Name: a protocol for constructing a rat wound model of type 1 diabetes
Uploaded: 2023-02-17T12:50:00
Duration: 5 min 18 s
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Questo studio è stato sostenuto finanziariamente dalla National Natural Science Foundation of China (82104877).

Il protocollo è stato condotto a seguito della Dichiarazione di Helsinki e tutti gli esperimenti sugli animali sono stati approvati dal Comitato di gestione dell'Università di medicina tradizionale cinese di Chengdu (Record No. 2021-13).
1. Preparazione dell'iniezione di streptozotocina
<ol><li>Selezionare 15 ratti SD maschi specifici privi di patogeni (SPF) di età compresa tra 8 settimane e del peso di 220 g ± 20 g. Utilizzando il semplice metodo di randomizzazione, dividere i ratti in un gruppo diabetico (n = 10) e un gruppo normale (n = 5).</li>
	<li>Misurare il peso iniziale dei ratti e determinare il dosaggio di STZ attraverso la somministrazione di 55 mg/kg. NOTA: Sulla base di pre-esperimenti, 55 mg/kg è la dose ottimale di STZ.</li>
	<li>Pesare accuratamente la polvere STZ e metterla in un contenitore a prova di luce.</li>
	<li>Aggiungere una quantità appropriata di tampone citrato di sodio 0,1 mol/L (pH 4,5) per sciogliere l'STZ ad una concentrazione dell'1 %. NOTA: Il tampone citrato di sodio deve essere pre-raffreddato per 2 ore in frigorifero a 4 °C prima dell'uso. La preparazione della soluzione STZ deve garantire la sterilità.</li>
	<li>Agitare per 30 s usando un oscillatore di droga. Mettere in una ghiacciaia e mettere da parte. NOTA: L'iniezione deve essere utilizzata entro 15 minuti.</li>
</ol>2. Induzione del modello T1DM
<ol><li>Prima dell'iniezione STZ, digiunare i ratti per 18 ore e consentire il libero accesso all'acqua.</li>
	<li>Eseguire un'iniezione intraperitoneale di soluzione STZ all'1%.<ol><li>Afferrare il ratto ed esporre la pelle addominale e il sito di iniezione (l'intersezione della linea che collega le radici delle due cosce e la linea mediana dell'addome).</li>
		<li>Disinfettare il sito di iniezione due volte usando un batuffolo di cotone imbevuto di alcool al 75% (una volta in senso orario e una volta in senso antiorario). Posiziona la testa del topo sotto l'addome.</li>
		<li>Inserire l'ago parallelamente alla linea mediana addominale con un angolo di 45° e, dopo aver perforato la pelle, ridurre l'angolo dell'ago a 30°, quindi inserire l'ago di 2-3 mm. Tiri delicatamente il tappo dell'ago, assicurandosi che non venga aspirato sangue o liquido nella siringa. Iniettare la soluzione STZ, estrarre l'ago e fermare l'emorragia con un batuffolo di cotone. NOTA: Se un fluido giallo viene aspirato nella siringa, l'ago potrebbe essere penetrato nella vescica, e se viene prelevato un fluido verde scuro, l'ago potrebbe essere penetrato nell'intestino crasso o nel cieco. In entrambi i casi, l'ago deve essere rimosso immediatamente. L'animale deve essere valutato dal personale veterinario.</li>
	</ol></li>
	<li>Misurare i livelli di glucosio nel sangue casuali (non a digiuno o a digiuno) alle 09:00 del giorno 3 e al giorno 7 dopo l'induzione di STZ. NOTA: Il tempo per la misurazione casuale della glicemia è fisso. In questo protocollo, è fissato alle 09:00. Tuttavia, non è l'unico tempo utilizzato. Il sangue raccolto dalla vena caudale da una puntura di ago è meno suscettibile al fluido tissutale rispetto al sangue prelevato da una coda mozzata, quindi i valori di glucosio nel sangue sono più accurati.<ol><li>Immobilizzare il ratto usando un fissatore per topi (Figura 1).</li>
		<li>Trova la posizione della vena caudale. Disinfettare la coda del topo due volte usando un batuffolo di cotone imbevuto di alcool al 75%.</li>
		<li>Forare la vena caudale per indurre sanguinamento e misurare la glicemia usando un glucometro. Fermare l'emorragia con un batuffolo di cotone. NOTA: Un livello di glucosio superiore a 16,7 mmol / L il giorno 7 dopo l'iniezione di STZ è considerato T1DM.</li>
	</ol></li>
	<li>Pesare i ratti settimanalmente e misurare i livelli di glucosio nel sangue e altri parametri, tra cui dieta, assunzione di acqua e produzione di urina.</li>
	<li>Nutrire gli animali normalmente per 8 settimane dopo l'induzione di STZ.</li>
</ol>3. Costruzione del modello della ferita
<ol><li>Rasare i ratti con un rasoio elettrico 1 giorno prima della modellazione della ferita. Un'area rasata di 5 cm x 5 cm sul lato dorso del ratto è generalmente ideale.</li>
	<li>Pulire l'area rasata con un batuffolo di cotone salino normale caldo, lasciarlo asciugare, quindi applicare la crema depilatoria per 5 minuti. Pulire l'area con una garza e lavare qualsiasi crema depilatoria residua con soluzione salina normale calda.</li>
