hashimshony, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CEL-Seq2:+Sensitive+highly-multiplexed+single-cell+RNA-Seq.">CEL-Seq2: Sensitive highly-multiplexed single-cell RNA-Seq.</a> Genome Biology. 17, 77 (2016).</li><li>Macaulay, I. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=G&amp;T-seq:+Parallel+sequencing+of+single-cell+genomes+and+transcriptomes.">G&amp;T-seq: Parallel sequencing of single-cell genomes and transcriptomes.</a> Nature Methods. 12 (6), 519-522 (2015).</li><li>Angermueller, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Parallel+single-cell+sequencing+links+transcriptional+and+epigenetic+heterogeneity.">Parallel single-cell sequencing links transcriptional and epigenetic heterogeneity.</a> Nature Methods. 13 (3), 229-232 (2016).</li><li>De Rybel, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+aux/IAA28+signaling+cascade+activates+GATA23-dependent+specification+of+lateral+root+founder+cell+identity.">A novel aux/IAA28 signaling cascade activates GATA23-dependent specification of lateral root founder cell identity.</a> Current Biology. 20 (19), 1697-1706 (2010).</li><li>Duncombe, S. G., Barnes, W. J., Anderson, C. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+the+delivery+and+behavior+of+cellulose+synthases+in+Arabidopsis+thaliana+using+confocal+microscopy.">Imaging the delivery and behavior of cellulose synthases in Arabidopsis thaliana using confocal microscopy.</a> Methods in Cell Biology. 160, 201-213 (2020).</li><li>Levy, S. E., Myers, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Advancements+in+next-generation+sequencing.">Advancements in next-generation sequencing.</a> Annual Review of Genomics and Human Genetics. 17 (1), 95-115 (2016).</li><li>Ooi, C. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-throughput+full-length+single-cell+mRNA-seq+of+rare+cells.">High-throughput full-length single-cell mRNA-seq of rare cells.</a> PLoS One. 12 (11), e0188510 (2017).</li><li>Pertea, M., Kim, D., Pertea, G. M., Leek, J. T., Salzberg, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transcript-level+expression+analysis+of+RNA-seq+experiments+with+HISAT,+StringTie+and+Ballgown.">Transcript-level expression analysis of RNA-seq experiments with HISAT, StringTie and Ballgown.</a> Nature Protocols. 11 (9), 1650-1667 (2016).</li><li>Tsyganov, K., Perry, A., Archer, S., Powell, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RNAsik:+A+Pipeline+for+complete+and+reproducible+RNA-seq+analysis+that+runs+anywhere+with+speed+and+ease.">RNAsik: A Pipeline for complete and reproducible RNA-seq analysis that runs anywhere with speed and ease.</a> Journal of Open Source Software. 3, 583 (2018).</li><li>Love, M. I., Huber, W., Anders, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Moderated+estimation+of+fold+change+and+dispersion+for+RNA-seq+data+with+DESeq2.">Moderated estimation of fold change and dispersion for RNA-seq data with DESeq2.</a> Genome Biology. 15 (12), 550 (2014).</li><li>Kamiya, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+MYB36+transcription+factor+orchestrates+Casparian+strip+formation.">The MYB36 transcription factor orchestrates Casparian strip formation.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 112 (33), 10533-10538 (2015).</li><li>Zhang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Two+types+of+bHLH+transcription+factor+determine+the+competence+of+the+pericycle+for+lateral+root+initiation.">Two types of bHLH transcription factor determine the competence of the pericycle for lateral root initiation.</a> Nature Plants. 7 (5), 633-643 (2021).</li><li>Haecker, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expression+dynamics+of+WOX+genes+mark+cell+fate+decisions+during+early+embryonic+patterning+in+Arabidopsis+thaliana.">Expression dynamics of WOX genes mark cell fate decisions during early embryonic patterning in Arabidopsis thaliana.</a> Development. 131 (3), 657-668 (2004).</li><li>Chen, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Auxin+overproduction+in+shoots+cannot+rescue+auxin+deficiencies+in+Arabidopsis+roots.">Auxin overproduction in shoots cannot rescue auxin deficiencies in Arabidopsis roots.</a> Plant Cell Physiol. 55 (6), 1072-1079 (2014).</li><li>Nichterwitz, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Laser+capture+microscopy+coupled+with+Smart-seq2+for+precise+spatial+transcriptomic+profiling.">Laser capture microscopy coupled with Smart-seq2 for precise spatial transcriptomic profiling.</a> Nature Communications. 7, 12139 (2016).</li><li>Long, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nurse+cell--derived+small+RNAs+define+paternal+epigenetic+inheritance+in+Arabidopsis.">Nurse cell--derived small RNAs define paternal epigenetic inheritance in Arabidopsis.</a> Science. 373 (6550), (2021).</li><li>Gutzat, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Arabidopsis+shoot+stem+cells+display+dynamic+transcription+and+DNA+methylation+patterns.">Arabidopsis shoot stem cells display dynamic transcription and DNA methylation patterns.</a> EMBO Journal. 39 (20), e103667 (2020).</li></ol>

