Name: culture of piglet intestinal 3d organoids from cryopreserved epithelial crypts and establishment of cell monolayers
Uploaded: 2023-02-10T13:03:00
Duration: 8 min 19 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Culture of Piglet Intestinal 3D Organoids from Cryopreserved Epithelial Crypts and Establishment of Cell Monolayers at JoVE.com

تم دعم هذا العمل من قبل معهد كارنو فرنسا فيوتشر إليفاج ("مشروع OrganoPig") ومن قبل INRAE HOLOFLUX ("مشروع Holopig"). المؤلفون ممتنون لمرافق Genotoul الأساسية (TRI). نحن نقدر كريستيل كنودسن (GenPhySE ، INRAE ، تولوز) للتدقيق اللغوي الدقيق.

<ol>
	<li>Peterson, L. W., Artis, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intestinal+epithelial+cells:+regulators+of+barrier+function+and+immune+homeostasis.">Intestinal epithelial cells: regulators of barrier function and immune homeostasis.</a> Nature Reviews Immunology. 14 (3), 141-153 (2014).</li><li>In, J. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+mini-guts:+new+insights+into+intestinal+physiology+and+host-pathogen+interactions.">Human mini-guts: new insights into intestinal physiology and host-pathogen interactions.</a> Nature Reviews Gastroenterology &amp; Hepatology. 13 (11), 633-642 (2016).</li><li>Sato, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single+Lgr5+stem+cells+build+crypt-villus+structures+in+vitro+without+a+mesenchymal+niche.">Single Lgr5 stem cells build crypt-villus structures in vitro without a mesenchymal niche.</a> Nature. 459 (7244), 262-265 (2009).</li><li>Beaumont, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intestinal+organoids+in+farm+animals.">Intestinal organoids in farm animals.</a> Veterinary Research. 52 (1), 33 (2021).</li><li>Gonzalez, L. M., Williamson, I., Piedrahita, J. A., Blikslager, A. T., Magness, S. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+lineage+identification+and+stem+cell+culture+in+a+porcine+model+for+the+study+of+intestinal+epithelial+regeneration.">Cell lineage identification and stem cell culture in a porcine model for the study of intestinal epithelial regeneration.</a> PLoS One. 8 (6), 66465 (2013).</li><li>Holthaus, D., Delgado-Betancourt, E., Aebischer, T., Seeber, F., Klotz, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Harmonization+of+protocols+for+multi-species+organoid+platforms+to+study+the+intestinal+biology+of+toxoplasma+gondii+and+other+protozoan+infections.">Harmonization of protocols for multi-species organoid platforms to study the intestinal biology of toxoplasma gondii and other protozoan infections.</a> Frontiers in Cellular and Infection Microbiology. 10, 610368 (2021).</li><li>Powell, R. H., Behnke, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=WRN+conditioned+media+is+sufficient+for+in+vitro+propagation+of+intestinal+organoids+from+large+farm+and+small+companion+animals.">WRN conditioned media is sufficient for in vitro propagation of intestinal organoids from large farm and small companion animals.</a> Biology Open. 6 (5), 698-705 (2017).</li><li>Li, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Porcine+intestinal+enteroids:+a+new+model+for+studying+enteric+coronavirus+porcine+epidemic+diarrhea+virus+infection+and+the+host+innate+response.">Porcine intestinal enteroids: a new model for studying enteric coronavirus porcine epidemic diarrhea virus infection and the host innate response.</a> Journal of Virology. 93 (5), 01682 (2019).</li><li>vander Hee, B., Madsen, O., Vervoort, J., Smidt, H., Wells, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Congruence+of+transcription+programs+in+adult+stem+cell-derived+jejunum+organoids+and+original+tissue+during+long-term+culture.">Congruence of transcription programs in adult stem cell-derived jejunum organoids and original tissue during long-term culture.</a> Frontiers in Cell and Developmental Biology. 8, 375 (2020).</li><li>Barnett, A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Porcine+colonoids+and+enteroids+keep+the+memory+of+their+origin+during+regeneration.">Porcine colonoids and enteroids keep the memory of their origin during regeneration.</a> American Journal of Physiology. Cell Physiology. 320 (5), 794-805 (2021).</li><li>Mussard, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+phenotype+of+the+gut+region+is+more+stably+retained+than+developmental+stage+in+piglet+intestinal+organoids.">The phenotype of the gut region is more stably retained than developmental stage in piglet intestinal organoids.</a> Frontiers in Cell and Developmental Biology. 10, 983031 (2022).</li><li>Zhu, M., Qin, Y. -. C., Gao, C. -. Q., Yan, H. -. C., Wang, X. -. Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=l-Glutamate+drives+porcine+intestinal+epithelial+renewal+by+increasing+stem+cell+activity+via+upregulation+of+the+EGFR-ERK-mTORC1+pathway.">l-Glutamate drives porcine intestinal epithelial renewal by increasing stem cell activity via upregulation of the EGFR-ERK-mTORC1 pathway.</a> Food &amp; Function. 11 (3), 2714-2724 (2020).</li><li>Wang, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dietary+vitamin+A+affects+growth+performance,+intestinal+development,+and+functions+in+weaned+piglets+by+affecting+intestinal+stem+cells.">Dietary vitamin A affects growth performance, intestinal development, and functions in weaned piglets by affecting intestinal stem cells.</a> Journal of Animal Science. 98 (2), (2020).</li><li>Derricott, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Developing+a+3D+intestinal+epithelium+model+for+livestock+species.">Developing a 3D intestinal epithelium model for livestock species.</a> Cell and Tissue Research. 375 (2), 409-424 (2019).</li><li>Khalil, H. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+culture+system+for+adult+porcine+intestinal+crypts.">A novel culture system for adult porcine intestinal crypts.</a> Cell and Tissue Research. 365 (1), 123-134 (2016).</li><li>Stewart, A. S., Freund, J. M., Gonzalez, L. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Advanced+three-dimensional+culture+of+equine+intestinal+epithelial+stem+cells.">Advanced three-dimensional culture of equine intestinal epithelial stem cells.