	<li>Pesare i ratti e calcolare la dose richiesta di Nembutal in base allo standard di 35 mg/kg. Sciogliere il Nembutal usando soluzione salina normale fino ad una concentrazione del 3%. Altri anestetici generali come ketamina / xilazina o isoflurano possono essere utilizzati per questa procedura. Si prega di collaborare con i comitati istituzionali per la cura e l'uso degli animali per garantire ciò che è meglio. NOTA: Per garantire l'efficacia, la soluzione deve essere preparata al momento e la polvere e la soluzione di Nembutal devono essere protette dalla luce.</li>
	<li>Velocizzare i ratti per 12 ore prima dell'anestetizzazione. Iniettare l'anestesia per via intraperitoneale. Utilizzare unguento oculare tetraciclina o un lubrificante generale per gli occhi per prevenire la secchezza oculare dopo la somministrazione dell'anestesia. NOTA: L'anestesia era considerata moderata quando i muscoli del ratto erano relativamente rilassati, i movimenti oculari scomparivano, la respirazione era regolare e la risposta agli stimoli dolorosi era piccola.</li>
	<li>Disinfettare la pelle dorsale due volte utilizzando batuffoli di cotone imbevuti di iodio (una volta in senso orario e una volta in senso antiorario) e alcool al 75% (giri alternativi).</li>
	<li>Dopo l'essiccazione, tagliare la pelle con un punzone circolare per biopsia di 20 mm di diametro.</li>
	<li>Tenda la pelle con una pinza sterile, quindi usa le forbici chirurgiche sterili per rimuovere la pelle a tutto spessore lungo i segni di taglio del punzone. Fermare l'emorragia con un normale batuffolo di cotone salino. NOTA: Il bordo superiore della ferita deve essere 5-10 mm sotto il bordo scapolare inferiore e 5-10 mm a destra/sinistra della colonna vertebrale del ratto (Figura 2). Le ferite sono simmetriche lungo la colonna vertebrale quando vengono costruite due ferite.</li>
	<li>Utilizzare una garza di vaselina per coprire le ferite e avvolgerle con una garza e una benda traspirante tenuta in posizione con nastro di gomma. Iniettare carprofen per via sottocutanea (5 mg/kg) una volta al giorno per alleviare il dolore postoperatorio. Cambiare la benda della ferita una volta al giorno (uso di carprofen per alleviare il dolore). NOTA: Osservare il movimento e la respirazione del ratto per eventuali anomalie dopo che la benda è stata completata e assicurarsi che la benda traspirante sia adeguatamente stretta.</li>
	<li>Posiziona un righello sotto la ferita e fotografa la ferita con una fotocamera digitale fino al giorno 14. Eutanasia i ratti il giorno 14 secondo le linee guida istituzionali per la cura e l'uso degli animali. Tagliare il tessuto cutaneo della ferita a 5 mm dal bordo della ferita. Dividere il campione di tessuto in due parti, lavarle con PBS per rimuovere le macchie di sangue visibili e quindi fissarle con una soluzione di paraformaldeide al 4%.</li>
</ol>4. Calcolo dell'area della ferita con il software ImageJ
<ol><li>Fare clic sul pulsante File dopo aver aperto il software, quindi scendere e fare clic su Apri per aprire le immagini della ferita.</li>
	<li>Selezionate lo strumento Diritto (Straight ) e disegnate una linea retta di 1 cm lungo il righello nelle immagini della ferita.</li>
	<li>Fare clic sul comando Imposta scala nel menu Analizza e impostare la distanza nota su 1.</li>
	<li>Selezionate lo strumento selezioni a mano libera e tracciate il contorno della ferita sull'immagine.</li>
	<li>Fare clic sul comando Misura nel menu Analizza e leggere il valore Area dopo che viene visualizzato il risultato.</li>
</ol>5. Colorazione con ematossilina ed eosina (H & E)
<ol><li>Rimuovere il tessuto cutaneo dal fissativo, tagliarlo in sezioni sottili con un bisturi in una cappa aspirante e metterlo in una cassetta di disidratazione.</li>
	<li>Metti la cassetta di disidratazione in una macchina per disidratazione e disidrata i tessuti nei seguenti passaggi: 75% di alcol per 4 ore; 85% di alcol per 2 ore; 90% di alcol per 2 ore; 95% di alcol per 1 ora; etanolo anidro I e II per 30 minuti ciascuno; alcool benzene per 5-10 min; xilene I e II per 5-10 minuti ciascuno; e cera I, II e III per 1 ora ciascuno.</li>
	<li>Incorporare i tessuti nella cera. Raffreddare a -20° su un tavolo da congelamento e correggere ordinatamente il blocco di cera.</li>
	<li>Tagliare longitudinalmente i blocchi di cera utilizzando una sezionatrice di paraffina in sezioni spesse 3 μm.</li>
	<li>Immergere in sequenza la sezione in xilene I e II per 20 minuti ciascuno, etanolo anidro I e II per 5 minuti ciascuno e acqua di rubinetto per 5 minuti.</li>