Smart-seq2 tabanlı protokol, yüzlerce hücreden güvenilir sıralama kitaplıkları oluşturabilir8. Başlangıç malzemesinin kalitesi, transkriptom analizinin doğruluğu için esastır. FACS, ilgilenilen hücreleri hazırlamak için güçlü bir araçtır, ancak bu prosedür, özellikle de protoplasting adım, bitki uygulamaları için optimize edilmelidir. Lazer yakalama mikrodiseksiyonu (LCM) veya manuel disseke hücreler de girdi25,26 olarak kullanılabilir, bu nede...

Hücreler tüm canlı organizmaların temel birimidir ve yapısal ve fizyolojik işlevleri yerine getirir. Çok hücreli organizmalardaki hücreler belirgin bir eşzamanlılık göstermesine rağmen, farklı tipteki hücreler ve bireysel hücreler, gelişim ve çevresel tepkiler sırasında transkriptomlarında farklılıklar gösterir. Yüksek verimli tek hücreli RNA dizilimi (scRNA-seq), hücresel heterojenliği anlamak için benzeri görülmemiş bir güç sağlar. ScRNA-seq'in bitki bilimlerinde uygulanması, bir bitki hücresi atlası1'in başarılı bir şekilde oluşturulmasına katkıda bulunmuş, bitki dokularındaki nadir hücresel taksonları tanımlamak için kullanılmıştır2, bitki dokularındaki hücre tiplerinin bileşimi hakkında fikir vermiş ve hücresel kimliği ve bitki gelişimi ve farklılaşması sırasında kullanılan önemli işlevleri tanımlamak için kullanılmıştır. Ek olarak, yeni belirteç genleri keşfetmek için bitki dokularındaki uzaysal zamansal gelişimsel yörüngeleri çıkarmak mümkündür 1,2,3 4 ve farklı bitkilerde aynı hücre tipinin evrimsel korunumunu ortaya çıkarmak için scRNA-seq kullanarak önemli transkripsiyon faktörlerinin işlevlerini incelemek5. Abiyotik stresler, bitki büyümesi ve gelişimi üzerindeki en önemli çevresel etkiler arasındadır. Tek hücreli transkriptom dizilimi yoluyla farklı tedavi koşulları altında bitki dokularındaki hücre tiplerinin bileşimindeki değişiklikleri araştırarak, abiyotik stres yanıt mekanizması6'yı da çözebilirsiniz.
ScRNA dizilimini kullanarak hücre tipleri arasındaki transkripsiyonel heterojenliği çözme potansiyeli, hücre izolasyon yöntemine ve dizileme platformuna bağlıdır. Floresan ile aktive edilmiş hücre sıralama (FACS), ışık saçılmasına ve hücrelerin floresan özelliklerine dayanan scRNA-seq için hücrelerin bir alt popülasyonunu izole etmek için yaygın olarak kullanılan bir tekniktir. Transgenik teknoloji ile floresan işaretleyici hatlarının geliştirilmesi, FACS7 ile hücre izolasyonunun verimliliğini büyük ölçüde artırmıştır. Smart-seq28 kullanarak scRNA-seq iletmek, hücresel heterojeniteyi disseke etme yeteneğini daha da geliştirir. Smart-seq2 yöntemi, gen tespiti için iyi bir duyarlılığa sahiptir ve düşük bir transkript girişi9 ile bile genleri tespit edebilir. Toplu hücre tipi toplamaya ek olarak, modern hücre sıralayıcıları, Smart-seq210 veya CEL-seq211 gibi diğer çoğullanmış RNA-seq yöntemlerini kullanarak tek hücreli çözünürlükte transkriptom analizine izin veren tek hücreli bir dizin sıralama formatı sağlar. Tek hücreli veya hücre tipi sıralama, paralel multi-omik çalışmalar12,13 gibi diğer birçok aşağı akış uygulaması için potansiyel olarak kullanılabilir. Burada, ksilem-kutup perisiklus hücreleri, lateral kök kapak hücreleri, lateral kök başlangıç hücreleri, korteks hücreleri ve endodermal hücreler gibi bitki hücre tiplerini FACS tarafından Arabidopsis thaliana marker hücre hatlarının köklerinden izole etmek için sağlam ve çok yönlü bir protokol sunulmaktadır. Protokol ayrıca aşağı akış transkriptom analizi için Smart-seq2 kütüphanesinin oluşturulmasını içerir.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>0.22 &#181;m strainer</td>
			<td>Sorfa&#160;</td>
			<td>622110</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agar</td>
			<td>Yeasen</td>
			<td>70101ES76</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agilent fragment analyzer</td>
			<td>Aglient</td>
			<td>Aglient 5200</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agilent high-sensitivity DNA kit</td>
			<td>Aglient</td>
			<td>DNF-474-0500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ampure XP beads</td>
			<td>BECKMAN</td>
			<td>A63881</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Betaine</td>
			<td>yuanye</td>
			<td>S18046-100g</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bleach</td>
			<td>Mr Muscle</td>
			<td>FnBn83BK</td>
			<td>20% (v/v) bleach</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BSA</td>
			<td>sigma</td>
			<td>9048-46-8</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CaCl2</td>
			<td>yuanye</td>
			<td>S24109-500g</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cellulase R10</td>
			<td>Yakult (Japan)</td>
			<td>9012-54-8</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cellulase RS</td>
			<td>Yakult (Japan)</td>
			<td>9012-54-8</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge tube (1.5 mL)</td>
			<td>Eppendolf</td>
			<td>30121589</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNase, RNase, DNA and RNA Away Surface Decontaminants</td>
			<td>Beyotime</td>
			<td>R0127</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>dNTPs (10 mM)</td>
			<td>NEB</td>
			<td>N0447S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DTT (0.1 M)</td>
			<td> 
			invitrogen</td>
			<td>18090050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol</td>
			<td>Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd</td>