</a> Equine Veterinary Journal. 50 (2), 241-248 (2018).</li><li>Tsai, Y. -. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+method+for+cryogenic+preservation+of+human+biopsy+specimens+and+subsequent+organoid+culture.">A method for cryogenic preservation of human biopsy specimens and subsequent organoid culture.</a> Cellular and Molecular Gastroenterology and Hepatology. 6 (2), 218-222 (2018).</li><li>Wilson, S. S., Tocchi, A., Holly, M. K., Parks, W. C., Smith, J. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+small+intestinal+organoid+model+of+non-invasive+enteric+pathogen-epithelial+cell+interactions.">A small intestinal organoid model of non-invasive enteric pathogen-epithelial cell interactions.</a> Mucosal Immunology. 8 (2), 352-361 (2015).</li><li>Li, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Next-generation+porcine+intestinal+organoids:+an+apical-out+organoid+model+for+swine+enteric+virus+infection+and+immune+response+investigations.">Next-generation porcine intestinal organoids: an apical-out organoid model for swine enteric virus infection and immune response investigations.</a> Journal of Virology. 94 (21), 01006-01020 (2020).</li><li>Moon, C., VanDussen, K. L., Miyoshi, H., Stappenbeck, T. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+a+primary+mouse+intestinal+epithelial+cell+monolayer+culture+system+to+evaluate+factors+that+modulate+IgA+transcytosis.">Development of a primary mouse intestinal epithelial cell monolayer culture system to evaluate factors that modulate IgA transcytosis.</a> Mucosal Immunology. 7 (4), 818-828 (2014).</li><li>vander Hee, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optimized+procedures+for+generating+an+enhanced,+near+physiological+2D+culture+system+from+porcine+intestinal+organoids.">Optimized procedures for generating an enhanced, near physiological 2D culture system from porcine intestinal organoids.</a> Stem Cell Research. 28, 165-171 (2018).</li><li>Hoffmann, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intestinal+organoid-based+2D+monolayers+mimic+physiological+and+pathophysiological+properties+of+the+pig+intestine.">Intestinal organoid-based 2D monolayers mimic physiological and pathophysiological properties of the pig intestine.</a> PLoS One. 16 (8), 0256143 (2021).</li><li>Vermeire, B., Gonzalez, L. M., Jansens, R. J. J., Cox, E., Devriendt, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Porcine+small+intestinal+organoids+as+a+model+to+explore+ETEC-host+interactions+in+the+gut.">Porcine small intestinal organoids as a model to explore ETEC-host interactions in the gut.</a> Veterinary Research. 52 (1), 94 (2021).</li><li>Luo, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Utility+evaluation+of+porcine+enteroids+as+PDCoV+infection+model+in+vitro.">Utility evaluation of porcine enteroids as PDCoV infection model in vitro.</a> Frontiers in Microbiology. 11, 821 (2020).</li><li>Resende, T. P., Medida, R. L., Vannucci, F. A., Saqui-Salces, M., Gebhart, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evaluation+of+swine+enteroids+as+in+vitro+models+for+Lawsonia+intracellularis+infection1,2.">Evaluation of swine enteroids as in vitro models for Lawsonia intracellularis infection1,2.</a> Journal of Animal Science. 98 (2), 011 (2020).</li><li>Engevik, A. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Editing+myosin+VB+gene+to+create+porcine+model+of+microvillus+inclusion+disease,+with+microvillus-lined+inclusions+and+alterations+in+sodium+transporters.">Editing myosin VB gene to create porcine model of microvillus inclusion disease, with microvillus-lined inclusions and alterations in sodium transporters.</a> Gastroenterology. 158 (8), 2236-2249 (2020).</li><li>Watanabe, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+ROCK+inhibitor+permits+survival+of+dissociated+human+embryonic+stem+cells.">A ROCK inhibitor permits survival of dissociated human embryonic stem cells.</a> Nature Biotechnology. 25 (6), 681-686 (2007).</li><li>Gracz, A. D., Puthoff, B. J., Magness, S. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification,+isolation,+and+culture+of+intestinal+epithelial+stem+cells+from+murine+intestine.">Identification, isolation, and culture of intestinal epithelial stem cells from murine intestine.</a> Somatic Stem Cells: Methods and Protocols. 879, 89-107 (2012).</li><li>Ferrandis Vila, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dietary+fiber+sources+and+non-starch+polysaccharide-degrading+enzymes+modify+mucin+expression+and+the+immune+profile+of+the+swine+ileum.">Dietary fiber sources and non-starch polysaccharide-degrading enzymes modify mucin expression and the immune profile of the swine ileum.</a> PloS One. 13 (11), 0207196 (2018).</li><li>Li, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=IFN-lambda+3+mediates+antiviral+protection+against+porcine+epidemic+diarrhea+virus+by+inducing+a+distinct+antiviral+transcript+profile+in+porcine+intestinal+epithelia.">IFN-lambda 3 mediates antiviral protection against porcine epidemic diarrhea virus by inducing a distinct antiviral transcript profile in porcine intestinal epithelia.</a> Frontiers in Immunology. 10, 2394 (2019).</li><li>VanDussen, K. L., Sonnek, N. M., Stappenbeck, T. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=L-WRN+conditioned+medium+for+gastrointestinal+epithelial+stem+cell+culture+shows+replicable+batch-to-batch+activity+levels+across+multiple+research+teams.">L-WRN conditioned medium for gastrointestinal epithelial stem cell culture shows replicable batch-to-batch activity levels across multiple research teams.</a> Stem Cell Research. 37, 101430 (2019).</li><li>Sutton, K. M., Orr, B., Hope, J., Jensen, S. R., Vervelde, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Establishment+of+bovine+3D+enteroid-derived+2D+monolayers.">Establishment of bovine 3D enteroid-derived 2D monolayers.</a> Veterinary Research. 53 (1), 15 (2022).</li></ol>