	<li>Inondare i tessuti con la colorazione di ematossilina per 3-5 minuti, differenziazione della soluzione acquosa di acido cloridrico allo 0,5%, soluzione acquosa di ammoniaca allo 0,5% e risciacquare con acqua.</li>
	<li>Disidratare le sezioni di tessuto con alcol all'85% e al 95%. Inondare i tessuti con una soluzione colorante di eosina per 5 minuti. NOTA: Normalmente, la colorazione dell'eosina richiede da 30 a 2 minuti e il tempo può essere regolato in base ai risultati e ai requisiti della colorazione.</li>
	<li>Disidratare le sezioni in sequenza con le seguenti soluzioni: etanolo anidro I, etanolo anidro II, etanolo anidro III, xilene I e xilene II, ciascuno per 5 minuti. Infine, coprire i vetrini con balsamo neutro.</li>
	<li>Esamina i tessuti colorati con H & E al microscopio a 40x, 20x e 10x e scatta foto per conservare immagini rappresentative di ogni vetrino.</li>
</ol>6. Colorazione con immunofluorescenza CD31
<ol><li>Immergere le sezioni di tessuto in xilene I e II per 15 minuti ciascuna, etanolo anidro I e II per 5 minuti ciascuna, alcool all'85% per 5 minuti e alcool al 75% per 5 minuti e risciacquare con acqua distillata.</li>
	<li>Riparazione dell'antigene<ol><li>Aggiungere un tampone di acido citrico da 10 mM adatto di pH 6,0 in un contenitore del forno a microonde, riscaldarlo fino all'ebollizione in alto, quindi posizionare il vetrino in esso.</li>
		<li>Far bollire per 8 minuti a fuoco medio, fermarsi per 8 minuti e poi far bollire di nuovo a fuoco medio-basso per 7 minuti.</li>
		<li>Lasciare raffreddare i vetrini, metterli in PBS (pH 7,4) e lavarli tre volte per 5 minuti ciascuno usando uno shaker di decolorazione.</li>
	</ol></li>
	<li>Aggiungere il 5% di siero di capra goccia a goccia nel cerchio e incubare per 30 minuti.</li>
	<li>Scuotere delicatamente la soluzione di chiusura (siero di capra al 5%) e aggiungere l'anticorpo anti-CD31 di coniglio (diluito con PBS in un rapporto di 1:200) goccia a goccia sulle sezioni. Mettere le sezioni in una scatola umida e incubare per una notte a 4°C.</li>
	<li>Lavare i vetrini tre volte con PBS (pH 7,4) su uno shaker di decolorazione per 5 minuti ciascuno. Agitare leggermente le sezioni per asciugarle, quindi coprirle con una goccia circolare di IgG anti-coniglio di capra etichettato FITC. Incubare a temperatura ambiente per 50 minuti al buio.</li>
	<li>Lavare i vetrini tre volte con PBS (pH 7,4) su uno shaker di decolorazione per 5 minuti ciascuno. Asciugare all'aria le sezioni con un leggero scuotimento e aggiungere una soluzione colorante DAPI. Incubare le sezioni al buio per 10 minuti a temperatura ambiente.</li>
	<li>Dopo aver asciugato le sezioni, disegnare cerchi attorno al tessuto con la PepPen (per prevenire la perdita di anticorpi), aggiungere un agente di spegnimento autofluorescenza (0,3% Sudan Black B) ai cerchi per 5 minuti, quindi sciacquarli sotto l'acqua corrente per 10 minuti.</li>
	<li>Lavare i vetrini tre volte con PBS (pH 7,4) su uno shaker di decolorazione per 5 minuti ciascuno. Agitare leggermente le sezioni e sigillarle con un mezzo di montaggio antisbiadimento.</li>
	<li>Osservare e fotografare le sezioni al microscopio a fluorescenza a 40x, 20x e 10x. NOTA: La lunghezza d'onda di eccitazione UV DAPI è 330-380 nm e la lunghezza d'onda di emissione è 420 nm (luce blu). La lunghezza d'onda di eccitazione FITC è 465-495 nm e la lunghezza d'onda di emissione è 515-555 nm (luce verde).</li>
</ol>7. Analisi statistica
<ol><li>Raccogli e analizza i dati utilizzando SPSS.</li>
	<li>Riportare i dati come media ± deviazione standard.</li>
	<li>Utilizzare un t-test di campioni indipendenti per analizzare le differenze tra i gruppi diabetici e normali.</li>
	<li>Impostare la significatività statistica su **p < 0,01 e *p < 0,05.</li>
</ol>

<ol>
	<li>Zimmet, P., Alberti, K. G., Shaw, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Global+and+societal+implications+of+the+diabetes+epidemic.">Global and societal implications of the diabetes epidemic.</a> Nature. 414 (6865), 782-787 (2001).</li><li>Grennan, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Diabetic+foot+ulcers.">Diabetic foot ulcers.</a> Journal of the American Medical Association. 321 (1), 114 (2019).</li><li>Eming, S. 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K., Wolinsky, E., Bogie, K. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+review+of+animal+models+from+2015+to+2020+for+preclinical+chronic+wounds+relevant+to+human+health.">A review of animal models from 2015 to 2020 for preclinical chronic wounds relevant to human health.</a> Journal of Tissue Viability. 30 (3), 291-300 (2021).</li></ol>

Tutti gli autori dichiarano che questo manoscritto non ha conflitti di interesse.