			<td>100092680</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FACS</td>
			<td>BD FACS Melody</td>
			<td>BD-65745</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FACS</td>
			<td>Sony</td>
			<td>SH800S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Filter tip&#160; (1000 &#181;L)</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>TF112-1000-Q</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Filter tip&#160; (200 &#181;L)</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>TF140-200-Q</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Filter tip (10 &#181;L)</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>TF104-10-Q</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Filter tip (100 &#181;L)</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>TF113-100-Q</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluorescent microscope</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>Eclipse Ni-E</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Four-Dimensional Rotating Mixer</td>
			<td>Kylin -Bell</td>
			<td>BE-1100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hemicellulase</td>
			<td>sigma</td>
			<td>9025-56-3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IS PCR primer</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>5&#39;-AAGCAGTGGTATCAACGCAGAG 
			T-3&#39;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KAPA HiFi HotStart ReadyMix(2X)</td>
			<td>Roche&#160;</td>
			<td>7958935001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KCl</td>
			<td>Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd</td>
			<td>7447-40-7</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Macerozyme R10</td>
			<td>Yakult (Japan)</td>
			<td>9032-75-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnetic separation stand</td>
			<td>invitrogen</td>
			<td>12321D</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mannitol</td>
			<td>aladdin</td>
			<td>69-65-8</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MES</td>
			<td>aladdin</td>
			<td>145224948</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MgCl2&#160;</td>
			<td>yuanye</td>
			<td>R21455-500ml</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microcentrifuges</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>Centrifuge 5425</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micro-mini-centrifuge</td>
			<td>Titan</td>
			<td>Timi-10k</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MS</td>
			<td>Phytotech</td>
			<td>M519</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nextera XT DNA Library Preparation Kit</td>
			<td>illumina</td>
			<td>FC-131-1024</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>oligo-dT30VN primer</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>5&#39;-AAGCAGTGGTATCAACGCAGAG 
			TACTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTT 
			TTTTTTTTTTVN-3&#39;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PCR instrument</td>
			<td>Thermal cycler</td>
			<td>A24811</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pectolyase</td>
			<td>Yakult (Japan)</td>
			<td>9033-35-6</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plant marker lines</td>
			<td>Nottingham Arabidopsis Stock Centre (NASC)</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Qubit 1x dsDNA HS Assay Kit</td>
			<td>invitrogen</td>
			<td>Q33231</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Qubit 2.0 fluorometer</td>
			<td>invitrogen</td>
			<td>Q32866</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNase inhibitor&#160;</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>EO0382</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNase-free water</td>
			<td>invitrogen</td>
			<td>10977023</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Solution A</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>400 mM mannitol, 0.05 % BSA , 20 mM MES (pH5.7), 10 mM CaCl2, 20 mM KCl</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Solution B</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>1 % (w/v)cellulase R10, 1 % (w/v) cellulase RS, 1 %&#160; (w/v)hemicellulase, 0.5 %&#160; (w/v)pectolyase and 1 %&#160; (w/v) Macerozyme R10 of in a fresh aliquot of solution A</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile pestle</td>
			<td>BIOTREAT</td>
			<td>453463</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Strainer (40 &#181;m )</td>
			<td>Sorfa&#160;</td>
			<td>251100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Superscript enzyme (200 U/&#181;L)</td>
			<td>invitrogen</td>
			<td>18090050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SuperScript VI buffer (5x)</td>
			<td>invitrogen</td>
			<td>18090050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T0est tube (5 mL)</td>
			<td>BD Falcon</td>
			<td>352052</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thin-walled PCR tubes with caps (0.5 mL)</td>
			<td>AXYGEN</td>
			<td>PCR-05-C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>Sangon Biotech</td>
			<td>A600198-0500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TSO primer</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>5&#39;-AAGCAGTGGTATCAACGCAGAG 
			TACATrGrG+G-3&#39;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vortex</td>
			<td>Titan</td>
			<td>VM-T2</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