ليس لدى المؤلفين ما يكشفون عنه.

يصف هذا البروتوكول طريقة تستخدم لحفظ الخبايا الظهارية بالتبريد من الأمعاء الصغيرة للتخزين طويل الأجل والثقافة اللاحقة للمواد العضوية 3D. يستخدم هذا البروتوكول محلول تجميد يحتوي على DMSO و FBS ومثبط Y27632 ROCK و DMEM والمضادات الحيوية. حصلت دراسة أخرى أجريت على الخنازير على عضويات من خبايا محفوظة بالتبريد في محلول تجميد مماثل ولكن بدون مثبط ROCK15. تم تضمين مثبط Y27632 ROCK لمنع موت الخلايا المبرمج والحفاظ على تجمع الخلايا الجذعية لأنه بعد ذوبان الجليد ، يتم فصل خلايا القبو الظهارية ، مما قد يؤدي إلى موت الخلايا ("anoikis") 27،28. ومن المثير للاهتمام أنه تم الحصول على الخيول المعوية من الخبايا الظهارية المجمدة في وسط استزراع يحتوي فقط على DMEM و DMSO16. لم يتم اختبار هذه الطريقة البسيطة للخبايا الظهارية الخنازير حتى الآن. تم نشر طرق أخرى لزراعة الكائنات العضوية البشرية والخنازير من الأنسجة المجمدة أو الخزعات بدلا من الخبايا الظهارية 4,17. ميزة هذه الطريقة هي القدرة على حفظ الأنسجة المعوية بالتبريد مباشرة دون إجراء إجراء عزل القبو ، الأمر الذي يتطلب وقتا ومعدات مختبرية. قد يكون هذا مناسبا عندما يتعين جمع الأنسجة بعيدا عن المختبر. ومع ذلك ، عند عزل الخبايا مباشرة بعد الذبح ، يمكن معالجة أجزاء كبيرة من الأمعاء للحصول على عدد كبير جدا من الخبايا ، وهذا ليس هو الحال عند البدء من شظايا الأنسجة الصغيرة المجمدة. بعد ذوبان الخبايا الظهارية ، لوحظت المواد العضوية من 3-4 أيام بعد البذر وانقسامها بعد 10 أيام. هذا معدل نمو أبطأ مما كان عليه عند بدء الاستزراع من الخبايا الظهارية الطازجة ، والتي تم الحصول على المواد العضوية من اليوم الأول بعد البذر ، ويمكن عادة تقسيمها في حوالي اليوم 511. كما أبلغ خليل وآخرون عن تأخر نمو معوية الخنازير عند البدء من الخباياالمجمدة 15 ، مما يشير إلى أن الخلايا الجذعية قد تتطلب وقتا لاستعادة قدرتها على التكاثر. حصلنا أيضا على عدد أقل من المواد العضوية عند البدء من الخبايا المجمدة مقارنة بالخبايا الطازجة ، والتي قد تكون بسبب موت الخلايا الجذعية أثناء عملية التجميد. في بعض محاولات ذوبان الخبايا (<20٪) ، لم نحصل على مواد عضوية من الخبايا المجمدة ، ربما بسبب إجراء الحفظ بالتبريد دون المستوى الأمثل (على سبيل المثال ، تأخر التجميد بعد عزل القبو ربما أكثر من 1 ساعة). وبالتالي ، نوصي بإبقاء الخبايا على الجليد حتى العد ، وتجميدها في أسرع وقت ممكن.
بالنسبة إلى المواد العضوية 3D ، اخترنا استخدام وسيط ثقافة عضوي تجاري مصمم للبشر. في الواقع ، أظهرت التقارير السابقة أن الكائنات العضوية المعوية للخنازير تنمو بكفاءة مع هذه الوسيلة8،11،14،19،25،26،29،30. من المهم أن يكون وسيط الاستزراع هذا جاهزا للاستخدام وأن يكون له تركيز موحد لعوامل النمو داخل الدفعة. ومع ذلك ، فإن هذه الوسيلة الثقافية مكلفة ، وتكوينها غير معلن ، وبالتالي لا يمكن تعديل تكوينها. في المقابل ، قامت دراسات أخرى بزراعة عضويات معوية للخنزير في وسائط مخصصة تحتوي على مثبطات دوائية و / أو عامل نمو مؤتلف و / أو وسائط مشروطة5،6،7،21. على الرغم من أن هذه الطريقة مرنة للغاية وأرخص ، إلا أنها تستغرق وقتا طويلا لإنتاج وسائط مكيفة وقد تفتقر إلى قابلية التكرار بسبب التباين المحتمل في تركيز عوامل النمو في الوسائط المكيفة. وبالتالي ، يجب التحقق من جودة كل دفعة من الوسائط المكيفة عن طريق قياس نمو الأعضاء أو التعبير الجيني للعلامة31.
أظهرت دراسة أن عضويات الخنازير الصائمية المستزرعة في نفس وسط الاستزراع العضوي التجاري المستخدم هنا نمت بشكل أسرع وبدت أقل تمايزا ، مقارنة بالكائنات المعوية المستزرعة بوسائط تحتوي على عامل نمو مؤتلف و / أو وسائط مشروطة23. تسهل الحالة التكاثرية العالية ثقافة المواد العضوية 3D ، ولكنها قد تتطلب إحداث تمايز لتكون أكثر تمثيلا للخصائص الفسيولوجية المعوية. في هذا البروتوكول ، لمرور المواد العضوية 3D ، يتم فصل الخلايا بالكامل للعد ، مما يسمح بالتحكم في عدد الخلايا المصنفة في ECM. هذا يزيد من استنساخ النمط الظاهري للعضويات ، والذي يتأثر بشدة بكثافتها. علاوة على ذلك ، فإن عد الخلايا يتجنب الحصول على ثقافة منخفضة للغاية أو مكتظة ، مما يتطلب تكييف جدول الثقافة. أعدت معظم الدراسات الأخرى شظايا عضوية غير منفصلة تماما إلى خلايا مفردة ، واستخدمت نسبة تخفيف للتمرير. هذه الطريقة أكثر وضوحا ، ولكنها قد تحفز التباين وفقا للكثافة العضوية للثقافة.
بالنسبة للثقافة في الطبقات الأحادية ، يتم زرع الخلايا العضوية في إدخالات الثقافة المغلفة مسبقا بطبقة رقيقة من ECM ، والتي تسمح بربط الخلايا ولكنها تتجنب نمو المواد العضوية في 3D. استخدم هذا البروتوكول الكولاجين من النوع الرابع كبروتين ECM ، كما هو موضح سابقا في الخنازير23. استخدمت دراسات أخرى مع أحاديات عضوية الخنازير نفس ECM المشتق من الورم المستخدم هنا لثقافة المواد العضوية ثلاثية الأبعاد6،8،9،21،25،30. ميزة استخدام الكولاجين هي القدرة على توحيد تركيز البروتين بتركيبة محددة تماما ، وهذا ليس هو الحال في ECM المشتق من الورم. تتمثل إحدى الخطوات الحاسمة لنجاح ثقافة أحاديات الطبقة الخلوية في الانتباه إلى المظهر المرئي للعضويات 3D السلائف ، والتي يجب أن يكون لها حواف محددة جيدا وتجويف فارغ بدون حطام أسود. في الواقع ، المواد العضوية ذات مستوى النضج العالي ومعدل التكاثر المنخفض ليست مصدرا مناسبا للخلايا لثقافة 2D. وبالتالي ، فإن توقيت تفكك المواد العضوية 3D إلى خلايا مفردة أمر بالغ الأهمية لنجاح هذه الخطوة.
تسمح ثقافة 2D monolayers من الخلايا المفردة بتوحيد عدد الخلايا المصنفة ، وهو أمر أكثر صعوبة عند البدء من شظايا عضوية ، كما هو الحال في بعض الطرق الأخرى. لقد زرعنا 7.6 × 10 5 خلايا لكل سم 2 ، وهي نسبة عالية مقارنة بمعظم الدراسات الأخرى 21،22،23 في الخنازير التي استخدمت كثافة خلايا أقل ، تتراوح من 0.25 × 10 5 خلايا لكل سم 2 إلى 1.78 × 10 5 خلايا لكل سم 2. يشكل شرط وجود عدد كبير من الخلايا العضوية قيدا على هذا البروتوكول ، لكنه سمح لنا بالحصول بسرعة على طبقة أحادية متقاربة ، تغطي بالكامل إدراج الثقافة بعد يوم 1. في المقابل ، حصل Vermeire et al.23 على التقاء بعد 4-7 أيام بكثافة أقل من الخلايا المصنفة (من 0.25 × 105 خلايا / سم 2 إلى 0.4 × 105 خلايا / سم2). استخدمت بعض الدراسات أيضا أحاديات الخلايا العضوية للخنزير التي لم تغطي سطح الثقافة بالكامل للعدوى بالفيروسات 8,30. في هذه الظروف ، يمكن الوصول إلى الجانب القمي للخلايا الظهارية للعلاج ، ولكن هناك حاجة إلى طبقات أحادية متقاربة تماما إذا كان الهدف هو دراسة امتصاص المغذيات أو نفاذية الظهارة.
بالنسبة للخلايا العضوية أحادية الطبقة ، تم استخدام وسط استزراع عضوي تجاري مكمل بنسبة 20٪ FBS ، بناء على دراسة حديثة على الطبقات الأحادية المشتقة من الأمعاءالبقري 32. في اختباراتنا، كانت المكملات التي تحتوي على 20٪ FBS ضرورية للحصول على طبقة أحادية متقاربة بالكامل، ربما بسبب متطلبات عامل النمو المرتفع. على العكس من ذلك ، أنشأت دراسات أخرى تستخدم نفس الوسيط التجاري طبقة أحادية بدون FBSإضافي 8،25،30 ، ولكن دون الوصول إلى التقاء كامل. استخدمت دراسات أخرى أيضا مكملات تحتوي على 20٪ FBS في وسط مخصص لثقافة أحاديات الخلايا العضوية للخنزير21,22. في تجاربنا ، يكون TEER مرتفعا بعد يوم واحد من البذر (حوالي 700 Ω سم 2) ، ويظل مرتفعا حتى اليوم الثالث (حوالي 1500 Ω سم2 ؛ وهذا يتوافق مع تكوين تقاطعات ضيقة ، كما يتضح من تعبير الإطباق. حصل Van der Hee et al. على قيم TEER مماثلة تزيد عن 72 ساعة لأحاديات الطبقة أحادية الخلايا العضوية الصائمية21. كما أظهروا أنه يمكن الحفاظ على الطبقات الأحادية حتى اليوم 12-15 مع تغييرات الوسائط اليومية. في المقابل ، أبلغت دراسات أخرى عن قيم TEER أقل بكثير (حوالي 200 Ω · سم2) للطبقة الأحادية للخلايا العضويةالخنازير 6,22. قد تكون هذه الاختلافات بين الدراسات مرتبطة بجزء القناة الهضمية الذي تمت دراسته أو بالوسائط المستخدمة التي تؤثر على التمايز الظهاري.
في الختام ، فإن البروتوكول أعلاه لزراعة عضويات 3D المعوية للخنزير من الخبايا الظهارية المجمدة يسهل تنظيم عمل الثقافة. يقلل من الحاجة إلى الحصول على الأنسجة الطازجة من الحيوانات الحية. نوضح أيضا كيفية إنشاء أحاديات الخلايا المتقاربة بالكامل المشتقة من عضويات الخنازير في أقل من 3 أيام. وبالتالي ، يمكن أن تكون بروتوكولاتنا موارد مفيدة للعلماء الذين يدرسون ظهارة معوية الخنازير للبحوث البيطرية أو الطبية الحيوية.