Questo protocollo chiarisce le operazioni contestate nella modellazione della ferita T1DM. In questo lavoro sono state affrontate le preoccupazioni sui protocolli di iniezione STZ, i criteri di successo dell'induzione del T1DM, il tempo di stabilizzazione della glicemia, la posizione e le dimensioni della ferita. Inoltre, sono state chiarite le caratteristiche patologiche e i parametri misurabili per la valutazione della guarigione delle ferite da T1DM.
I ratti hanno digiunato per 18 ore prima dell'iniezione di STZ per evitare il legame competitivo del glucosio o dei suoi analoghi alle cellule β, che potrebbe influenzare l'efficacia di STZ. Il metodo più comunemente usato per indurre il diabete di tipo 1 è una singola dose elevata di STZ, che aumenta la glicemia danneggiando le isole e diminuendo la secrezione di insulina21. Studi pre-sperimentali hanno rivelato che la dose ottimale di STZ per un alto tasso di successo e un basso tasso di mortalità era di 55 mg/kg, che è inferiore alle dosi ottimali riportate negli studi precedenti22,23,24. In questo protocollo, il T1DM è stato indotto utilizzando una singola iniezione intraperitoneale di 55 mg/kg di STZ.
I livelli di glucosio nel sangue erano tutti superiori a 16,7 mmol / L 3 giorni dopo l'iniezione di STZ. Tuttavia, un livello di glucosio nel sangue superiore a 16,7 mmol / L il giorno 7 dopo l'iniezione di STZ è il criterio raccomandato per il successo della modellazione del T1DM, poiché l'entità del danno alle isole varia tra i ratti e un'appropriata estensione del tempo diagnostico può ridurre il tasso di falsi negativi. Inoltre, le fluttuazioni della glicemia si sono stabilizzate 5 settimane dopo l'iniezione di STZ e i ratti hanno gradualmente guadagnato peso durante questo periodo, in linea con i risultati precedenti25,26. Ciò indica che il livello di glucosio nel sangue nel modello T1DM deve essere stabilizzato per almeno 6 settimane e un aumento del peso del ratto dopo 6 settimane riduce i tassi di mortalità durante il modello della ferita. Quindi, questo protocollo ha condotto la modellazione della ferita 8 settimane dopo l'iniezione STZ.
Il tasso di chiusura della ferita il giorno 7 e il giorno 14 dopo la ferita era significativamente più basso nel diabetico rispetto al gruppo normale della ferita, indicando una lenta guarigione. Inoltre, la riepitelizzazione della ferita e l'angiogenesi erano significativamente più basse nel gruppo diabetico rispetto al gruppo normale. Ciò dimostra che il modello di ferita T1DM mostra una guarigione della ferita più lenta e una riepitelizzazione ritardata rispetto ai ratti normali, che possono essere correlati ai cambiamenti patologici della ridotta angiogenesi della ferita. Tuttavia, il giorno 14, anche il tasso di guarigione delle ferite T1DM era superiore al 90%, che è diverso dalla caratteristica cronica di non guarigione delle ferite diabetiche umane. Ciò potrebbe essere dovuto al fatto che i meccanismi fisiologici dei roditori per la guarigione delle ferite differiscono da quelli degli esseri umani27. Di conseguenza, il miglior diametro della ferita è di almeno 20 mm, che è abbastanza grande da consentire il tempo di valutare l'efficacia di un intervento in uno studio sulla ferita diabetica. La posizione della ferita dovrebbe evitare la scapola e la colonna vertebrale, poiché il movimento continuo in questi due siti potrebbe interrompere la guarigione della ferita.