isolation and transcriptome analysis of plant cell types

Çok hücreli organizmalarda, gelişimsel programlama ve çevresel tepkiler, farklı hücre tiplerinde ve hatta hücresel heterojenite olarak bilinen hücreler içinde oldukça farklı olabilir. Son yıllarda, yeni nesil dizileme (NGS) teknikleriyle birleştirilen tek hücreli ve hücre tipi izolasyon, biyolojik süreçleri tek hücreli çözünürlükte incelemek için önemli araçlar haline gelmiştir. Bununla birlikte, bitki hücrelerinin izole edilmesi, bitkilerde tek hücreli yaklaşımların uygulanmasını sınırlayan bitki hücre duvarlarının varlığı nedeniyle nispeten daha zordur. Bu protokol, aşağı akış multi-omik analizi ve diğer çalışmalar için uygun olan, bitki hücreleri ile floresan ile aktive edilmiş hücre sıralama (FACS) tabanlı tek hücreli ve hücre tipi izolasyon için sağlam bir prosedürü açıklamaktadır. Arabidopsis kök floresan işaretleyici çizgilerini kullanarak, ksilem-kutup perisiklus hücreleri, lateral kök başlangıç hücreleri, lateral kök kapak hücreleri, korteks hücreleri ve endodermal hücreler gibi belirli hücre tiplerinin nasıl izole edildiğini gösteriyoruz. Ayrıca, Smart-seq2 kullanan etkili bir aşağı akış transkriptom analiz yöntemi de sağlanmaktadır. Hücre izolasyon yöntemi ve transkriptom analiz teknikleri, diğer hücre tiplerine ve bitki türlerine uyarlanabilir ve bitki biliminde geniş uygulama potansiyeline sahiptir.