تتكون ظهارة الأمعاء من طبقة أحادية من الخلايا تغطي الغشاء المخاطي الهضمي عند الواجهة مع البيئة اللمعية. يرتبط هذا الوضع بوظائف متنوعة ، مثل امتصاص المغذيات ووظيفة الحاجز الواقي ، والتي يدعمها وجود الخلايا الجذعية وأنواع الخلايا الظهارية المتمايزة المتعددة (الخلايا الامتصاصية ، والغدد الصماء المعوية ، والبانيث ، والكأس)1. خطوط الخلايا الخالدة المستخدمة تقليديا لدراسة الخلايا الظهارية لها قيود كبيرة ، لأنها لا تعكس التعقيد الخلوي للظهارة المعوية وتقدم تشوهات جينومية2. قدم تطوير المواد العضوية ثلاثية الأبعاد (3D) بواسطة Sato et al.3 نموذجا جديدا لدراسة ظهارة الأمعاء ذات الصلة الفسيولوجية المحسنة. في الواقع ، تستمد الكائنات العضوية المعوية من الخلايا الجذعية غير المحولة ، وتتكون من أنواع متعددة من الخلايا ، وتلخص وظائف ظهارة الأمعاء. يتم استخدام الكائنات العضوية المعوية بشكل متزايد لفهم تطور ووظائف ظهارة الأمعاء وتفاعلاتها مع مسببات الأمراض والمواد المغذية والسموم والأدوية والميكروبات ومستقلباتها2.
تم تطوير الطرق المستخدمة في زراعة الكائنات العضوية المعوية في البداية للبشر والفئران ، وقد تم تكييفها مؤخرا مع الأنواع الأخرى ، بما في ذلك الخنازير4. كان Gonzales et al.5 أول من استزرع عضويات الخنازير من الصائم. منذ ذلك الحين ، تم وصف عضويات الخنازير لقطاعات الأمعاء الأخرى (الاثني عشر ، الدقاق ، والقولون) 6،7،8 ، وقد ثبت أنها تحتفظ بالنمط الظاهري الخاص بالموقع9،10،11. تستخدم الآن عضويات 3D المعوية للخنزير بشكل شائع لدراسة تأثير العناصر الغذائية12,13 أو الالتهابات المعوية 6,8,14.
وصفت معظم الدراسات ثقافة الكائنات العضوية المعوية بدءا من الخبايا الظهارية المعزولة حديثا. ومع ذلك ، فإن هذا ليس ممكنا دائما لأسباب لوجستية ، لا سيما عند العمل مع الحيوانات الكبيرة مثل الخنازير. في الواقع ، يمكن أن تكون المرافق الحيوانية للخنازير بعيدة عن المختبر حيث يتم استزراع المواد العضوية ، مما يعقد تنظيم العمل. علاوة على ذلك ، فإن الثقافة العضوية تستغرق وقتا طويلا. وبالتالي ، ليس من العملي زراعة خطوط عضوية متعددة في وقت واحد ، على سبيل المثال ، من قطاعات أمعاء مختلفة أو عدة. للتحايل على هذه المشكلات ، وصفت بعض الدراسات التي أجريت على البشر والخيول والخنازير طرقا لزراعة المواد العضوية من الأنسجة المعوية المجمدة (أو الخزعات) أو من الخبايا الظهارية المعزولة4،15،16،17. تسمح هذه الطرق بالحفظ بالتبريد للخلايا الجذعية الظهارية المعوية من أجزاء أمعاء متعددة لحيوان واحد ، والتي يمكن استخدامها بعد ذلك لزراعة المواد العضوية عند الحاجة. علاوة على ذلك ، يسمح هذا بانخفاض قوي في عدد الحيوانات الحية المستخدمة كمتبرعين للخلايا الجذعية ، حيث يمكن إنشاء مخزونات كبيرة من الخبايا المحفوظة بالتبريد (مبادئ 3R). ميزة أخرى لهذه الطريقة هي نمو الكائنات العضوية المعوية فقط من الحيوانات ذات الأهمية بعد الحصول على نتائج النمط الظاهري أو الوراثي ، وهو فعال للغاية من حيث التكلفة.
في الجسم الحي ، تستقطب الخلايا الظهارية المعوية ، مع توجيه الجانب القمي نحو التجويف. في المختبر ، في المواد العضوية ثلاثية الأبعاد ، يواجه الجانب القمي للخلايا الظهارية أيضا التجويف (أي داخل المواد العضوية)4. تمنع هذه المنظمة الوصول إلى الجانب القمي ، وهي مشكلة عند دراسة تأثيرات المكونات اللمعية (مثل العناصر الغذائية والميكروبات والمستقلبات) على الخلايا الظهارية. للتحايل على هذا العيب ، تم تطوير عدة طرق ، مثل زراعة الخلايا العضوية كطبقة أحادية 2D ، والحقن المجهري ، وانعكاس القطبية ("المواد العضوية القمية")18,19. تظهر ثقافة الخلايا العضوية أحادية الطبقات باعتبارها النظام الأكثر كفاءة وقابلية للتتبع. المبدأ هو فصل المواد العضوية 3D إلى خلايا مفردة وزرعها على وعاء زراعة الخلايا المغلفة مسبقا بطبقة رقيقة من المصفوفة خارج الخلية (ECM) 20. في ظروف الاستزراع هذه ، يكون الجانب القمي للخلايا الظهارية متجها لأعلى ، وبالتالي يمكن الوصول إليه من خلال العلاجات التجريبية20. تم تكييف ثقافة أحاديات الخلايا العضوية مؤخرا لأمعاء الخنزير21,22. تم استخدام أحاديات الخلايا المشتقة من عضويات الخنازير ثلاثية الأبعاد لتطبيقات متعددة ، بما في ذلك دراسة الالتهابات المعوية6،23،24،25 ، ونقل العناصر الغذائية9 ، ونمذجة أمراض الجهاز الهضمي 26.
هنا ، تقدم هذه الدراسة أولا بروتوكولا مفصلا لثقافة وصيانة عضويات 3D المعوية للخنازير المشتقة من الخبايا الظهارية المحفوظة بالتبريد (الشكل 1). ثم ، يتم وصف بروتوكول لإنشاء أحاديات الخلايا من عضويات 3D المعوية الخنازير. توفر الطرق الموصوفة هنا أدوات تجريبية يمكن استخدامها لدراسة ظهارة معوية الخنازير لنقل المغذيات ، ووظيفة الحاجز ، والتفاعلات بين الكائنات الحية الدقيقة والمضيف.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>0.5 M EDTA, pH 8.0</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>AM9260G</td>
			<td>Store at room temperature.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>15 mL conical tube</td>
			<td>Sarstedt</td>
			<td>62.554.502</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>24-well cell culture plate </td>
			<td>Corning</td>
			<td>003526</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>48-well cell culture plate </td>
			<td>Corning</td>
			<td>003548</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 mL polypropylene conical tube</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>352070</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine Serum Albumine (BSA)</td>
			<td>Euromedex</td>
			<td>A6003</td>
			<td>Store at 4 &#176;C.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge Universal 320 R</td>
			<td>Hettich</td>
			<td>1406</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagene type IV from human placenta</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>C5533</td>
			<td>Prepare the stock solution at 1 mg/mL in acetic acid according to the manufacturer&#39;s recommendation. Aliquot (500 &#181;L) and store at -20 &#176;C. </td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CoolCell LX Cell Freezing Container</td>
			<td>Corning</td>
			<td>432003</td>
			<td>Used to cryopreserve crypts and organoids. </td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Countess 3 Automated Cell Counter</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>16842556</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Coverslips, 22 mm x 50 mm</td>
			<td>VWR</td>
			<td>630-1845</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cryotube ClearLine 1 mL</td>
			<td>Clear line </td>
			<td>390706</td>
			<td>Used to cryopreserve crypts and organoids. </td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DAPI</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>D1306</td>
			<td>Prepare the stock solution at 5 mg/mL in water according to the manufacturer's recommendation. Aliquot (20 &#181;L) and store at -20 &#176;C </td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dithiothreitol (DTT) </td>
			<td>Merck</td>
			<td>10197777001</td>
			<td>Store at 4 &#176;C.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM, high glucose, GlutaMAX Supplement, pyruvate</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>31966047</td>
			<td>Store at 4 &#176;C.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMSO (Dimethyl Sulfoxide)</td>
			<td>Corning</td>
			<td>25-950-CQC</td>
			<td>Store at room temperature.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Epredia Superfrost Plus Adhesion microscopic slide</td>
			<td>VWR</td>
			<td>631-9483 </td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum (FBS)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>10270-106</td>
			<td>Store 5 mL aliquots at -20 &#176;C.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fisherbrand Sterile Cell Strainers</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>22363549</td>
			<td>Used for crypt isolation. </td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fixed Tilt 3D Platform Rotator </td>
			<td>VWR</td>
			<td> 97025-564 </td>
			<td>Used for incubations in the immunostaining protocol. </td>
		</tr>
		