In conclusione, la costruzione del modello di ferita T1DM utilizzando il metodo di questo protocollo è efficace. Il protocollo replica alcune delle caratteristiche delle ferite diabetiche croniche, come la guarigione più lenta delle ferite, la riepitelizzazione ritardata e l'angiogenesi ridotta rispetto alle normali ferite di ratto. Tuttavia, non è noto se il modello possa replicare altri fenotipi cronici di ferite diabetiche. Inoltre, questo protocollo descrive il metodo più fondamentale e ampiamente utilizzato, che non tiene conto del problema della contrazione cutanea nei ratti. La ricerca futura può incorporare l'uso di stecche di ferita in questo protocollo o esplorare ulteriori modelli di ferite diabetiche croniche, che saranno una sfida significativa per i ricercatori in futuro.

Il diabete mellito di tipo 1 (T1DM) è una malattia metabolica cronica caratterizzata da iperglicemia e distruzione delle cellule β pancreatiche1. Una ferita da T1DM è una ferita cronica non cicatrizzante e la complicanza più comune e devastante del diabete nell'uomo 2,3. I modelli animali sono i prototipi più appropriati per studiare i cambiamenti patologici durante la guarigione delle ferite e la sicurezza e l'efficacia di potenziali agenti terapeutici4. Rispetto ad altri tipi, i ratti maschi di Sprague-Dawley (SD) sono più sensibili alla streptozotocina (STZ) e mostrano un tasso di mortalità correlato inferiore, rendendoli popolari nella ricerca sulle ferite diabetiche 5,6.
Sono stati descritti numerosi metodi per la costruzione di modelli di ferite T1DM. Per quanto riguarda il modello T1DM, gli studi si sono concentrati principalmente sull'effetto del metodo di iniezione STZ sul tasso di successo dell'induzione del diabete 7,8. Tuttavia, il processo di modellazione soffre del funzionamento incoerente di questo stesso passaggio. In uno studio, i ratti hanno digiunato per 18 ore prima dell'iniezione di STZ; ratti con livelli di glucosio nel sangue superiori a 16,67 mmol / L 1 settimana dopo l'iniezione di STZ sono stati considerati diabetici e la ferita diabetica è stata introdotta dopo 3 settimane9. Al contrario, in uno studio correlato, Zhu et al. hanno digiunato ratti per 12 ore prima dell'iniezione di STZ; i ratti con livelli di glucosio nel sangue superiori a 16,7 mmol / L a 72 ore dopo l'iniezione sono stati considerati diabetici e la ferita diabetica è stata introdotta dopo 4 settimane10. Nel complesso, ci sono incongruenze nei protocolli di iniezione STZ, nei criteri di diagnosi del diabete e nei tempi di introduzione della ferita.
In termini di modellazione della ferita, nella maggior parte degli studi, l'intero spessore della pelle dorsale viene asportato per costruire ferite T1DM dopo l'induzione del diabete di successo11,12,13. Sebbene questo modello sia suscettibile alla contrattura cutanea nei ratti, è il modello più comunemente usato nella ricerca sulla guarigione delle ferite perché è meno laborioso ed è economico14,15. Tuttavia, manca una ricerca guidata dal metodo su questa tecnica di escissione a tutto spessore. Inoltre, non esistono standard uniformi negli studi esistenti per quanto riguarda le dimensioni e la posizione della ferita12,16. Le dimensioni e la posizione della ferita possono influenzare indirettamente la coerenza del disegno sperimentale e la validità scientifica dei risultati. Pertanto, vi è un urgente bisogno di un protocollo standard per l'induzione del T1DM e la modellazione delle ferite come riferimento per i ricercatori. L'obiettivo di questo studio è quello di visualizzare un protocollo specifico per la modellazione della ferita T1DM che può essere utilizzato come riferimento per gli studi sulle ferite T1DM.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Antifade mounting medium</td>
			<td>Southern Biotechnology Associates, Inc.</td>
			<td>0100-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AutoFluo Quencher</td>
			<td>Servicebio Technology co., Ltd.</td>
			<td>G1221</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Automatic slide stainer</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific Inc.</td>
			<td>Varistain&#8482; Gemini ES</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD31</td>
			<td>Servicebio Technology co., Ltd.</td>
			<td>GB11063-2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Citrate antigen retrieval solution</td>
			<td>Servicebio Technology co., Ltd.</td>
			<td>G1201</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cover glass</td>
			<td>Citotest Labware Manufacturing Co., Ltd.</td>
			<td>10212432C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DAPI</td>
			<td>Servicebio Technology co., Ltd.</td>
			<td>G1012</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Decolorization shaker</td>
			<td>Scilogex</td>
			<td>S1010E</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Depilatory cream</td>
			<td>Guangzhou Ruixin Biotechnology Co., Ltd.</td>
			<td>&#8212;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dimethyl benzene</td>
			<td>Chengdu Kelong Chemical Co., Ltd.</td>
			<td>64-17-5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Drug oscillator</td>
			<td>Shenzhen Jiashi Technology Co., Ltd.</td>
			<td>VM-370</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Electric razor</td>
			<td>Shanghai Flyco Electrical Appliance Co., Ltd.</td>
			<td>FC5908</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Embedding machine</td>