Protoplast izolasyonu Bu protokol, floresan A. thaliana kök işaretleyici çizgilerinin protoplast sıralaması için etkilidir. Bu belirteç çizgileri, floresan proteinlerinin özellikle hedef hücre tiplerinde eksprese edilen genlerle füzyonu veya arttırıcı tuzak çizgileri kullanılarak geliştirilmiştir (Şekil 1). Çok sayıda doku ve organ, model bitkilerde ve mahsullerde spesifik floresan belirteçleri eksprese eden hücre tiplerine diseke edilmişt...

Watch this Scientific Journal Video about Isolation and Transcriptome Analysis of Plant Cell Types at JoVE.com

Isolation and Transcriptome Analysis of Plant Cell Types

Yüksek verimli scRNA-seq yöntemlerinin fizibilitesi ve etkinliği, bitki araştırmalarında tek hücreli bir çağın habercisidir. Burada, spesifik Arabidopsis thaliana kök hücre tiplerinin izole edilmesi ve ardından transkriptom kütüphanesi yapımı ve analizi için sağlam ve eksiksiz bir prosedür sunulmaktadır.

Bitki Hücre Tiplerinin İzolasyonu ve Transkriptom Analizi

In multicellular organisms, developmental programming and environmental responses can be highly divergent in different cell types or even within cells, ...