		<tr>
			<td>Gibco PBS, pH 7.4</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>10010015</td>
			<td>Store at 4 &#176;C.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gibco TrypLE Express Enzyme (1x), phenol red</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>12605-010</td>
			<td>Enzyme dissociation reagent. Store at room temperature.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat anti-rabbit IgG, Alexa fluor 488</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>A-11008</td>
			<td>Secondary antibody. Store at 4 &#176;C. Working dilution 1:1000. </td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IntestiCult Organoid Growth Medium (Human)</td>
			<td>Stem Cell Technology</td>
			<td>6010</td>
			<td>Organoid culture medium. Store at -20 &#176;C. Thaw the basal medium and organoid supplement at room temperature and mix (1:1). Store the mix at 4 &#176;C for up to 1 week. </td>
		</tr>
	
	<tr>
			<td>Insert with PET membrane transparent Falcon for plate 24 wells</td>
			<td>Corning</td>
			<td>353095</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Inverted microscope</td>
			<td>Nikon</td>
			<td> Eclipse TS2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Matrigel Basement Membrane Matrix</td>
			<td>Corning</td>
			<td>354234</td>
			<td>Tumor-derived extracellular matrix used for the 3D culture of organoids. Matrigel polymerizes at room temperature. Use cooled tips to pipet the Matrigel. Prepare 500 &#181;L aliquots and store at -20 &#176;C.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mounting medium for fluorescence with DAPI</td>
			<td>Vectashield</td>
			<td>H1250</td>
			<td>
Store at 4 &#176;C.
</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Occludin polyclonal antibody</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>71-1500</td>
			<td>Primary antibody. Store at -20 &#176;C. Working dilution 1:200. </td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde 32%</td>
			<td>Electron microscopy science</td>
			<td>15714</td>
			<td>Prepare 4% paraformaldehyde (PFA) solution under chemical hood by adding 5 mL of 32% PFA to 35 mL of PBS. Aliquot by 10 mL and store at -20 &#176;C.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-Streptomycin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P4333</td>
			<td>Antibacterial. Store 5 mL aliquots at -20 &#176;C.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phalloidin TRITC</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P1951</td>
			<td>Probe for actin staining. 1 mg/mL stock solution. Store at 4 &#176;C.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Primocin</td>
			<td>InvivoGen</td>
			<td>ant-pm-05</td>
			<td>Antimicrobial agent for primary cells acting on bacteria, mycoplasma and fungi. Store at -20 &#176;C.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ROCK Inhibitor (Y27632)</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>ACS-3030</td>
			<td>Used to maintain the stem cells. Prepare the stock solution at 10 mM in sterile water according to the manufacturer&#39;s recommendation and store aliquots (50 &#181;L) at -20 &#176;C.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rotating shaker mix XL</td>
			<td>Clear line </td>
			<td>062646CL</td>
			<td>Used for crypt isolation. </td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stripette Serological Pipets 10 mL</td>
			<td>Corning</td>
			<td>4488</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue Culture Dish </td>
			<td>TPP</td>
			<td>93100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X100</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>8787</td>
			<td>Store at room temperature.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypan Blue stain 0.4% </td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>T10282</td>
			<td>Store at room temperature.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vacuum system Vacusip</td>
			<td>Integra</td>
			<td>159000</td>
			<td>Used to remove the medium of organoid wells. </td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

culture of piglet intestinal 3d organoids from cryopreserved epithelial crypts and establishment of cell monolayers

يتم استخدام الكائنات العضوية المعوية بشكل متزايد لدراسة ظهارة الأمعاء لنمذجة أمراض الجهاز الهضمي ، أو للتحقيق في التفاعلات مع الأدوية والمغذيات والمستقلبات ومسببات الأمراض والميكروبات. تتوفر الآن طرق لاستزراع العضويات المعوية لأنواع متعددة ، بما في ذلك الخنازير ، وهو نوع ذو أهمية كبيرة كحيوان مزرعة وكنموذج متعدي للبشر ، على سبيل المثال ، لدراسة الأمراض الحيوانية المنشأ. هنا ، نقدم وصفا متعمقا لإجراء يستخدم لثقافة عضويات 3D المعوية للخنزير من الخبايا الظهارية المجمدة. يصف البروتوكول كيفية حفظ الخبايا الظهارية بالتبريد من أمعاء الخنزير والإجراءات اللاحقة لثقافة المواد العضوية المعوية 3D. المزايا الرئيسية لهذه الطريقة هي (i) التفكك الزمني لعزل الخبايا من ثقافة المواد العضوية 3D ، (ii) إعداد مخزونات كبيرة من الخبايا المحفوظة بالتبريد المشتقة من شرائح معوية متعددة ومن عدة في وقت واحد ، وبالتالي (iii) تقليل الحاجة إلى أخذ عينات من الأنسجة الطازجة من الحيوانات الحية. نقوم أيضا بتفصيل بروتوكول لإنشاء طبقة أحادية الخلية مشتقة من عضويات 3D للسماح بالوصول إلى الجانب القمي للخلايا الظهارية ، وهو موقع التفاعلات مع العناصر الغذائية أو الميكروبات أو الأدوية. بشكل عام ، تعد البروتوكولات الموضحة هنا موردا مفيدا لدراسة ظهارة معوية الخنازير في البحوث البيطرية والطبية الحيوية.