			<td>Wuhan Junjie Electronics Co., Ltd.</td>
			<td>JB-P5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol absolute</td>
			<td>Chengdu Kelong Chemical Co., Ltd.</td>
			<td>1330-20-7</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fitc-labeled goat anti-rabbit IgG</td>
			<td>Servicebio Technology co., Ltd.</td>
			<td>GB22303</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat serum</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific Inc.</td>
			<td>16210064</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hematoxylin and eosin staining solution</td>
			<td>Beijing Regan Biotechnology Co., Ltd.</td>
			<td>DH0020</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Image J software</td>
			<td>National Institutes of Health</td>
			<td>&#8212;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microwave oven</td>
			<td>Midea Group Co., Ltd.&#160;</td>
			<td>M1-L213B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mini centrifuge</td>
			<td>Scilogex</td>
			<td>D1008</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Neutral balsam</td>
			<td>Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd</td>
			<td>10004160</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS buffer</td>
			<td>Biosharp</td>
			<td>G4202</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Portable blood glucose meter</td>
			<td>Sinocare Inc.</td>
			<td>GA-3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rapid tissue processor</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific Inc.</td>
			<td>STP420 ES</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rat fixator</td>
			<td>Globalebio (Beijing) Technology co., Ltd</td>
			<td>GEGD-Q10G1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Slicing machine</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific Inc.</td>
			<td>HM325</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Slides glass</td>
			<td>Citotest Labware Manufacturing Co., Ltd.</td>
			<td>80312-3181</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>sodium citrate buffer</td>
			<td>Beijing Solarbio Science &#38; Technology Co., Ltd.</td>
			<td>c1013</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Streptozotocin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>57654595</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a protocol for constructing a rat wound model of type 1 diabetes

Una singola dose elevata di iniezione di streptozotocina seguita da escissione cutanea a tutto spessore sul dorso dei ratti è un metodo comune per la costruzione di modelli animali di ferite diabetiche di tipo 1. Tuttavia, una manipolazione impropria può portare all'instabilità del modello e all'alta mortalità nei ratti. Sfortunatamente, ci sono poche linee guida esistenti sulla modellazione della ferita diabetica di tipo 1, mancano di dettagli e non presentano strategie di riferimento specifiche. Pertanto, questo protocollo descrive in dettaglio la procedura completa per la costruzione di un modello di ferita diabetica di tipo 1 e analizza la progressione e le caratteristiche angiogeniche delle ferite diabetiche. La modellazione della ferita diabetica di tipo 1 prevede le seguenti fasi: preparazione dell'iniezione di streptozotocina, induzione del diabete mellito di tipo 1 e costruzione del modello della ferita. L'area della ferita è stata misurata il giorno 7 e il giorno 14 dopo la ferita e i tessuti cutanei dei ratti sono stati estratti per analisi istopatologiche e di immunofluorescenza. I risultati hanno rivelato che il diabete mellito di tipo 1 indotto da 55 mg / kg di streptozotocina era associato a una minore mortalità e ad un alto tasso di successo. I livelli di glucosio nel sangue erano relativamente stabili dopo 5 settimane di induzione. Il tasso di guarigione delle ferite diabetiche era significativamente inferiore a quello delle ferite normali il giorno 7 e il giorno 14 (p < 0,05), ma entrambi potevano raggiungere oltre il 90% il giorno 14. Rispetto al gruppo normale, la chiusura dello strato epidermico delle ferite diabetiche al giorno 14 era incompleta e aveva ritardato la riepitelizzazione e un'angiogenesi significativamente inferiore (p < 0,01). Il modello di ferita diabetica di tipo 1 costruito sulla base di questo protocollo ha le caratteristiche della guarigione cronica delle ferite, tra cui scarsa chiusura, riepitelizzazione ritardata e diminuzione dell'angiogenesi rispetto alle normali ferite di ratto.

Un totale di 10 ratti SD hanno ricevuto una singola iniezione intraperitoneale STZ per indurre il modello T1DM. Un ratto è morto prematuramente (10%), ma il diabete è stato indotto in tutti i ratti (100%). Dopo 3 giorni di iniezione di STZ, i livelli di glucosio nel sangue di tutti i ratti erano superiori a 16,7 mmol / L e i livelli di glucosio nel sangue si sono stabilizzati 5 settimane dopo l'induzione (Figura 3A). Il peso del gruppo diabetico è aumentato gradualmente dopo l'iniezione di STZ, ma è diminuito nella settimana 3 e poi lentamente è aumentato di nuovo dalla settimana 4 (Figura 3B). Al contrario, il peso dei ratti nel gruppo normale è aumentato costantemente e il loro peso medio 3 giorni dopo l'induzione del diabete era superiore a quello del gruppo diabetico (Figura 3B). I ratti diabetici hanno tutti mostrato sintomi tipici di sete, poliuria e perdita di peso, simili ai risultati di Hao et al.17.