Tek hücre veya hücre tipleri üzerindeki transkriptom analizi, ayrıntılı hücre içi düzenleyici mekanizmaları ortaya çıkarmak için güçlü bir araç olan heterojenlik tarafından maskelenen gen ekspresyonunun ince farkını tespit edebilir. Floresan ile aktive hücre sıralama ve ardından RN-seq analizi, yüksek transkript algılama hassasiyeti ve diğer multi-omik yaklaşımlarla uyumluluk ile tek hücreli veya toplu hücre tipi modunda gerçekleştirilebilir. Bu protokolün ilk kez kullananların, protoplast sıralama ve RNA-seq kütüphanesi hazırlığındaki bazı adımlara dikkat etmeleri gerekir.Jun Zhang ile birlikte, laboratuvarımızda doktora sonrası araştırmacı olan Dr. Rongrong Xie, prosedürün gösterilmesinde yardımcı olacaktır. Başlamak için, Arabidopsis thaliana vahşi tip ve floresan işaretleyici hat tohumlarını% 20 ağartıcıya koyun ve tohumları sterilize etmek için oda sıcaklığında 15 dakika boyunca dönen bir inkübatör kullanarak inkübe edin. Steril bir tezgahta çalışırken, tohumları çift damıtılmış suda üç ila beş kez durulayın.Yabani tip ve muhabir hattı tohumlarını yarı mukavemetli MS ortamına hacim agar başına% 0.8 ağırlıkla plakalayın. Bitkileri iki gün boyunca dört santigrat derecede tabakalaştırın. Daha sonra onları beş gün boyunca 16 saatlik ışık ve 18 saatlik karanlık döngüler altında 23 santigrat derecede dikey olarak büyütün.Deneyden önce buz üzerinde çözelti A ve çözelti B olarak adlandırılan protopkalıcı çözeltileri yavaşça çözün. Kökleri temiz bir bıçak veya makas kullanarak bitkilerden kesin ve kökleri yaklaşık 0,5 santimetre parçalara ayırın. Doğranmış kökleri 1,5 mililitre B çözeltisine batırın ve ardından oda sıcaklığında 1,5 ila 2 saat boyunca hafifçe döndürün.Elde edilen kök protoplastlarını 40 mikronluk bir süzgeç ağından süzün ve ağı bir ila iki mililitre çözelti ile durulayın A.Santrifüj kombine filtratları 300 G'de beş dakika boyunca dört santigrat derecede beş dakika boyunca santrifüjleyin. Süpernatantı bir pipet kullanarak atın, hücre peletini 500 ila 600 mikrolitre çözelti A'da yeniden askıya alın ve hemen buzun üzerine yerleştirin. Hücre sıralama için, askıya alınmış hücre çözeltisini yeni bir beş mililitrelik test tüpüne aktarın.Kılıf sıvısı tankını doldurun ve atık tankını kontrol edin. Ardından floresan ile etkinleştirilen hücre sıralama veya FACS makinesini açın. Cihaz kurulumunu ve otomatik kalibrasyon adımlarını ayıklayıcı üzerinde gerçekleştirin.Floresan kanallarını seçin ve temel kontrol olarak floresan içermeyen vahşi tip bir bitki kullanın. Sıralama kapısını floresan yoğunluğuna ve ileri saçılma ve yan saçılma teklilerine göre ayarlayın. 1.5 mililitrelik bir toplama tüpüne 500 mikrolitre A çözeltisi ekledikten sonra, sıralamaya başlayın ve tüp başına 2.000 ila 3.000 hücre toplayın.Sıralamadan sonra, örnekleri hemen buzun üzerine yerleştirin. Hücreleri içeren toplama tüpünü 300 G ve dört santigrat derecede beş dakika boyunca santrifüj edin ve süpernatantı bir pipetle çıkarın. İki mikrolitre sıralanmış hücre alın ve floresan mikroskobu kullanarak floresan olup olmadığını kontrol edin.Sıralanan hücreleri hemen kullanılmazsa eksi 80 santigrat derecede saklayın. Tek hücreli indeks sıralama için, membranlı 96 delikli plakayı adaptöre yerleştirin. Plakanın konumunu, damlacık plakanın orta deliğine düşecek şekilde kalibre edin.Membranı 96 delikli plakadan çıkarın ve 96 delikli plakayı adaptöre yerleştirin. Sıralama sırasında tek hücreli sıralama modunu seçin. Sıralanan hücrelerin hedef sayısını bir olarak girin ve sıralamaya başlayın.Deneye başlamadan önce, tezgahı bir yüzey dekontaminantı ve% 75 etanol ile temizleyin. Tüm ekipmanları yalnızca