باتباع البروتوكول الموضح أعلاه ، يتم الحصول على الخبايا الظهارية من أمعاء الخنزير وحفظها بالتبريد للتخزين طويل الأجل في النيتروجين السائل (الشكل 1 والشكل 2 أ). بعد الذوبان ، يتم زرع الخلايا الجذعية القبو في ECM (الشكل 2B). عادة ما يتم فقد بنية القبو بعد هذه الخطوة ، بسبب تفكك بنية القبو في ECM. يمكن ملاحظة الكائنات العضوية في غضون 3-4 أيام ، ثم تنمو بسرعة وتطور الهياكل الناشئة (الشكل 2 ب). لقد نجحنا في الحصول على المواد العضوية بعد إذابة الخبايا المجمدة في >80٪ من المحاولات. بعد حوالي 10 أيام من ذوبان الجليد (وفقا لمعدل نمو المواد العضوية) ، يتم إجراء مرور من المواد العضوية لتوسيع الثقافة (الشكل 3). تنمو الكائنات العضوية بشكل أسرع بعد الانقسام ، وتقدم مورفولوجيات متنوعة ، مع بعض الكيسي وغالبية الكائنات العضوية الناشئة. من أجل الصيانة المثلى للثقافة ، يجب أن تقدم الكائنات العضوية المستخدمة للمرور تجويفا واضحا وفارغا وحواف محددة جيدا (أمثلة تشير إليها الأسهم الخضراء) مع عدم وجود حطام أسود في التجويف (يشار إليه بالأسهم الحمراء) ، كما لوحظ في الكائنات العضوية الناضجة (الشكل 3). وجدنا أن حطام الخلايا السوداء يبدأ في التراكم في حوالي اليوم 6 بعد المرور. وبالتالي ، يوصى بتقسيم أو تجميد المواد العضوية في اليوم 4-5 بعد المرور.
مرحلة نضج المواد العضوية هي أيضا نقطة مهمة في الحصول على أحاديات الطبقة الخلوية. المواد العضوية ذات النضج المتقدم (المشار إليها بوجود حطام الخلايا السوداء في التجويف) ليست مثالية للبذور أحادية الطبقة. عادة ما نفصل المواد العضوية ثلاثية الأبعاد بعد 4 أيام من المرور لجمع الخلايا لثقافة 2D. هناك حاجة إلى ما يقرب من بئر إلى ثلاثة آبار من المواد العضوية ثلاثية الأبعاد المزروعة في 3000 خلية لكل قبة 50 ميكرولتر من ECM لبذر ملحق مزرعة واحد مع 2.5 × 105 خلايا. تلتصق الخلايا وتشكل طبقة أحادية متقاربة بالكامل في غضون يوم واحد (الشكل 4 أ) ، وهو ما يؤكده ارتفاع TEER البالغ حوالي 700 Ω سم2 (الشكل 4 ب). ومع ذلك ، يصعب تصور حواف الخلية بواسطة الفحص المجهري برايت فيلد في هذه النقطة الزمنية المبكرة ، ربما بسبب انخفاض مستوى التمايز. يظل TEER مرتفعا لمدة 3 أيام (الشكل 4B).
يشير تلطيخ الأكتين إلى أن الجانب القمي للخلايا الظهارية موجه نحو التجويف في الكائنات العضوية ثلاثية الأبعاد (الشكل 5 أ). تشكل الخلايا العضوية المصنفة في ملحق المستزرع طبقة مفردة متقاربة من الخلايا الظهارية ، مع توجيه الجانب القمي نحو الجزء العلوي (الشكل 4B ، C). يكشف تلطيخ Occludin عن وجود تقاطعات ضيقة في الجانب القمي للخلايا الظهارية في المواد العضوية 3D وفي أحاديات الخلية (الشكل 5A-C).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64917/64917fig01.jpg"> الشكل 1: تمثيل تخطيطي للطرق المستخدمة لاستزراع المواد العضوية ثلاثية الأبعاد وأحاديات الخلايا المشتقة من الكائنات العضوية. يتم عزل الخبايا الظهارية من الأمعاء الخنازير. يمكن استخدام هذه الخبايا على الفور لثقافة 3D organoids أو ii) تجميدها وتخزينها في بنك حيوي في النيتروجين السائل. يمكن إذابة الخبايا المحفوظة بالتبريد واستخدامها لثقافة المواد العضوية 3D. يمكن الحفاظ على ثقافة 3D العضوية مع تقسيم متتالي ، أو تجميدها وتخزينها في البنك الحيوي. يمكن الحصول على أحاديات الخلية من ثقافة 3D العضوية للسماح بالوصول إلى الجانب القمي للخلايا ودراسة وظيفة الحاجز الظهاري. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64917/64917fig01large.jpg" target="_blank">يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64917/64917fig02v2.jpg"> الشكل 2: ثقافة عضويات 3D معوية الخنازير من الخبايا الظهارية المحفوظة بالتبريد. (أ) صورة مجهرية تمثيلية لأقبية صائمية معزولة حديثا. (ب) صور مجهرية تمثيلية لعضويات 3D تم الحصول عليها بعد ذوبان الخبايا الصائمية. تم استزراع المواد العضوية في قبة 25 ميكرولتر من ECM في لوحة 48 بئر. يوضح الشكل صورا للعضويات ثلاثية الأبعاد في 4 و 7 و 8 و 9 و 10 أيام بعد البذر. يمثل شريط المقياس 500 ميكرومتر. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64917/64917fig02large.jpg" target="_blank">يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64917/64917fig03v2.jpg"> الشكل 3: مورفولوجيا الكائنات العضوية ثلاثية الأبعاد المعوية للخنزير المشتقة من الخبايا الظهارية المحفوظة بالتبريد بعد المقطع الأول. صور مجهرية تمثيلية تظهر تطور المواد العضوية المشتقة من أقبية الصائم المحفوظة بالتبريد بعد المقطع الأول من اليوم 4 إلى اليوم 7. تشير الأسهم الخضراء إلى عضويات واضحة مناسبة لمرور أو بذر الطبقات الأحادية. تشير الأسهم الحمراء إلى المواد العضوية الناضجة غير المناسبة لتقسيم أو بذر الطبقات الأحادية ؛ وبالتالي ، يجب استخدام الآبار قبل ظهور هذا المورفولوجيا. يمثل شريط المقياس 500 ميكرومتر. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64917/64917fig03large.jpg" target="_blank">يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64917/64917fig04v2.jpg"> الشكل 4: خصائص الخلايا أحادية الطبقات المشتقة من عضويات 3D المعوية الخنازير . (أ) صور مجهرية تمثيلية لمورفولوجيا أحادية الطبقة على مدار 3 أيام. تم زرع الخلايا العضوية الصائمية عند 2.5 × 105 خلايا في 0.33 سم2 إدراج زراعة الخلايا المغلفة بالكولاجين الرابع عند 50 نانوغرام / مل. يمثل شريط المقياس 500 ميكرومتر. (ب) المقاومة الكهربائية عبر الظهارة (TEER) للطبقات أحادية الخلية العضوية على مدار 3 أيام. تتوافق النقاط المتصلة بخط مع نفس البئر في أوقات مختلفة. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64917/64917fig04large.jpg" target="_blank">يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64917/64917fig05v2.jpg"> الشكل 5: تصوير عضويات الصائم الخنازير المستزرعة في 3D أو 2D. التصوير المجهري متحد البؤر ل (A) 3D organoids بعد 5 أيام من الانقسام و (B ، C) أحادي الطبقة العضوية للخلايا العضوية بعد 3 أيام من البذر (B: قسم XZ ؛ C: قسم XY). كان الحمض النووي (الأزرق) ملطخا ب DAPI. الأكتين (الأحمر) كان ملطخا بالقضيب. كان Occludin (الأخضر) ملطخا بجسم مضاد متعدد النسيلة. تشير الأسهم البيضاء إلى occludin المترجمة عند التقاطع الضيق. يمثل شريط المقياس 20 ميكرومتر. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64917/64917fig05large.jpg" target="_blank">يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Culture of Piglet Intestinal 3D Organoids from Cryopreserved Epithelial Crypts and Establishment of Cell Monolayers at JoVE.com