Il giorno 7 e il giorno 14 dopo il ferimento, l'analisi macroscopica ha rivelato che la riepitelizzazione era più pronunciata nei ratti nel gruppo normale rispetto al gruppo diabetico (Figura 4A). I risultati quantitativi hanno rivelato che il tasso di guarigione delle ferite era significativamente più basso nel gruppo diabetico rispetto al gruppo normale il giorno 7 e il giorno 14 (p < 0,01). Tuttavia, il giorno 14, i tassi di guarigione delle ferite potrebbero anche essere superiori al 90% nel gruppo diabetico (p < 0,05, Figura 4B). Ciò suggerisce che il modello di ferita T1DM è caratterizzato da una scarsa chiusura, ma non nella misura della non guarigione cronica osservata nelle ferite diabetiche umane.
La colorazione H & E al giorno 14 della guarigione della ferita ha rivelato un'epidermide della ferita incompleta, una lenta proliferazione dei cheratinociti e una riepitelizzazione ritardata nel gruppo diabetico rispetto al gruppo normale. Le ferite diabetiche hanno mostrato una perdita parziale dei follicoli piliferi e delle ghiandole sebacee. C'erano anche meno capillari visibili (Figura 5).
Il diabete causa disfunzione delle cellule endoteliali, glicosilazione delle proteine della matrice extracellulare e denervazione vascolare18. Queste complicanze provocano un'angiogenesi della ferita inferiore al normale nelle ferite diabetiche18. L'angiogenesi è necessaria per la guarigione delle ferite e l'angiogenesi della ferita è frequentemente analizzata mediante immunocolorazione CD31 (Figura 6A)19,20. Sulla base della densità ottica media (AOD) dell'espressione di CD31, l'angiogenesi nel sito della ferita era significativamente più alta nel gruppo normale rispetto al gruppo diabetico (p < 0,01, Figura 6B).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64914/64914fig01.jpg"> Figura 1: Immagine di ratti immobilizzati da fissatori. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64914/64914fig01large.jpg" target="_blank">Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64914/64914fig02.jpg"> Figura 2: Diagramma della posizione della ferita del ratto. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64914/64914fig02large.jpg" target="_blank">Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64914/64914fig03.jpg"> Figura 3: Livelli di glucosio nel sangue e pesi dei ratti sperimentali. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64914/64914fig03large.jpg" target="_blank">Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64914/64914fig04.jpg"> Figura 4: Ferite cutanee a tutto spessore (20 mm di diametro) sul dorso dei ratti sperimentali. (A) L'aspetto macroscopico delle ferite nei giorni 0, 7 e 14. Le immagini morfologiche della ferita del giorno 0, del giorno 7 e del giorno 14 sono state catturate con una fotocamera digitale. (B) L'area della ferita è stata misurata utilizzando il software ImageJ ed è stata utilizzata per calcolare il tasso di guarigione della ferita. Il tasso di guarigione della ferita (%) è stato calcolato come segue: (area iniziale della ferita − area della ferita nel punto temporale indicato)/area iniziale della ferita × 100. I valori sono presentati come media ± SD (n = 14). La significatività statistica è stata fissata a ** p < 0,01 e * p < 0,05. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64914/64914fig04large.jpg" target="_blank">Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64914/64914fig05.jpg"> Figura 5: Immagini H&E istopatologiche rappresentative il giorno 14 dopo l'accertamento della ferita. Le frecce blu indicano i capillari. Le frecce rosse mostrano la proliferazione dei cheratinociti. Scala sinistra: una barra = 200 μm; Scala di destra: una barra = 100 μm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64914/64914fig05large.jpg" target="_blank">Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.</a>
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64914/64914fig06v2.jpg"> Figura 6: Analisi di colorazione in immunofluorescenza per l'espressione di CD31. I livelli di CD31 sono stati utilizzati per determinare lo stato di angiogenesi. (A) Immagini rappresentative della colorazione con immunofluorescenza CD31 nel gruppo diabetico e normale. Il valore della densità ottica integrata (IOD) e l'area dei pixel (AREA) per ciascun campione di pelle sono stati calcolati con il software Image-Pro Plus 6.0. È stato anche derivato il valore medio della densità ottica (AOD = IOD / AREA). Il valore AOD era direttamente proporzionale all'espressione positiva di CD31. (B) Confronto quantitativo dell'espressione CD31 positiva nel gruppo diabetico e normale. I dati sono presentati come media ± DS. ** p < 0,01. Scala: una barra = 200 μm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64914/64914fig06largev2.jpg" target="_blank">Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.</a>

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A Protocol for Constructing a Rat Wound Model of Type 1 Diabetes

Il modello di ferita diabetica indotta da streptozotocina nei ratti SD maschi è attualmente il modello più utilizzato per studiare la guarigione delle ferite nel diabete mellito di tipo I. Questo protocollo descrive i metodi utilizzati per costruire questo modello. Presenta e affronta anche potenziali sfide ed esamina la progressione e le caratteristiche angiogeniche delle ferite diabetiche.