kütüphane hazırlığı sıralamak için kullanın. Sıralanan numuneye bir mikrolitre taze hazırlanmış karışım A ekledikten sonra, steril bir havaneyle öğütün.RNAse içermeyen su kullanarak, hacmi 14 mikrolitreye çıkarın. Daha sonra her numuneyi 0,2 mililitre ince cidarlı PCR tüpüne aktarın. Daha sonra B karışımını hazırlayın.Numune içeren her PCR tüpüne B karışımına 4,4 mikrolitre ekleyin ve nazik pipetleme ile karıştırın.Numuneleri üç dakika boyunca 72 santigrat derecede inkübe edin. Kuluçkadan sonra, oligo dT'yi poli-A kuyruğuna melezlemek için numuneleri hemen buz üzerine koyun. Ters transkripsiyon reaksiyonu karışımını veya C karışımını, numuneleri içeren her bir tüpe 21.6 mikrolitre içinde hazırlayın.Numuneleri, ters transkripsiyon programı başına ortak bir PCR cihazında ters transkripsiyon reaksiyonuna tabi tutun. Ters transkripsiyon reaksiyonu ürününe taze hazırlanmış ön amplifikasyon reaksiyonu karışımının veya karışım D'nin 40.8 mikrolitresini ekleyin ve ön amplifikasyon programını çalıştırın. Amplifikasyon döngüsü, reaksiyon üstel faza yeni girdiğinde kantitatif PCR ile belirlenebilir.Ön amplifikasyon reaksiyonu ürünlerini saflaştırmak için, önceden amplifikasyon edilmiş ürünleri bir PCR tüpünden 1,5 mililitrelik bir tüpe aktarın. Her numuneye 48 mikrolitre AMPure XP boncuk ekleyin ve inkübasyondan önce pipetleme ile hafifçe karıştırın. Numuneleri ve boncukları içeren 1,5 mililitrelik tüpleri beş dakika boyunca manyetik bir ayırma standına yerleştirin.Boncukları rahatsız etmeden süpernatantı numunelerden dikkatlice atın. Onları 200 mikrolitre% 80 etanol içinde askıya aldıktan sonra, manyetik ayırma standına üç dakika daha yerleştirin. Süpernatan içeren etanol atıldıktan sonra, numuneleri 10 dakika boyunca bir tüp içinde havayla kurutun.Boncukları 20 mikrolitre nükleaz içermeyen suda tekrar askıya alın ve oda sıcaklığında beş dakika boyunca inkübe edin. Sonra onları beş dakika boyunca manyetik ayırma standına yerleştirin. Bir pipet kullanarak, her tüpten 18 mikrolitre süpernatantı yeni bir 1,5 mililitrelik santrifüj tüpüne aktarın.Son olarak, ön kütüphaneyi karakterize etmek için metinde açıklanan adımları izleyin, ardından kütüphane yapımı, saflaştırma ve nicelleştirme izleyin. Floresan Arabidopsis thaliana marker hatları, floresan proteinlerinin özellikle hedef hücre tiplerinde eksprese edilen genlerle kaynaştırılması veya arttırıcı tuzak hatlarının kullanılmasıyla geliştirilmiştir. Floresana özgü işaretli protoplastlar, floresan yoğunluğuna ve ileri saçılma ve yan saçılma teklilerine göre başarıyla sıralandı.Sıralanan hücreler parlak alan ve floresan görüntüleme kullanılarak görselleştirildi. Yaklaşık 2.000 ksilem kutuplu perisiklus hücresi, lateral kök primordial hücreleri, endodermis veya korteks hücreleri ve lateral kök kapağı hücrelerinden oluşan RNA dizileme kütüphanesinin temsili sonuçları gösterilmiştir. Astar veya adaptör dimer tepe noktalarına sahip küçük boyutlu bir kitaplık, boyut seçiminden sonra da sıralanabilir.Anormal boyut dağılımına sahip bir kütüphane, kütüphane hazırlığının başarısız olduğunu gösterir. Gen ekspresyon paternleri analiz edildi. Dört kök hücre tipinden herhangi birinde zenginleştirilmiş genler kümelenmiş ve farklı hücre tipleri arasındaki gen ifadelerinin özgüllüğünü gösteren bir ısı haritasında gösterilmiştir.Doğru geçit ve sıralama yoluyla hedef hücrelerin yüksek kalitesi ve saflığı ve RNA yıkımının önlenmesi, başarılı kütüphane inşasının anahtarıdır. Tek hücre modunda RNA-seq için, son zamanlarda benzersiz moleküler tanımlayıcı ile entegre edilmiş ve performansı önemli ölçüde artıran çeşitli yöntemler bildirilmiştir.