Culture of Piglet Intestinal 3D Organoids from Cryopreserved Epithelial Crypts and Establishment of Cell Monolayers

هنا ، وصفنا بروتوكولا لثقافة الخنازير المعوية 3D organoids من الخبايا الظهارية المحفوظة بالتبريد. نحن أيضا وصف طريقة لإنشاء أحادي الخلية المستمدة من المواد العضوية 3D ، مما يسمح بالوصول إلى الجانب القمي للخلايا الظهارية.

ثقافة الخنازير المعوية 3D العضوية من الخبايا الظهارية المحفوظة بالتبريد وإنشاء أحاديات الخلية

Intestinal organoids are increasingly being used to study the gut epithelium for digestive disease modeling, or to investigate interactions with drugs, ...

يوفر بروتوكولنا أدوات لدراسة ظهارة معوية الخنازير للبحوث البيطرية والطبية الحيوية. يمكن استخدام العضويات المعوية من الخنازير لدراسة نقل المغذيات ، ووظيفة الحاجز ، والتفاعلات بين المضيف والميكروب. من خلال الحفاظ على الخبايا الظهارية المعوية الخنازير تسمح بإنشاء مخزون كبير من الخلايا الجذعية التي يمكن استخدامها لاحقا لثقافة العضوية في 3D أو 2D أحادي الطبقات.هذا البروتوكول مفصل للصائم ، ولكن يمكن استخدامه أيضا لقطاعات معوية أخرى مثل الاثني عشر والدقاق والقولون. للبدء ، قم بإذابة قارورة تحتوي على 900 سرداب مجمد بسرعة في حمام مائي عند 37 درجة مئوية. انقل محلول القبو إلى أنبوب مخروطي سعة 15 ملليلتر.أجهزة الطرد المركزي في 300 × غرام لمدة خمس دقائق في درجة حرارة الغرفة وإزالة طاف. أضف 150 ميكرولترا من المصفوفة خارج الخلية أو ECM بطرف مبرد للحصول على تركيز نهائي قدره 150 سرداب لكل 25 ميكرولتر من ECM. ماصة صعودا وهبوطا 10 مرات للحصول على تعليق متجانس من الخبايا في ECM.قم ببذر ستة آبار بانخفاض 25 ميكرولتر لكل بئر في صفيحة 48 بئرا تم تسخينها مسبقا. احتضان لمدة 30 دقيقة عند 37 درجة مئوية و 5 ٪ ثاني أكسيد الكربون لبلمرة ECM. أضف 250 ميكرولتر لكل بئر من الاستزراع المتوسط في درجة حرارة الغرفة واحتضانها عند 37 درجة مئوية و 5٪ ثاني أكسيد الكربون.قم بتغيير وسط الثقافة كل يومين إلى ثلاثة أيام. لتمرير المواد العضوية ثلاثية الأبعاد المشتقة من الخبايا المجمدة بعد 10 أيام من البذر ، قم بإزالة وسائط الاستزراع وإضافة 250 ميكرولتر من PBS المسخن مسبقا عند 37 درجة مئوية. بعد الحضانة ، استبدل PBS ب 250 ميكرولتر من كاشف تفكك الإنزيم قبل التسخين المكمل بمثبط صخور 10 ميكرومولار عند 37 درجة مئوية في كل بئر.افصل المواد العضوية في ECM عن طريق الكشط باستخدام ماصة P-1000 وتجانسها بعناية عن طريق سحب خمس مرات. احتضان لمدة خمس دقائق عند 37 درجة مئوية و 5٪ ثاني أكسيد الكربون قبل فصل الخلايا عن طريق سحب الماصة لأعلى ولأسفل 10 مرات. أضف 500 ميكرولتر من DMEMc في كل بئر يحتوي على خلايا منفصلة واسحب ما يصل إلى 12 بئرا في أنبوب مخروطي سعة 15 ملليلتر يحتوي على ثلاثة ملليلتر من DMEMc البارد.أجهزة الطرد المركزي عند 500 × ز لمدة خمس دقائق عند أربع درجات مئوية. تخلص من المادة الطافية وأعد تعليق الحبيبات في ملليلتر واحد بارد DMEMc. عد الخلايا بتخفيف واحد إلى اثنين باللون الأزرق المثقب باستخدام عداد خلية.أجهزة الطرد المركزي الحجم اللازم لمحلول الخلية للحصول على 3000 خلية حية لكل قبة. أعد تعليق الحبيبات ب 17 ميكرولترا من DMEMc البارد لكل 3000 خلية حية على الجليد. اضبط مستوى الصوت على العدد المطلوب من الآبار.أضف ببطء 33 ميكرولترا من ECM البارد لكل 3000 خلية حية. اضبط مستوى الصوت على العدد المطلوب من الآبار وتجانسها دون عمل فقاعات. ثم انظر الآبار التي تحتوي على 50 ميكرولترا من تعليق خلية ECM لكل بئر في صفيحة 24 بئرا تم تسخينها مسبقا واحتضانها لمدة 30 دقيقة لبلمرة ECM.أضف 500 ميكرولتر من وسط الاستزراع لكل بئر. ثم احتضان وتغيير وسط الثقافة كل يومين إلى ثلاثة أيام. لطلاء ملحق الثقافة ، قم بإعداد محلول الطلاء الذي يحتوي على الكولاجين الوريدي المخفف عند 50 ميكروغرام لكل ملليلتر في برنامج تلفزيوني بارد.أضف 150 ميكرولترا من محلول الطلاء المخفف إلى كل إدراج لثقافة الخلية واحتضانها طوال الليل أو لمدة ثلاث ساعات. بعد خمسة أيام من الانقسام ، افصل المواد العضوية باستخدام ECM عن طريق كشطها باستخدام ماصة P-1000. يتم تجانسها بعناية عن طريق السحب في وسط الاستزراع ونقلها إلى أنبوب مخروطي سعة 15 ملليلتر يحتوي على خمسة ملليلتر من DMEMc البارد على الجليد.أجهزة الطرد المركزي المواد العضوية التي تم جمعها عند 500 × جم لمدة خمس دقائق عند أربع درجات مئوية. قم بشفط المادة الطافية بعناية وأعد تعليق حبيبات الخلية في ملليلتر واحد من كاشف تفكك الإنزيم الذي تم تسخينه مسبقا والمكمل بمثبط 10 ميكرومولار ROCK. ماصة صعودا وهبوطا 10 مرات لبدء تفكك المواد العضوية.احتضان لمدة خمس دقائق في حمام مائي 37 درجة مئوية للهضم الأنزيمي. قم بتعطيل المواد العضوية ميكانيكيا عن طريق سحب 10 مرات وإضافة أربعة ملليلتر من الثلج البارد DMEMc. أجهزة الطرد المركزي وتجاهل المادة الطافية قبل تعليق حبيبات الخلايا العضوية في ملليلتر واحد من DMEMc.عد الخلايا باللون الأزرق المثقب باستخدام عداد الخلية واحسب الحجم اللازم للبذر 2.5 في 10 إلى الخلايا الخامسة لكل إدراج مزرعة. أجهزة الطرد المركزي الحجم اللازم لتعليق الخلية المقابلة ل 2.5 مرة 10 من الخلايا الخامسة لكل إدراج ثقافة. أثناء الطرد المركزي ، قم باستنشاق محلول الطلاء بعناية من إدخالات الثقافة واتركه يجف تحت الغطاء بدون غطاء لمدة خمس دقائق.بعد الطرد المركزي ، تخلص من المادة الطافية وأعد تعليق الحبيبات بالحجم اللازم من الوسط 2D المكمل بمثبط 10 ميكرومولار ROCK. بذر 200 ميكرولتر من تعليق الخلية على الغشاء القابل للنفاذ المطلي. أضف 500 ميكرولتر من الوسط 2D المكمل بمثبط 10 ميكرومولار ROCK إلى المقصورة السفلية واحتضانها.يجب ملاحظة كثافة عالية من الخلايا على الغشاء. بعد يوم واحد من البذر ، استبدل الوسائط الملحمية والقاعدية بوسائط 2D جديدة بدون مثبط ROCK. قم بتغيير الوسائط كل يوم.تصبح الطبقة الأحادية متقاربة بعد يوم واحد من البذر ويمكن استخدامها في تجاربها. في هذه الدراسة ، تم الحصول على الخبايا الظهارية من أمعاء الخنزير وحفظها بالتبريد للتخزين طويل الأجل في النيتروجين السائل. بعد ذوبان الجليد ، تم زرع الخلايا الجذعية القبو في ECM.لوحظت الكائنات العضوية في غضون ثلاثة إلى أربعة أيام ونمت بسرعة وطورت هياكل ناشئة. بعد حوالي 10 أيام من ذوبان الجليد ، تم إجراء مرور المواد العضوية لتوسيع الثقافة. من أجل الصيانة المثلى للثقافة ، يجب أن تقدم الكائنات العضوية المستخدمة في التعبئة تجويفا واضحا وفارغا وحواف محددة جيدا مع عدم وجود حطام أسود في التجويف كما لوحظ في الكائنات العضوية الناضجة.تلتصق الخلايا وتشكل طبقة أحادية متقاربة بالكامل في غضون يوم واحد وهو ما تؤكده المقاومة الكهربائية العالية عبر الظهارة ، أو TEER ، التي تبلغ حوالي 700 قبة سنتيمتر مربع. يظل TEER مرتفعا لمدة ثلاثة أيام. يشير تلطيخ الأكتين إلى أن الجانب القمي للخلايا الظهارية موجه نحو التجويف في الكائنات العضوية 3D.تشكل الخلايا العضوية المصنفة في حشوات المستنبتة طبقة مفردة متقاربة من الخلايا الظهارية مع توجيه الجانب القمي نحو الجزء العلوي. يكشف تلطيخ Occludin عن وجود تقاطعات ضيقة في الجانب القمي للخلايا الظهارية في المواد العضوية 3D وفي أحاديات الطبقة الخلوية. من المهم أن نتذكر أن العضو المستخدم في زرع أحاديات الخلايا يجب أن يبدو واضحا مع تجويف فارغ بدون حطام أسود يتوافق مع تراكم الخلايا الميتة.يمكن استخدام الطبقات الأحادية من العضو العضوي المعوي للخنزير لاختبار تأثيرات المستقلبات أو الميكروبات على وظيفة الحاجز الظهاري باستخدام المقايسات الوظيفية والتصوير وتحليل التعبير الجيني.