Un protocollo per la costruzione di un modello di ferita di ratto del diabete di tipo 1

A single high dose of streptozotocin injection followed by full-thickness skin excision on the dorsum of rats is a common method for constructing animal ...

Molti dettagli del processo di modellazione della ferita del diabete di tipo 1 sono soggetti a errori. È una sfida difficile per i ricercatori esperti. Di conseguenza, è necessario utilizzare questo protocollo.Nel modo più semplice possibile, questa tecnica può replicare efficacemente alcune caratteristiche delle ferite diabetiche croniche come l'assenza di guarigione delle ferite, la riepitelizzazione ritardata e la ridotta angiogenesi. La soluzione di streptozotocina deve essere utilizzata immediatamente dopo la preparazione. Quando crei la ferita, guarda che la dimensione e la posizione della ferita devono essere regolate.Iniziare sciogliendo la polvere di streptozotocina in una quantità appropriata di 0,1 moli per litro di tampone citrato di sodio per ottenere una concentrazione dell'1% e agitarla per 30 secondi usando un oscillatore di droga prima di metterla in una bella scatola. Per l'iniezione intraperitoneale di soluzione di streptozotocina all'1%, afferrare il ratto ed esporre la pelle addominale nel sito di iniezione. Disinfettare il sito di iniezione due volte usando un batuffolo di cotone imbevuto di alcool al 75% e posizionare la testa del topo sotto l'addome.Inserire l'ago parallelamente alla linea mediana addominale a 45 gradi. Quindi ridurre l'angolo dell'ago a 30 gradi e inserire da due a tre millimetri. Tirare delicatamente il tappo dell'ago, iniettare la soluzione di streptozotocina ed estrarre l'ago prima di applicare un batuffolo di cotone.Per misurare i livelli causali di glucosio nel sangue alle 9:00 del giorno 3 e del giorno 7, trova la posizione della vena caudale. Disinfettare la coda di ratto due volte usando il 75% di alcol prima di perforare la vena caudale per indurre sanguinamento e misurare la glicemia usando un glucometro. Una volta fatto, fermare l'emorragia con un batuffolo di cotone.Rasare l'area di 5 per 5 centimetri sul lato dorsale del ratto con un rasoio elettrico un giorno prima della modellazione della ferita. Pulire l'area rasata con un batuffolo di cotone salino normale caldo e lasciarlo asciugare per applicare la crema depilatoria per cinque minuti. Pulire la zona con una garza e lavare eventuali residui di crema depilatoria con soluzione salina normale calda.Quindi disinfettare la pelle dorsale due volte usando batuffoli di cotone imbevuti di iodio e alcol al 75% nei turni alternativi. Dopo l'essiccazione, tagliare la pelle con un punch bioptico circolare di 20 millimetri di diametro. Tendere la pelle con una pinza e quindi utilizzare forbici chirurgiche per rimuovere l'intero spessore della pelle lungo i segni di taglio del punzone.Una volta fatto, fermare l'emorragia con un normale batuffolo di cotone salino. Coprire la ferita con una garza di vaselina. Il diabete è stato indotto in tutti i ratti dopo tre giorni di iniezione di streptozotocina, con un livello di glucosio nel sangue superiore a 16,7 millimoli per litro.Il livello di glucosio è stato stabilizzato cinque settimane dopo l'induzione. Il peso del gruppo diabetico è aumentato gradualmente dopo l'iniezione di streptozotocina. Il peso è diminuito nella settimana 3 e lentamente è aumentato di nuovo dalla settimana 4.Al contrario, il peso del ratto di gruppo normale è aumentato costantemente. Il loro peso medio dopo i tre giorni di induzione del diabete era superiore al gruppo diabetico. L'analisi macroscopica eseguita nei giorni 7 e 14 dopo il ferimento ha rivelato che la riepitelizzazione era più pronunciata nei ratti nel gruppo normale rispetto al gruppo diabetico.I risultati quantitativi del giorno 7 e del giorno 14 hanno rivelato che il tasso di guarigione delle ferite era significativamente inferiore nel gruppo diabetico rispetto al gruppo normale. Tuttavia, il giorno 14, il tasso di guarigione delle ferite era superiore al 90% nel gruppo diabetico. Le ferite diabetiche hanno mostrato una perdita parziale dei follicoli piliferi e delle ghiandole sebacee con meno capillari visibili.Nell'angiogenesi della ferita analizzata mediante immunocolorazione CD31, la densità ottica media dell'espressione di CD31 ha mostrato che l'angiogenesi nel sito della ferita era significativamente più alta nel gruppo normale rispetto al gruppo diabetico. Quando si modella la ferita, assicurarsi che la pelle dello spessore anteriore venga rimossa, compresa l'epidermide, il derma e il tessuto sottocutaneo.

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