Research

JoVE Journal

Biology

Mating and Tetrad Separation of Chlamydomonas reinhardtii for Genetic Analysis

Mating and Tetrad Separation of Chlamydomonas reinhardtii for Genetic Analysis

Çiftleşme ve tetrad Ayırma Chlamydomonas reinhardtii Genetik Analiz

The unicellular green alga Chlamydomonas reinhardtii (Chlamydomonas) has become a popular organism for research in diverse areas of cell biology and ...

Fluorescence Activated Cell Sorting of Plant Protoplasts

Bitki protoplast Floresan Aktif Hücre Ayırma

High-resolution, cell type-specific analysis of gene expression greatly enhances understanding of developmental regulation and responses to environmental ...

Comprehensive Compositional Analysis of Plant Cell Walls (Lignocellulosic biomass) Part I: Lignin

Comprehensive Compositional Analysis of Plant Cell Walls Lignocellulosic biomass Part I: Lignin

Bitki Hücre Duvarları kapsamlı Kompozisyonel Analizi (Lignocellulosic biyokütle) Bölüm I: Lignin

The need for renewable, carbon neutral, and sustainable raw materials for industry and society has become one of the most pressing issues for the 21st ...

Comprehensive Compositional Analysis of Plant Cell Walls (Lignocellulosic biomass) Part II: Carbohydrates

Comprehensive Compositional Analysis of Plant Cell Walls Lignocellulosic biomass Part II: Carbohydrates

Bitki Hücre Duvarları Kapsamlı Kompozisyonel Analiz (Lignocellulosic biyokütle) Bölüm II: Karbonhidratlar

A Novel Bayesian Change-point Algorithm for Genome-wide Analysis of Diverse ChIPseq Data Types

Çeşitli ChIPseq Veri Türleri Genom çapında Analizi İçin Yeni Bir Bayesian değiştir nokta Algoritması

ChIPseq is a widely used technique for investigating protein-DNA interactions. Read density profiles are generated by using next-sequencing of ...

Efficient and Rapid Isolation of Early-stage Embryos from Arabidopsis thaliana Seeds

Efficient and Rapid Isolation of Early-stage Embryos from Arabidopsis thaliana Seeds

Erken evre Embriyolar verimli ve hızlı İzolasyon<em&gt; Arabidopsis thaliana</em&gt; Tohumlar

In flowering plants, the embryo develops within a nourishing tissue - the endosperm - surrounded by the maternal seed integuments (or seed coat). As a ...

Metabolic Labeling and Membrane Fractionation for Comparative Proteomic Analysis of Arabidopsis thaliana Suspension Cell Cultures

Metabolic Labeling and Membrane Fractionation for Comparative Proteomic Analysis of Arabidopsis thaliana Suspension Cell Cultures

Mukayeseli Proteomik Analizi Metabolik Etiketleme ve Membran Fraksiyonasyon<em&gt; Arabidopsis thaliana</em&gt; Süspansiyon Hücre Kültürleri

Plasma membrane microdomains are features based on the physical properties of the lipid and sterol environment and have particular roles in signaling ...

Isolation and Physiological Analysis of Mouse Cardiomyocytes

Fare kardiyomiyositlerde İzolasyon ve Fizyolojik Analizi

Cardiomyocytes, the workhorse cell of the heart, contain exquisitely organized cytoskeletal and contractile elements that generate the contractile force ...

An Efficient Method for Quantitative, Single-cell Analysis of Chromatin Modification and Nuclear Architecture in Whole-mount Ovules in Arabidopsis

An Efficient Method for Quantitative, Single-cell Analysis of Chromatin Modification and Nuclear Architecture in Whole-mount Ovules in Arabidopsis

Tüm montaj ovüllerindeki in Kromatin Modifikasyonu ve Nükleer Mimarlık Kantitatif, Tek hücreli Analizi için Etkin Bir Yöntem<em&gt; Arabidopsis</em

In flowering plants, the somatic-to-reproductive cell fate transition is marked by the specification of spore mother cells (SMCs) in floral organs of the ...

Isolation and Compositional Analysis of Plant Cuticle Lipid Polyester Monomers

Bitki Tırnak Lipid Polyester Monomer İzolasyonu ve biçim Analizi

Terrestrial plants produce extracellular aliphatic biopolyesters that modify cell walls of specific tissues. Epidermal cells synthesize cutin, a polyester ...