Research

JoVE Journal

Biology

Mucociliary Epithelial Organoids from Xenopus Embryonic Cells: Generation, Culture and High-Resolution Live Imaging

العضويات الظهارية المخاطية من الخلايا الجنينية زينوبوس: التوليد والثقافة والتصوير الحي عالي الدقة

Mucociliary epithelium provides the first line of defense by removing foreign particles through the action of mucus production and cilia-mediated ...

3D Culturing of Organoids from the Intestinal Villi Epithelium Undergoing Dedifferentiation

3D زراعة الأجهزة العضوية من ظهارة سيلي المعوية التي تخضع للتمايز

Clonogenicity of organoids from the intestinal epithelium is attributed to the presence of stem cells therein. The mouse small intestinal epithelium is ...

Generation of Murine Primary Colon Epithelial Monolayers from Intestinal Crypts

جيل من المورين الأولي القولون الظهارية Monolayers من سرداب الأمعاء

The intestinal epithelium is comprised of a single layer of cells that act as a barrier between the gut lumen and the interior of the body. Disruption in ...

Establishment and Genetic Manipulation of Murine Hepatocyte Organoids

إنشاء والتلاعب الجيني من الأورجانويدات مورين الكبدية

The liver is the largest organ in mammals. It plays an important role in glucose storage, protein secretion, metabolism and detoxification. As the ...

A High-Throughput Platform for Culture and 3D Imaging of Organoids

منصة عالية الإنتاجية للثقافة والتصوير 3D من المواد العضوية

The characterization of a large number of three-dimensional (3D) organotypic cultures (organoids) at different resolution scales is currently limited by ...

Establishing 3D Endometrial Organoids from the Mouse Uterus

إنشاء عضويات بطانة الرحم 3D من رحم الفأر

Endometrial tissue lines the inner cavity of the uterus and is under the cyclical control of estrogen and progesterone. It is a tissue that is composed of ...

3D Culture of Organoids from Murine Intestinal Crypts and Single Stem Cell

The 3D Culturing of Organoids from Murine Intestinal Crypts and a Single Stem Cell for Organoid Research

The 3D Culturing of Organoids from Murine Intestinal Crypts and a Single Stem Cell for Organoid Research (Video) | JoVE 

زراعة 3D من المواد العضوية من خبايا الفئران المعوية وخلية جذعية واحدة للبحوث العضوية

At present, organoid culture represents an important tool for in vitro studies of different biological aspects and diseases in different organs. Murine ...

Epithelial Effects of Intestinal Inflammation on Established Murine Colonoids

Studying the Epithelial Effects of Intestinal Inflammation In Vitro on Established Murine Colonoids

Studying the Epithelial Effects of Intestinal Inflammation In Vitro on Established Murine Colonoids (Video) | JoVE 

دراسة التأثيرات الظهارية للالتهاب المعوي في المختبر على القولون الفئران الراسخ

The intestinal epithelium plays an essential role in human health, providing a barrier between the host and the external environment. This highly dynamic ...